专利名称：蛋白质糖基化的制作方法蛋白质糖基化本发明涉及寡糖基(oligosaccharyl)转移酶多肽及其在通过微生物宿主细胞生产糖基化的重组蛋白中的用途，并且包括含有糖基化的重组抗原的疫苗。介绍重组蛋白质如酶、多肽激素、重组单克隆抗体和重组抗原的大规模生产要求高标准的质量控制，由于这些蛋白质中许多是给予到人的。此外，疫苗尤其是亚单位疫苗的开发要求生产大量的、不含可以激发过敏反应的污染性抗原的纯蛋白质。在细胞表达系统中重组蛋白质的生产基于原核细胞表达或真核细胞表达进行。当要求对蛋白进行翻译后修饰如糖基化时，后者是优选的。背景 糖基化是将糖的悬挂基团(pendent group)加到蛋白质、多肽或肽上,其改变所述蛋白质、多肽或肽的活性和/或生物利用度。该过程是共翻译或者翻译后的，并且是酶介导的。存在两种类型的糖基化对天冬酰胺侧链的N-联糖基化，以及对丝氨酸或苏氨酸氨基酸侧链的0-联糖基化。N-联糖基化是最普通的翻译后修饰并且在真核细胞的内质网上进行。N-联糖基化可以分为两大类；为两个N-乙酰葡糖胺的高甘露糖寡糖和包括其他类型的糖基的复合寡糖。糖基化多肽包含的肽基序为Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中X是除脯氨酸之外的任意氨基酸。其被酶寡糖基转移酶催化；参见Yan & Lennarz J. Biol.Chem. ,Vol. 280(5),3121-3124(2005)OT catalyzes the transfer of an oligosaccharylmoiety(Glc3Man9GlcNAc2)from the dolichol-linked pyrophosphate donor to the sidechain of an Asn0对于所有的N-联寡糖而言，五糖核心是共有的并作为许多N-联寡糖的基础。0-联糖基化较不常见。丝氨酸或者苏氨酸残基通过其侧链氧通过糖苷键与糖连接。通常地，N-乙酰葡糖胺是以此方式与细胞内蛋白质相连的。最近才认识到原核细胞具有将蛋白质糖基化的能力。尤其地，认识到了在一些e蛋白菌中存在N-联糖基化。例如空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni) [C. jejuni]的基因组编码脂寡糖和N-联糖蛋白的合成中牵涉的基因。蛋白质糖基化位置[pgl位置]牵涉到30个以上的糖蛋白的糖基化中。还证明了所述的pgl基因可以在大肠杆菌[E.coli]中发挥功能从而修饰共表达的空肠弯曲杆菌蛋白质，这说明大肠杆菌可以被改造从而产生异源重组糖蛋白。由空肠弯曲杆菌基因座编码的PglB可以将包括细菌0-抗原的替代多糖转移到成熟的N-联七糖GalNac5GlcBac，这暗示宽松的特异性。然而，有与此酶相关的问题；所述的酶并不能够转移所有的多糖。这可以是由在多糖的还原性末端的糖的C2位上需要乙酰氨基基团所导致的。因此希望能鉴定替代的无此障碍的寡糖基转移酶。在药物的历史上最重要的发现之一是接种策略的开发，所述的接种策略用于针对大量的感染性和非感染性的疾病，为人和动物提供保护。多种疫苗是由注射到个体中的灭活或减毒的病原体制备的。这些有时候可以引起不良的副作用。多种现代疫苗是由病原体的保护性抗原制备的，其通过纯化或分子克隆从引起副作用的物质中分离。这些后者的疫苗称作“亚单位疫苗”。由荚膜细菌引起的细菌性感染是全世界主要的健康问题。由于主要表面抗原荚膜多糖的T细胞非依赖性的本质,难以针对肺炎链球菌(Streptoccocuspneumoniae),流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)和脑膜炎双球菌(Neisseriameningitidis)菌种进行接种。关于有效疫苗的开发，T细胞非依赖性抗原如荚膜多糖表现出特别的问题。抗体的产量低，并且一般地在再次免疫中不被加强。抗体同种型被限制为IgM,而其他同种型对特异性抗原一般具有低的亲和性。主要问题在于幼童对T细胞非依赖性疫苗的应答。这些个体对于细菌感染是最脆弱的。T细胞依赖性抗原在引发高滴度、高亲和性的抗体应答中更为有效，并且通常是蛋白质。这是由于对B-淋巴细胞有帮助的T-淋巴细胞在对这些抗原的免疫应答中被引发。B-淋巴细胞通过其特异性抗原受体结合于抗原，这导致了部分激活。如果所述的抗原是蛋白质的话，所述的B淋巴细胞摄取并加工该抗原成为肽，所述的肽是与HLA II类分子在细胞表面上表达的。T细胞非依赖性抗原在组成上不总是蛋白质，并且因此不能由B-淋巴细胞通过HLA分子进行加工和呈递。该抗原呈递的失败使得该抗原的T-细胞识别低，并且因此导致其无T细胞辅助。用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和脑膜炎双球菌的糖缀合疫苗当前批准为人使用，并且通过将这些细菌的荚膜(或者其他的细菌性基于多糖的结构，如脂寡多糖，L0S)与 蛋白质类毒素连接。当这些疫苗提供良好的免疫水平时，其昂贵并难于生产，要求对来自致病性有机体的多糖进行纯化，以及要求与载体蛋白的化学连接。还有证据显示，出现了由未被所述的疫苗覆盖的血清型引起的疾病。有机体系的应用代表了更快以及更经济的糖缀合生产的方法。本公开涉及与空肠弯曲杆菌PglB同源的寡糖基转移酶的识别和表征，并且所述的寡糖基转移酶能够在不需要醋酸亚氨基的情况下将蛋白质糖基化，从而提供了在疫苗中有用的蛋白质糖蛋白缀合物，其会受益于T细胞的辅助从而提供对例如细菌感染有效的疫苗。
根据本发明的一个方面，提供了包含核苷酸序列的载体转化的微生物细胞，所述的核苷酸序列选自i)由图Ia表示的核酸序列组成的核酸分子；ii)由在严格的杂交条件下与(i)中的核酸分子杂交的核酸序列所组成的核酸分子并且该核酸序列编码多肽；其中所述的细胞表达重组多肽，该多肽是所述的寡糖基转移酶的底物。当两个互补的核酸分子彼此之间发生一定数量的氢键键合时，核酸分子的杂交发生。严格性或者杂交可以根据核酸周围的环境条件、杂交方法的本质以及所使用的核酸分子的组成和长度发生变化。在Sambrook等人，Molecular Cloning ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY,2001)；以及 Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes Part I, Chapter 2 (Elsevier, NewYork, 1993)中讨论了为了达到特定的严格性程度所需要的关于杂交条件的计算。Tm是50%的给定的核酸分子链与其互补链杂交时的温度。随后是杂交条件的示例性设定，其不是限制性的非常高的严格性(使具有至少90%同源性的序列杂交)杂交 5x SSC在65°C下16小时洗涤两次2x SSC在室温(RT)下每次15分钟洗涤两次0. 5x SSC在65°C下每次20分钟高严格性(使具有至少80%同源性的序列杂交)杂交5x_6x SSC 在 65°C _70°C下 16-20 小时洗涤两次2x SSC在室温(RT)下每次5-20分钟洗涤两次lx SSC在55°C _70°C下每次30分钟 低严格性(使具有至少50%同源性的序列杂交)杂交6x SSC 在 RT 到 55°C 下 16-20 小时洗涤至少两次2x_3x SSC在RT到55°C下每次20-30分钟。在本发明的优选的实施方案中，所述的微生物细胞使用核酸分子进行转化，所述的核酸分子包含核苷酸序列，所述的核苷酸序列编码如图Ib所示的寡糖基转移酶多肽，或者编码变体多肽，所述的变体多肽包含经修饰的图Ib所示的氨基酸序列，所述修饰是通过至少一个氨基酸残基的缺失、添加或取代进行并保持或者增强了寡糖基转移酶活性。通过可以存在于任何组合中的一次或多次的取代、添加、缺失、截短，变体多肽可以在氨基酸序列上有差别。优选的变体是从参照多肽上进行保守的氨基酸取代的那些。该取代是将给定的氨基酸用具有类似特征的另一氨基酸取代的那些。随后的非限制性的氨基酸列表认为是保守置换(类似的)a)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸；b)谷氨酸和天冬氨酸；c)天冬酰胺和谷氨酰胺；d)精氨酸和赖氨酸；e)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸以及f)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。最优选的是与其变化自的参照多肽保持或者增强了相同的生物功能和活性的变体。此外，本发明描述了与所公开的多肽序列具有至少40-75%的同源性的多肽序列，或者其片段和功能上等价的多肽；优选地其与整个氨基酸序列相比具有至少43%同源性。在一个实施方案中，与在本文中参考图Ib所图示的整个氨基酸序列相比，所述的多肽与所述的氨基酸序列具有至少85%的同源性，更优选地具有至少90%的同源性，甚至更优选地具有至少95%的同源性，还更优选地具有至少97%的同源性，以及最优选地具有至少99%的同源性。