专利名称：鸡新城疫、鸡传染性支气管炎二联活疫苗耐热保护剂及其制备工艺的制作方法冻干保护剂及其制备工艺是活疫苗生产中的一项关键技术，对疫苗的保存、运输和使用有很大影响。目前，在我国兽用疫苗中，活冻干疫苗占相当大的比例，国内常用的保护剂主要为牛奶，蔗糖、明胶等，其组方简单，对疫苗的保护功能差。采用这些传统的保护剂冻干的疫苗，通常要求制品保存在_15°C以下，这给生产厂家及使用者造成很大的不便，是疫苗的长期保存和运输受限，且可能由于疫苗保存不当，造成疫苗失活，效力降低，达不到防疫目的，造成巨大经济损失。 耐热冻干保护剂与常规的冻干保护剂相比，冻干疫苗具有耐高温保存期长的特点，因而耐热保护剂的性能要比传统保护剂更为优良，使活疫苗可在有效期内保存在2 8°C条件下，即使在较高的室温下也可以保存几十天，因此使活疫苗的储存、运输和使用都更方便、经济。发达国家对耐热保护剂的研究起步较早，目前他们的冻干活疫苗基本上均使用耐热保护剂，但未见详细报道。国内兽用生物制品保护剂的研制相对滞后，近年我国也有一些相关的研究报道，主要包括鸡新城疫、鸡马立克氏病、鸡法氏囊病、鸡传染性支气管炎、鸡痘和猪瘟冻干活疫苗等的耐热冻干保护剂研究。目前已有中国专利CN 1772302 A鸡新城疫活疫苗耐热冻干保护剂、其制备方法及应用，使用明胶、乳糖、精氨酸、山梨醇作为保护剂。中国专利CN101612404 A公开了鸡新城疫和鸡传染性支气管炎二联活疫苗的耐热冻干保护齐IJ，在2 8°C可以保存24个月。但这些专利中都存在使用过程中冻干时间长的问题，影响了耐热保护剂的推广与应用。因此研制一种配制方法简单，成本低、冻干时间短，能够大规模生产、具有良好保护性能的鸡新城疫、鸡传染性支气管炎二联活疫苗耐热冻干保护剂就显得尤为迫切重要。
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种鸡新城疫和鸡传染性支气管炎二联活疫苗耐热冻干保护剂，由A液和B液根据I : I的体积比组成；其中，所述的A液由以下各组分组成L-谷氨酸钠4 6g,鹿糖4 6g, D-山梨醇I 3g,硫代硫酸钠2 4g,维生素C O. I O. 3g，用注射用水补至IOOmL ;所述的B液由以下各组分组成聚乙烯吡咯烷酮4 6g,用注射用水补至100mL。优选地，本发明鸡新城疫和鸡传染性支气管炎二联活疫苗耐热冻干保护剂中，所述的A液由以下各组分组成A液组成成分为L-谷氨酸钠4g，蔗糖5g，D-山梨醇2g，硫代硫酸钠2g，维生素C O. 2g，用注射用水补至100mL。优选地，本发明鸡新城疫和鸡传染性支气管炎二联活疫苗耐热冻干保护剂中，所述的A液由以下各组分组成L-谷氨酸钠6g，蔗糖6g，D-山梨醇3g，硫代硫酸钠3g，维生素C O. 3g，用注射用水补至100mL。本发明鸡新城疫和鸡传染性支气管炎二联活疫苗耐热冻干保护剂中，所述的B液由以下各组分组成聚乙烯吡咯烷酮4g，用注射用水补至lOOmL。优选地，本发明鸡新城疫和鸡传染性支气管炎二联活疫苗耐热冻干保护剂中，所述的B液由以下各组分组成聚乙烯吡咯烷酮6g，用注射用水补至lOOmL。本发明的另一目的在于提供一种鸡新城疫和鸡传染性支气管炎二联活疫苗耐热冻干保护剂的配制方法，包括以下步骤(I)A液的配制按所述质量配比将L-谷氨酸钠，蔗糖，D-山梨醇，硫代硫酸钠，维生素C充分溶解在注射用水中后过滤除菌； (2)B液的配制将所述质量配比将聚乙烯吡咯烷酮充分溶解在注射用水中后高压灭菌；(3)将配制好的A液和B液根据I : I的体积比例混合在一起后，即得。优选地，本发明鸡新城疫和鸡传染性支气管炎二联活疫苗耐热冻干保护剂的制备方法中，步骤I)中所述的除菌过滤采用0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌。优选地，本发明鸡新城疫和鸡传染性支气管炎二联活疫苗耐热冻干保护剂的制备方法中，步骤2)中所述的高压灭菌为在116°C的温度下灭菌30分钟。本发明还提供了一种鸡新城疫和鸡传染性支气管炎二联活疫苗耐热冻干保护剂在配制鸡新城疫和鸡传染性支气管炎二联活疫苗耐热剂型中的应用。优选地，本发明鸡新城疫和鸡传染性支气管炎二联活疫苗耐热冻干保护剂的应用方法是将鸡新城疫和鸡传染性支气管炎二联活疫苗耐热冻干保护剂与鸡新城疫和鸡传染性支气管炎二联活疫苗以I : I的体积比例进行配苗，分装后进行冷冻干燥。更优地，本发明鸡新城疫和鸡传染性支气管炎二联活疫苗耐热冻干保护剂的应用方法中，所述的冷冻干燥的时间少于28小时。