专利名称：淡水鱼气单胞菌二联灭活疫苗及制备方法淡水鱼类细菌性出血病又称细菌性出血性败血症、暴发性出血病、出血性腹水病等，是危害淡水养殖鱼类最为严重的传染病之一，危害的鱼类主要有鲢、鳙、鲫、鲤、鲂、鲮、 鳗、鳜等鱼类。该病发病急，危害的淡水鱼种类多，危害鱼的规格范围大，流行面积广，流行季节长，给淡水养殖业造成较为严重的损失。该病病原主要是气单胞菌属UaroM^M)的嗜水气单胞菌U hydrophila )和温和气单胞菌(A sobria )，其广泛存在于淡水、污水及土壤。具有广泛的致病性，感染包括冷血动物在内的多种动物，引致败血症或皮肤溃疡等局部感染，是水生动物尤其是鱼类最常见的致病菌。疫苗是预防疾病的有效手段，能刺激动物机体产生抗体，可使鱼类特异抵御病原的攻击，在提高鱼类特异性免疫水平的同时亦能增强机体抗不良应激的能力，作为符合环境友好和可持续发展战略的病害防控措施，已成为国际现代水产养殖业的标准生产规范内容之一。目前我国鱼用疫苗获得新兽药证书的只有 3项，水产动物的细菌类疫苗发明专利大多数涉及单苗及其实验室制备方法，而对淡水鱼类危害最大的气单胞菌联合疫苗及其工厂化制备方法还未见报道。
本发明的目的在于为了克服单一灭活苗只针对一种病原菌的缺点，提供一种二联疫苗以达到一次施用可以同时抵御两种病原菌的效果，疫苗通过浸泡、注射或拌和饲料投喂均可方便施用。本发明所述的淡水鱼气单胞菌二联灭活疫苗，包括以下灭活抗原组合物嗜水气单胞菌培养物灭活液和温和气单胞菌培养物灭活液。根据本发明所述的淡水鱼气单胞菌二联灭活疫苗的进一步特征，所述嗜水气单胞菌培养物灭活液占50%，其中细菌浓度不少于25亿cfu/ml ；所述温和气单胞菌培养物灭活液，占50%，其中细菌浓度不少于25亿cfu/ml。本发明还提供了所述的淡水鱼气单胞菌二联灭活疫苗的工厂化制备方法，其特征在于将嗜水气单胞菌培养物灭活液和温和气单胞菌培养物灭活液按1:1的比例混合均勻，无菌灌装，即得到淡水鱼气单胞菌二联灭活疫苗成品。根据本发明所述的淡水鱼气单胞菌二联灭活疫苗的工厂化制备方法，包括以下步骤a.一级种子制备嗜水气单胞菌菌种或温和气单胞菌菌种接种营养琼脂平板，28°C培养，24小时，挑菌苔接种营养肉汤培养基，28°C，摇瓶培养18小时，制备一级种子液；b.二级种子制备将一级种子液接种50L发酵罐，培养基为产毒素培养基J8°C， 30-60L/min的通气量，搅拌通气培养10-16小时，制备二级种子液；c.制苗菌液培养将二级种子液接种500L发酵罐，培养基为产毒素培养基J8°C， 150-200L/min的通气量，搅拌通气培养10-14小时，得到制备疫苗的菌液，活菌数50亿 cfu/ml以上为合格；d.灭活菌液加入0.35%甲醛液，37°C，灭活M小时，进行无菌检验和甲醛残留检验合格，得到嗜水气单胞菌培养物灭活液或温和气单胞菌培养物灭活液；e.配苗分别将两种细菌培养物灭活液按1:1的比例输入配苗罐，罐内混合液搅拌均勻；
f.分装无菌条件下进行分装、轧盖、得到淡水鱼气单胞菌二联灭活疫苗成品。本发明中的淡水鱼气单胞菌二联灭活疫苗工厂化制备工艺成熟，成本不高。疫苗可通过浸泡、注射、拌和饲料投喂等方式施用，免疫鲢、鳙、鲫、鲤、鲂、鲮、鳗、鳜等淡水养殖鱼类，免疫效果良好，可有效预防嗜水气单胞菌和温和气单胞菌引起的淡水鱼类出血性败血症，减少预防性抗生素类渔药的使用。