在本发明的优选的实施方案中，所述的载体是表达载体，所述的表达载体适合于表达编码寡糖基转移酶多肽的核酸分子的表达。针对一般性的表达载体的构建和重组DNA技术有大量的已公开文献。请参见，Sambrook 等人(1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring HarbourLaboratory, Cold Spring Harbour, NY 及其中的参考文献；Marston, F (1987) DNA CloningTechniques A Practical Approach Vol III IRL Press，Oxford UK ；DNA Cloning F MAusubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons，Inc.(1994) o在本发明优选的实施方案中，所述的重组多肽包括至少一个肽基序，所述的肽基序由以下氨基酸序列构成Asp/Glu-Xaa1-Asn-Xaa2-SerZThr其中Xaa1和Xaa2是除脯氨酸之外的任意氨基酸。在本发明优选的实施方案中，所述的重组多肽是从传染性病原体中分离的抗原。在本发明优选的实施方案中，所述的传染性病原体是细菌性病原体。优选地，可以从以下的病原体将多糖转移到蛋白质肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、猪链球菌(Streptococcus suis)、海豚链球菌(streptococcus inae)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、马链球菌(Streptococcus equi)、乳房链球菌(Streptococcus uberist)、米勒链球菌组(Streptococcus milleri group)(SMG)、血链球菌(Streptococcus sanguis)，牛链球菌(Streptococcus bovis)，链球菌 A 组(Streptococcus group A)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)，产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)，植生克雷伯菌(Klebsiella planticola)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerunginosa)、鲍氏不动杆菌(Acinetobcater baumanii)、醋酸I丐不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)，伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi)，空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)， 结肠弯曲菌(Campylobacter coli)，红嘴区鸟弯曲杆菌(Campylobacter lari)，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoea)、乳酸胺奈瑟菌(Neisseria lactamica)、志贺菌属(Shigella spp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus spp)、艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)，炭疽杆菌(Bacillus anthracis)，类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)、乳酸杆菌属(Lactobacillus spp.)，破伤风杆菌(Clostridium tetani)，白喉棒状杆菌(Corynebacterium diptheriae)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)，病毒衍生的抗原，例如人乳头瘤病毒(HPV)、甲型肝炎、乙型肝炎、轮状病毒以及流感病毒、得自寄生虫如恶性症原虫(Plasmodium faciparum)的抗原。在本发明优选的实施方案中，所述的细菌性病原体选自表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、金黄色葡萄球菌(S. aureus)、人葡萄球菌(S.hominis)、溶血性葡萄球菌(S. haemolyticus)、沃氏葡萄球菌(S. warneri)、头状葡萄球菌(S. capitis)、解糖葡萄球菌(S. saccharoIyticus)、耳葡萄球菌(S. auricularis)、模仿葡萄球菌(S. simulans)、腐生性葡萄球菌(S. saprophyticus)、科氏葡萄球菌(S. cohnii)、木糖葡萄球菌(S. xylosus)、科氏葡萄球菌(S. cohnii)、沃氏葡萄球菌(S. warneri)、猪葡萄球菌(S. hyicus)、山羊葡萄球菌(S. caprae)、鸡葡萄球菌(S. gallinarum)、中间葡萄球菌(S. intermedius)、人葡萄球菌(S.hominis)。根据本发明的寡糖基转移酶多肽用于结合来自以下的多糖A)来自以下的荚膜(K)抗原肺炎链球菌、猪链球菌、海豚链球菌、无乳链球菌、米勒链球菌组(SMG)、牛链球菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、植生克雷伯菌(Klebsiellaplanticola)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerunginosa)、鲍氏不动杆菌(Acinetobcaterbaumanii)、醋酸钙不动杆菌、伤寒沙门菌、类鼻疽伯克霍尔德氏菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、空肠弯曲杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、丝状支原体丝状亚种 SC 型(Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC)、格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)；B)来自以下的0-抗原肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、植生克雷伯菌、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerungmosa)、鲍氏不动杆菌(Acinitobcaterbaumanii)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium)、伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi)、假结核耶尔森菌(Yersiniapseudotuberculosis)、布鲁氏菌属(Brucella spp.)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、胸膜肺炎放线杆菌、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)； C)来自铜绿假单胞菌、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的胞外多糖/表面多糖。在本发明的优选的实施方案中，所述的重组抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列，或者由该氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自图4a_4e中表示的序列，其中所述的变体是图4a_4e中表示的至少一个氨基酸残基的缺失、取代或添加。在本发明优选的实施方案中，所述重组抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列，或者由该氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自图5a中表示的序列，其中所述的变体是图5中表示的至少一个氨基酸残基的缺失、取代或添加。