由上可以看出，申请人通过大量实验对耐热冻干保护剂的配方进行了调整，解决了冻干保护剂在冻干步骤中耗时太长的问题，在保证冻干保护剂的耐热保护效果的前提下，获得了一种配制方法简单，能耗更低，成本更少能够大规模生产、具有良好保护性能的鸡新城疫、鸡传染性支气管炎二联活疫苗耐热冻干保护剂，特别是将冻干时间减少到28小时以内，大大提高了耐热冻干保护剂的在保护鸡新城疫、鸡传染性支气管炎二联活疫苗中的使用效率。O.Ig,完全溶解后用注射用水补至lOOmL。经O. 22 μ m滤膜过滤除菌,备用。 B液组成成分为聚乙烯吡咯烷酮5g，完全溶解后用注射用水补至lOOmL。116°C高压灭菌30分钟，备用。A液和B液按照I : I的体积配比混合，即为配方2的耐热冻干保护剂。配方3 A液组成成分为L_谷氨酸钠6g，蔗糖6g，D-山梨醇3g，硫代硫酸钠3g，维生素C
O.3g,用完全溶解后注射用水补至lOOmL。经O. 22 μ m滤膜过滤除菌,备用。B液组成成分为聚乙烯吡咯烷酮6g，完全溶解后用注射用水补至lOOmL。116°C高压灭菌30分钟，备用。A液和B液按照I : I的体积配比混合，即为配方3的耐热冻干保护剂。实施例2鸡新城疫、鸡传染性支气管炎二联活疫苗的耐热冻干保护剂的配苗及保护效力实验I.试验材料及试剂I. I 毒株鸡新城疫病毒Lasota株购自中国兽医药品监察所。鸡传染性支气管炎病毒H120株、H52株购自中国兽医药品监察所。I. 2SPF鸡蛋购自北京梅里亚实验动物技术有限公司。I. 3试剂本发明所有试剂购自Sigma公司。2.试验组二联活疫苗与冻干保护剂的配苗及冷冻干燥程序的设定按照实施例I的三个配方的冻干保护剂分别与鸡新城疫、鸡传染性支气管炎活疫苗按I : I体积比例配苗后，无菌分装于西林瓶中，分别为A、B、C三组(即配方I的冻干剂为A，配方2的冻干剂为B，配方3的冻干剂为C)，每组分别试验01、02、03三个批次。-40°C条件下入箱，制品在此温度预冻3小时后，启动真空泵，达最大真空后启动加热装置，一次干燥温度设定为-10 _5°C，用时在18小时以内；二次干燥温度设定为25°C，用时在5小时以内。因此，二次冻干时间仅为23小时。如果算上中间调整温度时间，整个冻干周期也不超过28h。3.试验组制品技术参数及检验方法3. I产品的物理性状、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、特异性检验、安全检验、剩余水分测定和真空度测定按《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2005版)的方法及标准进行。3. 2病毒含量测定方法及标准以鸡胚半数感染量(EID50)作为衡量疫苗效价的标准。效价测定方法按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2005版)鸡新城疫、鸡传染性支气管炎二联活疫苗效价检测方法进行。
(I)鸡新城疫弱毒冻干苗的标准A.冻干后病毒损失小于O. 3个滴度。B.冻干后每羽份病毒含量彡IO7 0EID500C.冻干后制品放于37°C保存IOd进行病毒含量测定，病毒含量下降在I个滴度以内。D.冻干后制品放于2 8°C保存24个月，每羽份病毒含量彡IO6 2EID500(2)鸡传染性支气管炎弱毒冻干苗的标准A.冻干后病毒损失小于O. 3个滴度。B.冻干后每羽份病毒含量彡IO4 5EID500 C.冻干后制品放于37°C保存IOd进行病毒含量测定，病毒含量下降在I个滴度以内。D.冻干后制品放于2 8°C保存24个月，每羽份病毒含量彡IO3 6EID5004.试验结果及比较表I. 37°C保存效价测定(EID50/羽份)新城疫部分


本发明公开了鸡新城疫、鸡传染性支气管炎二联活疫苗耐热冻干保护剂及其制备工艺。本发明耐热冻干保护剂由A液和B液根据1∶1的体积比组成；其中，所述的A液由以下各组分组成L-谷氨酸钠4～6g，蔗糖4～6g，D-山梨醇1～3g，硫代硫酸钠2～4g，维生素C 0.1～0.3g，用注射用水补至100mL；所述的B液由以下各组分组成聚乙烯吡咯烷酮4～6g用注射用水补至100mL。所述的B液由以下各组分组成聚乙烯吡咯烷酮4g，用注射用水补至100mL。本发明所获得的保护剂配制方法简单，能够大规模生产、能耗更低，成本更少，特别是将冻干时间减少到28小时以内，大大提高了使用效率。对鸡新城疫、鸡传染性支气管炎二联活疫苗具有良好保护性能，能够实现该疫苗在2～8℃下保存24个月以上。