把保存在冰箱的菌种(嗜水气单胞菌株、温和气单胞菌株)取出，接种营养琼脂(培养基配方见附录)，培养M小时，用接种棒挑菌苔接营养琼脂，培养M小时，接种营养肉汤(培养基配方见附录)300ml/瓶，10瓶，放摇床200rmp/min，28°C，培养18小时，得到 3L—级种子。本实施例选择的菌种为嗜水气单胞菌菌株YYK090901，分离自鳙鱼肾脏；温和气单胞菌菌株LYK090702，分离自鲢鱼肾脏；目前菌种均保存在中国水产科学研究院珠江水产研究所鱼病室。2、二级种子制备
按配方配制的20L产毒素培养基(培养基配方见本说明书附录)，加入到50L发酵罐， 121°C , 20分钟灭菌，培养基冷却后，将3L —级种子液接种发酵罐，28 V，通气量40L/min， 250rmp/min，搅拌培养12小时，得到二级液体种子。3、制备疫苗的菌液培养
按配方配制的180L产毒素培养基(培养基配方见本说明书附录)，加入到500L发酵罐， 121°C, 20分钟灭菌，培养基冷却后，将纯粹及合格的二级种子接入发酵罐，发酵罐内培养液温度为280C，无菌空气流量10. 5M3/小时(175L/min), 200 rmp /min培养菌液12小时，培养结束后无菌采样，进行纯粹和活菌数检测(参照《中华人民共和国兽药典》二 00五年版第三部)，活菌数需达到50亿CFU/mL以上为合格菌液。4、灭活
将合格菌液通过管道输送到灭活罐，无菌操作加入甲醛液，甲醛最终浓度为0. 35%，以 37°C灭活，灭活M小时，期间每隔4小时搅拌一次，灭活好的菌液冷却至1 5°C之间，进行无菌检验和甲醛残留检验(参照《中华人民共和国兽药典》二 00五年版第三部)。5、配苗分别将两种细菌的合格灭活液按1 :1的比例输入配苗罐，罐内混合液搅拌均勻。6、分装
无菌条件下进行分装、轧盖，得到淡水鱼气单胞菌二联灭活疫苗成品。经测定，所得的淡水鱼气单胞菌二联灭活疫苗中，嗜水气单胞菌培养物灭活液占 50%，其中细菌浓度不少于25亿cfu/ml ；温和气单胞菌培养物灭活液，占50%，其中细菌浓度不少于25亿cfu/ml ο实施例二.淡水鱼气单胞菌二联灭活疫苗的免疫效果
将健康鲫鱼(30-50g/尾)随机分成三组，每组100尾。第一组为注射免疫组，每尾腹腔注射实施例一所制备的淡水鱼气单胞菌二联灭活疫苗0. Iml ；第二组为浸泡免疫组， 先将实验鱼在l%NaCL溶液中浸泡3-5min，然后在10倍稀释的二联疫苗液中充气浸泡 10-15min ；第三组为对照组。水温为22-26 °C。在免疫28d后，分别用2倍LD50剂量的嗜水气单胞菌菌株YYK090901和温和气单胞菌菌株LYK090702(嗜水气单胞菌菌株YYK090901 分离自鳙鱼肾脏，温和气单胞菌菌株LYK090702分离自鲢鱼肾脏，目前菌种保存在中国水产科学研究院珠江水产研究所鱼病室)，腹腔注射感染试验鱼，并饲养观察7天，记录各组试验鱼的发病和死亡情况。实验结果表明，注射免疫组对菌株YYK090901、LYK090702的相对免疫保护率分别为84%、89%，浸泡组分别为57%、59% (见表1)。 表1 二联苗免疫的效果


本发明涉及二联灭活疫苗，具体涉及一种淡水鱼嗜水气单胞菌、温和气单胞菌二联灭活疫苗及制备方法。本发明所述的一种淡水鱼气单胞菌二联灭活疫苗，包括以下灭活抗原组合物嗜水气单胞菌培养物灭活液和温和气单胞菌培养物灭活液。本发明还提供了所述的淡水鱼气单胞菌二联灭活疫苗的工厂化制备方法，其特征在于将嗜水气单胞菌培养物灭活液和温和气单胞菌培养物灭活液按1:1的比例混合均匀，无菌灌装，即得到淡水鱼气单胞菌二联灭活疫苗成品。本发明克服了单一灭活苗只针对一种病原菌的缺点，提供的二联疫苗可达到一次施用可以同时抵御两种病原菌的效果，疫苗通过浸泡、注射或拌和饲料投喂均可方便施用。