在本发明优选的实施方案中，所述重组抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列，或者由该氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自图6a_6g中表示的序列，其中所述的变体是图6a_6g中表示的至少一个氨基酸残基的缺失、取代或添加。在本发明优选的实施方案中，所述重组抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列，或者由该氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自图7a-7m中表示的序列，其中所述的变体是图7a_7m中表示的至少一个氨基酸残基的缺失、取代或添加。在本发明优选的实施方案中，所述重组抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列，或者由该氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自图8a_8i中表示的序列，其中所述的变体是图8a_8i中表示的至少一个氨基酸残基的缺失、取代或添加。在本发明优选的实施方案中，所述重组抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列，或者由该氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自图9a或9b中表示的序列，其中所述的变体是图9a或9b中表示的至少一个氨基酸残基的缺失、取代或添加。在本发明优选的实施方案中，所述重组抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列，或者由该氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自图IOa或IOb中表示的序列，其中所述的变体是图IOa或IOb中表示的至少一个氨基酸残基的缺失、取代或添加。
在本发明优选的实施方案中，所述重组抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列，或者由该氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自图Ila-Ilk中表示的序列，其中所述的变体是图Ila-Ilk中表示的至少一个氨基酸残基的缺失、取代或添加。在本发明优选的实施方案中，所述重组抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列，或者由该氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自

图12中表示的序列，其中所述的变体是图12中表示的至少一个氨基酸残基的缺失、取代或添加。在本发明优选的实施方案中，所述重组抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列，或者由该氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自图13a_13i中表示的序列，其中所述的变体是图13a_13i中表示的至少一个氨基酸残基的缺失、取代或添加。在本发明优选的实施方案中，所述重组抗原性多肽包含图14中表示的氨基酸序 列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列，或者由该氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列组成，，在变体氨基酸序列中所述的变体是图14中表示的至少一个氨基酸残基的缺失、取代或添加。在本发明优选的实施方案中，所述重组抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列，或者由该氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自图15a_15f中表示的序列，其中所述的变体是图15a_15f中表示的至少一个氨基酸残基的缺失、取代或添加。在本发明优选的实施方案中，所述重组抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列，或者由该氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自图16a_16f中表示的序列，其中所述的变体是图16a_16f中表示的至少一个氨基酸残基的缺失、取代或添加。在本发明优选的实施方案中，所述重组抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列，或者由该氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自图17中表示的序列，其中所述的变体是图17中表示的至少一个氨基酸残基的缺失、取代或添加。在本发明优选的实施方案中，所述重组抗原性多肽包含图18中表示的氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列，或者由该氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列组成，在变体氨基酸序列中所述的变体是图18中表示的至少一个氨基酸残基的缺失、取代或添加。在本发明优选的实施方案中，所述重组抗原性多肽包含图19中表示的氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列，或者由该氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列组成，在变体氨基酸序列中所述的变体是图19中表示的至少一个氨基酸残基的缺失、取代或添加。在本发明优选的实施方案中，所述重组抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列，或者由该氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自图20a-20c中表示的序列，其中所述的变体是图20a-20c中表示的至少一个氨基酸残基的缺失、取代或添加。在本发明优选的实施方案中，所述重组抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列，或者由该氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自图21a或21b中表示的序列，其中所述的变体是图21a或21b中表示的至少一个氨基酸残基的缺失、取代或添加。在本发明优选的实施方案中，所述重组抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列，或者由该氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自图22a-22f中表示的序列，其中所述的变体是图22a-22f中表示的至少一个氨基酸残基的缺失、取代或添加。在本发明优选的实施方案中，所述重组抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列，或者由该氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自图23a-23f中表示的序列，其中所述的变体是图23a-23f中表示的 至少一个氨基酸残基的缺失、取代或添加。在本发明优选的实施方案中，所述重组抗原性多肽包含氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列，或者由该氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自图24a-24d中表示的序列，其中所述的变体是图24a-24d中表示的至少一个氨基酸残基的缺失、取代或添加。在本发明优选的实施方案中，所述重组抗原性多肽包含图25中表示的氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列，或者由该氨基酸序列或其抗原性部分或者变体氨基酸序列组成，在变体氨基酸序列中所述的变体是图25中表示的至少一个氨基酸残基的缺失、取代或添加。在本发明的优选实施方案中，所述的微生物细胞是细菌细胞。根据本发明的糖缀合疫苗可以通过两种方法制备i.在表达所要缀合的多糖的宿主有机体中表达该寡糖基转移酶多肽及经修饰的糖蛋白受体。这可能需要使用经遗传修饰的宿主，例如0-抗原连接酶突变体。ii在大肠杆菌宿主中表达所述的寡糖基转移酶多肽，所述的经修饰的糖蛋白以及经克隆的多糖生物合成基因座。所述的微生物细胞优选地为埃希氏菌属(Escherichi),例如大肠杆菌；可选地所述的细菌细胞是沙门氏杆菌属(Salmonella spp.)。根据本发明的一个方面，提供了疫苗组合物，所述的组合物包含根据本发明的细菌糖缀合抗原多肽或者其部分。在本发明的优选的实施方案中，所述的组合物包含载体和/或任选地包含佐剂。在本发明的优选的实施方案中，所述的佐剂选自细胞因子，所述的细胞因子选自GMCSF、干扰素Y、干扰素a、干扰素P、白细胞介素12、白细胞介素18、白细胞介素23、白细胞介素17、白细胞介素2、白细胞介素l、TGF、TNFa和TNF 3。 在本发明的进一步的替代实施方案中，所述的佐剂是TLR激动剂如CpG寡核苷酸、鞭毛蛋白、单磷酰基脂质A、聚I :C及其衍生物。在本发明优选的实施方案中，所述的佐剂是细菌细胞壁衍生物，如胞壁酰二肽(MDP)和 / 或海藻糖棒状二霉菌酸酯(trehelose dycorynemycolate) (TDM)。
佐剂是通过调节免疫细胞的活性提高对抗原做出特异性免疫应答的物质或者步骤。佐剂的实例包括，仅是示例性的，共刺激分子的激动剂抗体、Freunds佐剂、胞壁酰二肽和脂质体。因此佐剂是免疫调节剂。载体是免疫原性的分子，其当连接于第二个分子时提高对后者的免疫应答。在本发明的优选实施方案中，所述的组合物包含如以下所描述的两种或三种不同的糖缀合抗原性多肽的混合物。根据本发明的进一步的方面，提供了含有根据本发明的微生物细胞的细胞培养物。根据本发明的进一步的方面，提供了含有根据本发明的细胞培养物的发酵罐。根据本发明的进一步的方面，提供了根据本发明的细胞在生产糖缀合多肽中的用途。
根据本发明的一个方面，提供了生产重组糖缀合多肽的方法，所述的方法包括i)提供根据本发明的微生物培养物；ii)培养所述的微生物培养物；并且iii)将所述的糖缀合多肽从所述的微生物细胞或者所述的细胞培养基中分离。用于本发明的方法中的微生物细胞以有经验的工作人员熟悉的方式进行生长或者培养，所述的方式取决于宿主有机体。作为规则，将微生物细胞在含有碳源、氮源、微量元素以及如果适当的话维生素的液体培养基中，在0°c至100°C的温度优选地在10°C至60°C的温度下，充氧气下进行生长，所述的碳源一般地为糖的形式，所述的氮源一般地为有机氮源如酵母提取物或者盐如硫酸铵的形式，所述的微量元素如铁、锰和镁的盐。液体培养基的pH可以保持恒定或者不保持恒定，所谓的保持恒定即在培养期间进行调节。培养物可以分批、半分批或者连续地进行生长。可以将营养物在发酵的开始提供，或者半连续地或者连续地进行提供。所生成的产物可以按照以上所描述的本领域技术人员知道的方法进行分离。为此，有机体有利地可以预先破裂。在此过程中，PH值有利地保持于PH4和12之间，优选地在pH6和9之间，尤其优选地在pH7和8之间。要使用的培养基必须适当地满足所考虑的菌株的要求。对于不同的微生物的培养基的描述可以在教科书"Manual of Methods for General Bacteriology" of theAmerican Society for Bacteriology (Washington D. C. , USA, 1981)中得到。如前文所描述的，可以按照本发明采用的这些培养基一般地含有一种或更多种的碳源、氮源、无机盐、维生素和/或微量元素。优选的碳源是糖，例如单糖、二糖或者多糖。碳源的实例为葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或者纤维素。还可以将糖以络合物(complex compounds)的形式添加到培养基中,所述的络合物如糖蜜或者其他制糖中的副产物。多种碳源的混合物的添加也可以是有利的。其他可能的碳源是油和脂肪，例如大豆油、葵花籽油、花生油和/或椰子油，脂肪酸例如棕榈酸、硬脂酸和/或亚油酸，醇和/或多元醇例如甘油、甲醇和/或乙醇，以及有机酸例如乙酸和/或乳酸。氮源一般地是有机的或者无机的氮化合物或者含有这些化合物的材料。氮源的实例包括液态或者气态的氨或者铵盐如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或者硝酸铵、硝酸盐、尿素、氨基酸或者复合氨源如玉米浆、大豆柏、大豆蛋白、酵母提取物、肉提取物以及其他。所述的氮源可以单独地或者以混合物使用。可以存在于培养基中的无机盐化合物包含钙、镁、钠、钴、钥、钾、锰、锌、铜和铁的氯盐、磷酸盐和硫酸盐。无机的含硫化合物可以用作硫源来生产含硫的精细化学品尤其是甲硫氨酸，所述的含硫化合物例如硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、连四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物或者其他的有机硫化合物如硫醇(mercaptan)和硫醇(thiol)。磷酸、磷酸二氢钾或者磷酸氢二钾或者对应的含钠的盐可以用作磷的来源。为了保持溶液中的金属例子，可以向培养基中添加螯合剂。特别适合的螯合剂包括苯二酚例如邻苯二酚或原儿酚和有机酸例如柠檬酸。根据本发明的用于培养微生物细胞的发酵培养基通常还包含其他的生长因子如维生素或者生长促进剂，所述维生素或生长促进剂包括例如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、 烟酸、泛酸盐和吡哆醇。生长因子和盐通常得自复合培养基的组分如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等等。此外更可能地，向该培养基中加入适合的前体。培养基化合物的精确组分很大程度上取决于具体实验，并且是但由每个具体案例单独地所决定的。优化培养基的信息可见于教科书"Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (EditorsP. M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 199635773)。生长培养基还可以得自商业上的供货商，例如Standard I (Merck)或者BHI (脑心脏浸液,DIFC0)等等。培养物的温度正常地在15°C至45°C，优选地在在25°C至40°C，并且可以在实验期间保持恒定或者加以改变。培养基的PH应在5到8. 5的范围内，优选地在7. 0附近。培养的pH可以在培养过程中通过加入碱性化合物或者酸性化合物来控制，所述的碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨和氨水，所述的酸性化合物如磷酸或者硫酸。可以通过采用消泡剂来控制起泡，所述的消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯。为了保持质体的稳定性，可以向培养基中添加适用的具有选择性效果的物质，例如抗生素。通过向培养物中导入氧气或者含有氧气的气体混合物来保持需氧条件，所述的气体混合物如环境空气。继续培养，直到希望的产物的形成达到最大。该目标正常地在10到160个小时内达到。根据本发明进一步的方面，提供了针对细菌感染接种受试者的方法，所述的方法包括使用根据本发明的有效量的疫苗免疫所述的受试者。在本说明书(specification)的说明书(description)以及权利要求书中，词语“包含(comprise)”和“含有”以及该词语的变化例如“包含(comprising) ”和“包含(comprises)”意为“包括但不限于”，并且不希望(并且也不)排除其他的部分、添加物、组件、整体或者步骤。在本说明书(specification)的说明书(description)和权利要求书中，除非上下文另外要求，单数包括了复数。具体地，在使用不定冠词处，除非上下文另外要求，说明书理解为预期的复数以及单数。除非与其不相容，结合本发明的具体的方面、实施方案或者实例描述的特征、整体、特性、化合物、化学部分或者基团理解为可以应用到在此描述的任意其他方面、实施方案或者实例。本发明的实施方案在此仅通过实例并参考以下的附图进行描述图Ia是Nitratiruptor tergasus PglB的直系同源基因的核苷酸序列；图Ib是Nitratiruptor tergasus pglB的直系同源基因的氨基酸序列；图2A) CJOlH-His 的检测。与 i)pMAF10[空肠弯曲杆菌 PglB (Cj PglB)]和 ii)pMLNT2 [N. tergacus PglB(Nt PglB)]在鼠伤寒沙门氏菌(S. Typhimurium)中共表达的重组CJ0114-His，其使用抗-His抗体进行检测。框指示了像0-抗原的梯形带。B)鼠伤寒沙门氏菌0-抗原的结构。还原末端的半乳糖不允许被Cj PglB转移到蛋白；和图3经纯化的CJ0114_His的蛋白酶K处理。来自鼠伤寒沙门氏菌的经纯化的CJ0114-His(i)，共表达Nt PglB的鼠伤寒沙门氏菌(ii)以及共表达Cj PglB的鼠伤寒沙门氏菌(iii), A) 2. 5 u g CJ0114_His，B) 2. 5 y gCJ0114_His，在 37°C 下温育 16 小时后。C) 2. 5 u g CJ0114-His，在使用蛋白酶K在37°C下孵育16小时后。使用抗-His抗体检测CJ0114-His。在蛋白酶K处理之后，针对His抗体的反应性的缺失表明所识别的梯样带具有蛋白质来源；图4a是肺炎链球菌(Steptococcus pneumoniae)溶血素的氨基酸序列；图4b是 无毒变体肺炎球菌溶血素(pnuemolysin)的氨基酸序列；图4c是肺炎链球菌PspA的氨基酸序列；图4d是肺炎链球菌未知抗原的氨基酸序列；并且图4e是肺炎链球菌ABC转运蛋白，底物结合蛋白的氨基酸序列；图5是白喉棒状杆菌毒素CRM197的氨基酸序列；图6a是猪链球菌抗原的氨基酸序列；图6b是猪链球菌表面抗原SPl抗原的氨基酸序列；图6c是猪链球菌Rfe A抗原的氨基酸序列；图6d是猪链球菌未知抗原的氨基酸序列；图66是猪链球菌脱氢酶抗原的氨基酸序列；图6?侵砹辞蚓?苎?氐陌被?嵝蛄校徊⑶彝?g是猪链球菌磷酸甘油酸变位酶(phosphoglycerate mutase)的氨基酸序列；图7a是无乳链球菌(Steptococcus agalactiae) C5a肽酶的氨基酸序列；图7b是无乳链球菌免疫球蛋白A结合P抗原的氨基酸序列；图7c是无乳链球菌金属结合蛋白AcdA的氨基酸序列；图7d是无乳链球菌LysM抗原的氨基酸序列；图7e是无乳链球菌LPXTG抗原的氨基酸序列；图7f是无乳链球菌细胞壁表面锚定家族蛋白的氨基酸序列；图7g是无乳链球菌细胞壁表面锚定家族蛋白的氨基酸序列；图7h是无乳链球菌细胞壁表面锚定家族蛋白的氨基酸序列；图71是无乳链球菌细胞Bib A抗原的氨基酸序列；图7」是无乳链球菌C蛋白免疫球蛋白A结合的P抗原的氨基酸序列；图7k是无乳链球菌表面蛋白Rib抗原的氨基酸序列；图71是无乳链球菌a样蛋白3的氨基酸序列；并且图7m是无乳链球菌a样蛋白2的氨基酸序列；图8a是肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae) Fim A抗原的氨基酸序列；|l|8b是肺炎克雷伯菌推定的菌毛主要亚基的氨基酸序列；图8c是肺炎克雷伯菌MrkA抗原的氨基酸序列；图8d是肺炎克雷伯菌OmpA的氨基酸序列；图8e是肺炎克雷伯菌MrkD的氨基酸序列；图8f是肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae) FepA的氨基酸序列；图8g是肺炎克雷伯菌0mpK36的氨基酸序列；图8h是肺炎克雷伯菌0mpK17的氨基酸序列；并且图8i是肺炎克雷伯菌OmpW的氨基酸序列；图9a是海豚链球菌(Steptococcus iniae) Sim A抗原的氨基酸序列；图9b是海豚链球菌ScpI抗原的氨基酸序列；图IOa是HPV外壳蛋白LI的氨基酸序列；图IOb是HPV主要衣壳蛋白LI的氨基酸序列；
图I Ia是铜绿假单胞菌(Pseudomoas aeruinosa) OmpA的氨基酸序列；图I Ib是铜绿假单胞菌OprF的氨基酸序列；图Ilc是铜绿假单胞菌Opr I的氨基酸序列；图Ild是铜绿假单胞菌Fli C的氨基酸序列；图lie是铜绿假单胞菌KatE的氨基酸序列；图Ilf是铜绿假单胞菌Kat A的氨基酸序列；图Ilg是铜绿假单胞菌酰胺酶的氨基酸序列；图Ilh是铜绿假单胞菌0pr86的氨基酸序列；图Ili是铜绿假单胞菌LcrV的氨基酸序列；图Ilj是铜绿假单胞菌ToxA的氨基酸序列；以及图Ilk是铜绿假单胞菌外毒素的氨基酸序列；图12a是鲍氏不动杆菌(Actinebacter baumanni) FhuE的氨基酸序列；图13a是肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)OmpD的氨基酸序列；图13b是肠道沙门氏菌SopB的氨基酸序列；图13c是肠道沙门氏菌GroEL的氨基酸序列；图13d是肠道沙门氏菌PagC的氨基酸序列；图13e是肠道沙门氏菌菌毛亚基的氨基酸序列；图13f是肠道沙门氏菌DnaJ的氨基酸序列；图13g是肠道沙门氏菌OmpC的氨基酸序列；图13h是肠 道沙门氏菌OmpF的氨基酸序列；图131是肠道沙门氏菌外膜蛋白的氨基酸序列；图14是炭疽杆菌(Bacillus anthracis)保护性抗原(PagA)的氨基酸序列；图15a是空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni) Ped I的氨基酸序列；图15b是空肠弯曲杆菌Ped 2的氨基酸序列；图15c是空肠弯曲杆菌Peb 3的氨基酸序列；图15d是空肠弯曲杆菌Cj0114的氨基酸序列；图15e是空肠弯曲杆菌Cja A的氨基酸序列；以及图15f是空肠弯曲杆菌FlaA的氨基酸序列；图16a是流感嗜血杆菌蛋白质D的氨基酸序列；图16b是流感嗜血杆菌Hap的氨基酸序列；图16c是流感嗜血杆菌PilA的氨基酸序列；图16d是流感嗜血杆菌Omp P5的氨基酸序列；图16e是流感嗜血杆菌Hia的氨基酸序列；并且图16f是流感嗜血杆菌HMWl的氨基酸序列；图17是百日咳博德特氏菌百日咳杆菌粘附素的氨基酸序列；图18是大肠杆菌抗原43的氨基酸序列；图19是幽门螺杆菌UreB的氨基酸序列；图20a是脑膜炎双球菌NadA的氨基酸序列；图20b是脑膜炎双球菌GNA1870的氨基酸序列；图20c是脑膜炎双球菌Fet A的氨基酸序列；图21a是恶性痕原虫(Plasmodium falciparum)裂殖子表面蛋白4MSP4的氨基酸序列；图20b是恶性疟原虫裂殖子表面蛋白5，MSP5的氨基酸序列；图22a是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ClfA的氨基酸序列；图22b是金黄色葡萄球菌烯醇酶的氨基酸序列；图22c是金黄色葡萄球菌3-氧代酰基还原酶的氨基酸序列；图22d是金黄色葡萄球菌假定的蛋白SAS2241的氨基酸序列；图22e是金黄色葡萄球菌IsdB的氨基酸序列；图22f是金黄色葡萄球菌外毒素的氨基酸序列；图23a是艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile) SLP的氨基酸序列；图23b是艰难梭状芽胞杆菌FliC的氨基酸序列；图23c是艰难梭状芽胞杆菌FliD的氨基酸序列；图23d是艰难梭状芽胞杆菌Cwp84的氨基酸序列；图23e是艰难梭状芽胞杆菌Cwp66的氨基酸序列；图23f是艰难梭状芽胞杆菌毒素A的氨基酸序列；图24a是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis) Cfp-IO的氨基酸序列；图24b是结核分枝杆菌Ag85A的氨基酸序列；图24c是结核分枝杆菌Ag85B的氨基酸序列；图24d是结核分枝杆菌ESAT-6的氨基酸序列；
图25是重组肉毒杆菌(Recombinant botulinum)毒素F的He功能域[合成的构建物]的氨基酸序列；图26图示经纯化的CJ0114_His的蛋白酶K处理。i) 2. 5 ii g蛋白质ii) 2. 5 ii g蛋白质，在37°C下温育16h C后，iii)2. 5iig蛋白质，在与蛋白酶K在37°C下温育16h后；图27催化基序的识别。使用五-His和抗04-抗体在Western印迹分析中检测纯化自鼠伤寒沙门氏菌313749的(^0114-把81^)财PglB的突变发生i)单独的CJ0114_His，ii)与 Cj PglB 表达的 CJ0114-His，ii i)与 Nt PglB 表达的 CJ0114_His，iv)与 Nt PglB職YG表达的 CJ0114-His ；B)CJ0114_His 的突变发生。v) CJ0114_HisN國，vi) CJ0114-HisN155Q，vii)CJO114-HisN173Q, viii)CJ0114-HisN179Q ;以及图28A) Western免疫印迹分析,用于检测09 0_抗原到具有抗-His抗体和抗_09的CJ0114-His的转移。CJ0114-His是在大肠杆菌E69中表达的(第i道和第iii道)以及在与Cj PglB(第ii道)或者Nt PglB(第iv道)相同的菌株中表达。或者在寡糖基转移酶的存在下，通过蛋白质特异性抗体(抗-His)和09特异性抗体两者来检测09。B)大肠杆菌09的结构。材料和方法细菌菌株，质粒和基因组DNA大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica sv. Typhimurium)菌株在LB中，于37°C下生长。在适当时将50iig/ml甲氧苄氨嘧啶和/或100 y g/ml氨苄青霉素加入培养基。将大肠杆菌DH5 a (Invitrogen) and XL-1 (Stratagene)用作克隆实验的宿主。鼠伤寒沙门氏菌(S. Typhimurium)菌株 SL3749 得自 Salmonella Genetic StockCentre (SGSC)。Nitratiruptor tergacus SB 155-2 的基因组 DNA 由 Japan Agency forMarine-Earth Science and Technology (JAMSTEC)的 Satoshi Nakagawa 提供。将质粒pMLBAD (I)和 pETBlue-1 (Novagen)用作克隆载体。质粒的构建N. tergacus pglB 直系同源基因使用引物 Nit pglB-F (5-AGGAATTCAGATGTATGTGCAAAAAAAG-3, EcoRI 位点加下划线显示)和 NitpglB-HA-R(ACAAACTAGT TTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTA
TTTGATTCTATAAATTTTCA-3，SpeI位点加下划线显示，HA-编码的序列加粗显示)使用Pfx聚合酶(Invitrogen)，由基因组DNA进行扩增。将所得到的扩增子使用EcoRI和SpeI进行切害I]，并且连接到EcoRI/Xbal-切割的pMLBAD，产生pMLNT2。空肠弯曲杆菌CjOl 14是从空肠弯曲杆菌(C. jejuni) 11168H基因组DNA中使用Pfx聚合酶扩增出来的，其使用引物CjOll4-F(5-ATGAAAAAAATATTCACAGTAGCTC-3)和 Cj0114-R(5_TTA GTGATGGTGATGGTGATGTTTTCTATTAGGTGAAGCTTTTG-3, 6xH-编码的序列加粗显示)，并随后在EcoRV-切割的PETBlue-I中进行平末端克隆。所有的载体通过限制性分析和测序进行确认。蛋白质表达为了检查PglBNT-HA的表达，将使用pMLNT2转化的大肠杆菌生长到对数中期，并且使用0.1%的阿拉伯糖诱导蛋白质表达4小时。将完整的细胞悬浮到Ix SDS-PAGE上样缓冲液中并加热到60°C持续20分钟。将细胞裂解液在10% Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)上进行分离,转移到硝酸纤维素上,并且使用抗-HA-HRP抗体(Roche)进行检测。对于Cj0114-His蛋白质的表达而言，在大肠杆菌中转化pET[CJ0114]，其生长到对数中期，并且使用ImM IPTG诱导蛋白质表达4小时。使用五组氨酸Ab (QIAgen)在全细胞裂解液中检测CJOl 14。在鼠伤寒沙门氏菌(S. Typhimurium)中表达和纯化蛋白质将鼠伤寒沙门氏菌SL3749使用pMLNT2和pET[CJ0114]进行转化，并且将200ml生长到对数中期(A6tltl 0. 5)。在200ml的培养物中在37°C下使用0. I %阿拉伯糖和ImM IPTG诱导蛋白质的表达16小时。离心后，将细菌团(bacterial pellet)使用IxBugBuster (Novagen)在裂解缓冲液(50mMNaH2P04，300mM NaCl，IOmM 咪唑)中进行裂解，所述的裂解缓冲液补加lmg/ml溶菌酶(Sigma)、1 U 1/ml Benzonase核酶(Novagen)和0. I %Tween-20。随后将清亮的裂解液与Iml Ni-NTA琼脂糖浆液(QIAgen)在搅拌下于4°C温育，并且随后加载到空的5ml聚丙烯柱上(Pierce)。将其用I柱体积的洗涤缓冲液(50mMNaH2PO4, 300mM NaCl，20mM咪唑，补加0. 1% Tween 20)洗涤5次，并且随后用500 U I的洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl，20mM咪唑，补加0. 1% Tween 20)洗脱4次。在通过 Western印迹分析纯化确认后，收集洗脱液并且将蛋白质使用Amicon Ultra_4CentrifugalFilter Unit使用Ultracel-10膜(Millipore)浓缩 10倍。将蛋白质通过BCA检测(Pierce)进行定量。蛋白酶K处理将2.5iig CJ0114-His 与 200ii g 蛋白酶 K 及 5mM CaCl 在 37°C下温育 16 小时。对照反应中使用水来替代蛋白酶K进行温育。CJOl 14-His 的 Western 免疫印迹检测将CJ0114-His样品溶解于12% Tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen)中并且转移到硝酸纤维素膜上。将膜在His封闭试剂(QIAgen)中于室温下封闭I小时并且随后使用抗-His-HRPd 5000在封闭试剂中，QIAgen)于室温下检测I小时。将所述的膜随后使用PBS-T/T (磷酸盐缓冲盐水，补加了 0. 05% Tween和0. 5% Triton)洗涤两次并且使用PBS洗漆一次，随后使用Amersham ECL Plus (GE Healthcare)检测His标签的蛋白质。(I)Lefebro 和 Valvano(2002)Construction and Evaluation of PlasmidVectors Optimized for Constitutive and Regulated Gene Expression inBurkholderia cepacia Complex Isolates, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY68(12),5956-5964。列出的全部多糖均可以潜在地缀合到CRM197上(用于当前批准的肺炎链球菌(S. pnemoniae)缀合物疫苗以及其他的糖缀合物的载体蛋白)。这是Diptheria毒素的无毒形式，并且具有天然存在的糖基化基序(442-DVNKS-446 ;参见图5，突出显示的基序)。为各个多糖提供了细菌特异性抗原的细节。这些可以潜在地为给定的有机体提供增强的免疫力(换言之，两全其美的是蛋白质和多糖为长期完全覆盖诱导免疫力)。还可以将来自一种有机体的多糖与来自不同的有机体的免疫原性蛋白组合，从而产生二联疫苗(或者如果将此在经合理减毒的疫苗递送菌株如沙门氏菌上进行的话，产生三联疫苗)。(三联疫苗的实例为旅行者腹泻的疫苗，其由在沙门氏菌或者EPEC减毒的载体菌株中偶联到霍乱毒素的宋内志贺菌(Shigella sonnei) 0抗原构成)。
在大肠杆菌中表达异源多糖的策略I.如果多糖生物合成的基因座的序列数据是可得的，使用长链高保真度聚合酶链式反应(PCR)来从基因组DNA中扩增该片段。将得到的扩增子使用常规克隆技术克隆到低拷贝数的质粒载体中，所述的质粒载体如PACYC184或者pBR322。在大肠杆菌(或替代细菌宿主)中表达多糖的成功通过使用对感兴趣的多糖特异性的抗体(如果可用的话)Western印迹分析来证实。2.对于其基因座未经确证的多糖的表达，或者对于PCR扩增不合适的情况，从基因组DNA中产生黏粒文库，并且筛选以鉴定包含多糖生物合成所需的遗传学信息的克隆。克隆多糖受体蛋白多肽受体底物可以通过PCR，使用高保真聚合酶进行扩增并且在表达载体即PETBlue中克隆。在ORF的3’末端掺入6X组氨酸的标签，从而便于蛋白质纯化。可以通过定点突变将D/E-X-N-S/T的基序加工到所克隆的ORF中。 生产重组的糖缀合物多肽的一般方法用于生产重组糖缀合物多肽的优先选择的宿主是大肠杆菌。其使用三种质粒进行转化i编码所述的多糖生物合成基因座的低拷贝数的质粒或者黏粒；ii编码糖受体蛋白的表达质粒，所述的糖受体蛋白包含至少一个D/E-X-N-S/T基序;iii pMLNT2 (编码 N. tergacus PglB).最初将重组的大肠杆菌在200ml_lL体积的LB肉汤中进行培养，所述的LB肉汤在合适的情况下添加选择性的抗生素。蛋白质表达在生长的对数中期进行诱导，并且细胞在16-37°C下表达4h-24h之后进行收获(各个糖缀合物优化的具体条件)。重组糖缀合物按照来自鼠伤寒沙门氏菌的CJ0114-His的纯化提到的方法进行纯化。糖基化按照Western印迹分析使用抗-His和特异性的抗-多糖的抗体进行证实。如果将替代细菌宿主用于糖缀合物的表达，遵守同样的方案，但是培养条件可以根据给定宿主的优化条件进行改变。实施例I诜择的抗原肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)来自在还原性末端具有葡萄糖或者半乳糖的血清型(即 1、2、3、6A、6B、7F、7A、7B、8、9A、9L、9N、9V、10F、10A、11F、11A、11B、11C、13、14、15F、15A、15B、15C、17F、17A、18F、18A、18B、18C、19F、19A、19B、19C、22F、23F、27F、29、31、32 、324、33 、338、34、35八、358、37)、这些血清型可以偶联于其上的荚膜肺炎链球菌(S. pneumoniae)蛋白质抗原包括肺炎链球菌溶血素(Pnemolysin)的无毒变体,其中在433位上的色氨酸突变成了苯丙氨酸。这之前显示出在小鼠中诱导免疫力，并且计划作为人接种的候选物[I]。该蛋白的序列包括五个N-X-S/T位点,所述的位点潜在地可以修饰成受体基序D/E-X-N-Y-S/T (参见附件3，突出显示的基序)。其他的肺炎链球菌免疫原包括PspA、PspC和PsaA [2，3](参见附件3，潜在的部分基序是突出显示的)。猪链球菌(Streptococcus suis)荚膜.尽管其结构尚未确定，该荚膜区已经在基因组中得到鉴定。猪链球菌免疫原包括烯醇酶(Enolase)、Sao、HP0197、RfeA、ESA、IBP、SLY和 38-kDa 的蛋白质[4，5，6，7，8]。B组链球菌(无乳链球菌)所有的九种人血清型(Ia，Ib, II，III，IV，V，VI，VII，VIII)在还原性末端具有葡萄糖。GBS蛋白抗原包括ScpB、C蛋白质的0-组分、1^11* 、51 、LrrG、SAG1408, SAG0645, SAG0649, BibA 和 Alp 蛋白质家族(a、Rib、R28 和 Alp2) [9，10，11](参见附件5)。针对GBS的建议的疫苗策略是对未怀孕的青少年进行免疫，并且可以因此将其潜在地连接到HPV的衣壳蛋白从而得到二联疫苗(参见附件6，来自当前在英国用作GSK疫苗的HSV类型的衣壳蛋白的氨基酸序列)。还有可能针对定居在反刍动物乳腺并影响乳的质量和数量的菌株开发疫苗(可以连接到来自其他的细菌的抗原，所述的细菌还在乳品场引起乳腺炎，例如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌(Staph aureus)、乳房链球菌(Strep.Uberis)和停乳链球菌(Strep. Dysgalactiae)。海豚链球菌(streptococcus iniae)(鱼的病原体)-在兽医学上有着全球性的重要性并且有对疫苗的需求。没有关于荚膜的结构性信息，但是基因显示与无乳链球菌 (S. agalatiae)有一些同源性。潜在的蛋白质抗原包括M-样蛋白质SimA和SpcI [12,13]。克雷伯菌属(Klebsiella spp.)克雷伯菌的77个荚膜血清型和70抗原多种血清型K。克雷伯菌的蛋白免疫原包括I型和3型菌毛的主要结构蛋白。外膜蛋白0mpA、0mpW、0mpK17、0mpK36 和 F印A。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa):产生A-和B-级的0_抗原。A级在还原性末端具有鼠李糖，B级有10个血清型，多数是FucNAc，三个Rha，I个Rib。还产生在还原性末端具有Man的胞外多糖，并且铜绿假单胞菌蛋白抗原包括毒素和外膜蛋白。实施例2使用04-特异性的抗血清(小鼠的单克隆[1E6]，ab8274，abeam UK)确认鼠伤寒沙门氏菌的特异性转移CJOlH-His和Nt PglB在鼠伤寒沙门氏菌SL3749 (waaL_)中进行表达。CJ0114-His在变性条件(SM尿素)下通过Ni-NTA亲和进行纯化，并且将该纯化的样品通过SDS-PAGE进行分离，转移到硝酸纤维素膜上并且使用抗-His和抗-04抗体进行检测。鼠伤寒沙门氏菌04检测为具有聚合物梯状结构，分子量大于未经修饰的CJ0114-His蛋白，图26B。为了证实将0-抗原结合到蛋白质，将样品使用蛋白酶K进行处理。在所处理的样品中未识别有04-反应性的物种，这表明0-抗原连接到蛋白质。实施例3活性位点的识别以及N-联转移的确认a.关键的寡糖基转移酶基序(WffDYG)在Nt PglB中通过定点突变，突变成WAAYG。将野生型或者经突变的Nt PglB酶与CJO114-His在鼠伤寒沙门氏菌SL3749中进行表达，并且随后将CJOl 14-His在变性条件下进行纯化，并且通过Western印迹使用抗-His和抗-04进行检测。鼠伤寒沙门氏菌04仅当CJ0114-His和野生型Nt PglB共表达时被检测到，图27。468WAAYG472的突变体不能将0-抗原转移到蛋白质，这表明Nt PglB作为N-联寡糖基转移酶发挥特异性功能。b.为了进一步地检查Nt PglB的特异性，将CJ0114_His受体蛋白质的四个D/E-X-N-X-S/T受体序列肽段(位于氨基酸位置101、155、173和179)中的每个突变成D/E-X-Q-X-S/T。将经突变的CJ0114-His蛋白质与Nt PglB在鼠伤寒沙门氏菌SL3749中表达，并且通过Western印迹使用抗-His和抗-04抗体来检测04 0-抗原的转移。0抗原到蛋白质的转移在三个经突变的受体蛋白质中检测(N101Q，N155Q和N179Q)但是当使用CJ0114-HisN179Q作为受体蛋白时没有，这表明仅有mDSNST175序列子是由Nt PglB所使用的。这还确认了糖是通过天冬氨酸残基连接到蛋白质的(即特异性地N-联转移)。实施例4除了鼠伤寒沙门氏菌04，Nt PglB能够转移大肠杆菌09(参见图28A)。将NtPglB或者Cj PglB与CJOl 14-His在大肠杆菌E69(09K30)中进行表达，并且随后纯化CJ0114-His。09转移到CJ0114-His通过Western免疫印迹，使用抗-His抗体和抗-09进行确认。在此菌株中09 0-抗原的还原性末端糖是N-乙酰基葡萄糖胺，其之前显示为CjPglB的底物。该结果表明这两种寡糖基转移酶在特异性上具有类似之处，也有差别。参考文献[I]Alexander et al. 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1.ー种使用载体转化的微生物细胞，所述的载体含有选自以下的核苷酸序列 i)由如图Ia表示的核酸序列组成的核酸分子； ii)由在严格的杂交条件下与(i)中的核酸分子杂交的核酸序列所组成的核酸分子并且该核酸序列编码多肽；其中所述的细胞表达重组多肽，该重组多肽是所述的寡糖基转移酶的底物。
2.根据权利要求I所述的微生物细胞，其中所述的细胞使用核酸分子进行转化，所述的核酸分子包含核苷酸序列，所述的核苷酸序列编码如图Ib中的氨基酸序列表示的寡糖基转移酶多肽；或者编码变体多肽，且所述的变体多肽包含经修饰的图Ib所表示的氨基酸序列，所述修饰是通过至少ー个氨基酸残基的缺失、添加或取代进行并且所述的经修饰的氨基酸序列保持或者增强了寡糖基转移酶活性。
3.根据权利要求I或2所述的微生物细胞，其中所述的载体是表达载体，该表达载体适合表达编码寡糖基转移酶多肽的核酸分子。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的微生物细胞，其中所述的重组多肽包含至少ー个由以下氨基酸序列构成的肽基序Asp/Glu-Xaa1-Asn-Xaa2-SerAhr 其中Xaa1和Xaa2是除脯氨酸之外的任意氨基酸。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的微生物细胞，其中所述的重组多肽是从传染性病原体中分离的抗原。
6.根据权利要求5所述的微生物细胞，其中所述的传染性病原体是细菌性病原体。
7.根据权利要求5或者6所述的微生物细胞，其中所述的病原体选自肺炎链球菌、猪链球菌、海豚链球菌(streptococcus inae)、无乳链球菌、停乳链球菌、马链球菌、乳房链球菌、米勒链球菌组(SMG)、血链球菌、牛链球菌、链球菌A组、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、植生克雷伯菌(Klebsiella planticola)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerunginosa)、鲍氏不动杆菌(Acinetobcater baumanii)、醋酸I丐不动杆菌、伤寒沙门菌(Salmonellaenterica serovar Typhi)、空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌、红嘴E|弯曲杆菌、流感嗜血杆菌、幽门螺旋杆菌、脑膜炎双球菌、淋病奈瑟菌、乳酰胺奈瑟菌、志贺菌属、葡萄球菌属、艰难梭状芽胞杆菌、肉毒杆菌、炭疽杆菌、类鼻疽伯克霍尔德氏菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌、乳酸杆菌属、破伤风杆菌、白喉棒状杆菌、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、大肠杆菌、结核分枝杆菌、百日咳博德特氏菌、胸膜肺炎放线杆菌，病毒衍生的抗原，例如人乳头瘤病毒(HPV)、甲型肝炎、こ型肝炎、轮状病毒以及流感病毒、得自寄生虫如恶性痕原虫(Plasmodium faciparum)的抗原。
8.根据权利要求7所述的微生物细胞，其中所述的病原体选自表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、头状葡萄球菌、解糖葡萄球菌、耳葡萄球菌、模仿葡萄球菌、腐生性葡萄球菌、科氏葡萄球菌、木糖葡萄球菌、科氏葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、猪葡萄球菌、山羊葡萄球菌、鸡葡萄球菌、中间葡萄球菌、人葡萄球菌。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的微生物细胞，其中所述的寡糖基转移酶多肽使用荚膜(K)抗原修饰所述重组多肽。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的微生物细胞，其中所述的寡糖基转移酶多肽使用荚膜O抗原修饰所述重组多肽。
11.根据权利要求1-8中任一项所述的微生物细胞，其中所述的寡糖基转移酶多肽使用胞外多糖/表面多糖修饰所述重组多肽。
12.根据权利要求6或7所述的微生物细胞，其中所述的重组抗原多肽包含氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列，或者由氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自图4a_4e中表示的序列，其中所述的变体是图4a_4e中表示序列的至少ー个氨基酸残基的缺失、取代或添加。
13.根据权利要求6或7所述的微生物细胞，其中所述的重组抗原多肽包含氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列，或者由氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自图5中表示的序列，其中所述的变体是图5中表示序列的至少ー个氨基酸残基的缺失、取代或添加。
14.根据权利要求6或7所述的微生物细胞，其中所述的重组抗原多肽包含氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列，或者由氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自图6a_6g中表示的序列，其中所述的变体是图6a_6g中表示序列的至少ー个氨基酸残基的缺失、取代或添加。
15.根据权利要求6或7所述的微生物细胞，其中所述的重组抗原多肽包含氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列，或者由氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自图7a-7m中表示的序列，其中所述的变体是图7a_7m中表示序列的至少ー个氨基酸残基的缺失、取代或添加。
16.根据权利要求6或7所述的微生物细胞，其中所述的重组抗原多肽包含氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列，或者由氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自图8a_8i中表示的序列，其中所述的变体是图8a_8i中表示序列的至少ー个氨基酸残基的缺失、取代或添加。
17.根据权利要求6或7所述的微生物细胞，其中所述的重组抗原多肽包含氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列，或者由氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自图9a或9b中表示的序列，其中所述的变体是图9a或9b中表示序列的至少ー个氨基酸残基的缺失、取代或添加。
18.根据权利要求5所述的微生物细胞，其中所述的重组抗原多肽包含氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列，或者由氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自图IOa或IOb中表示的序列，其中所述的变体是图IOa或IOb中表示序列的至少ー个氨基酸残基的缺失、取代或添加。
19.根据权利要求6或7所述的微生物细胞，其中所述的重组抗原多肽包含氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列，或者由氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自图Ila-Ilk中表示的序列，其中所述的变体是图Ila-Ilk中表示序列的至少ー个氨基酸残基的缺失、取代或添加。
20.根据权利要求6或7所述的微生物细胞，其中所述的重组抗原多肽包含图12中表示的氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列，或者由图12中表示的氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列组成，其中所述的变体是图12中表示序列的至少ー个氨基酸残基的缺失、取代或添加。
21.根据权利要求6或7所述的微生物细胞，其中所述的重组抗原多肽包含氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列，或者由氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自图13a-131中表示的序列，其中所述的变体是图13a-131中表示序列的至少ー个氨基酸残基的缺失、取代或添加。
22.根据权利要求6或7所述的微生物细胞，其中所述的重组抗原多肽包含图14中表示的氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列，或者由图14中表示的氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列组成，其中所述的变体是图14中表示序列的至少ー个氨基酸残基的缺失、取代或添加。
23.根据权利要求6或7所述的微生物细胞，其中所述的重组抗原多肽包含氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列，或者由氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自图15a-15f中表示的序列，其中所述的变体是图15a-15f中表示序列的至少ー个氨基酸残基的缺失、取代或添加。
24.根据权利要求6或7所述的微生物细胞，其中所述的重组抗原多肽包含氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列，或者由氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自图16a-16f中表示的序列，其中所述的变体是图16a-16f中表示序列的至少ー个氨基酸残基的缺失、取代或添加。
25.根据权利要求6或7所述的微生物细胞，其中所述的重组抗原多肽包含图17中表示的氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列，或者由图17中表示的氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列组成，其中所述的变体是图17中表示序列的至少ー个氨基酸残基的缺失、取代或添加。
26.根据权利要求6或7所述的微生物细胞，其中所述的重组抗原多肽包含图18中表示的氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列，或者由图18中表示的氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列组成，其中所述的变体是图18中表示序列的至少ー个氨基酸残基的缺失、取代或添加。
27.根据权利要求6或7所述的微生物细胞，其中所述的重组抗原多肽包含图19中表示的氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列，或者由图19中表示的氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列组成，其中所述的变体是图19中表示序列的至少ー个氨基酸残基的缺失、取代或添加。
28.根据权利要求6或7所述的微生物细胞，其中所述的重组抗原多肽包含氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列，或者由氨基酸序列或者其抗原部分或者变体氨基酸序列组成，所述的氨基酸序列选自图20a-20c中表示的序列，其中所述的变体是图20a-20c中表示序列的至少ー个氨基酸残基的缺失、取代或添