具有表面蛋白简化糖基化的病毒颗粒的生产方法技术领域：】[0005]本发明涉及病毒且具体涉及具有简化聚糖(simplifiedglycans)的病毒颗粒的生产。具体地，本发明涉及具有简化糖基化的流感病毒颗粒的生产。具体地，本发明涉及单糖基化流感病毒颗粒的生产方法。【背景技术：】[0006]本发明公开了单糖基化(mono-glycosylated)流感病毒的示例性制备。认为相同方法可用于制备具有简化聚糖结构的其他病毒，包括逆转录病毒(如人免疫缺陷病毒(HIV))和黄病毒(如登革病毒、西尼罗病毒、丙肝病毒(HCV)等)。[0007]流感是由正粘病毒科的RNA病毒导致的。这些病毒有3种类型且它们导致3种不同类型的流感:A、B和C型流感。A型流感病毒感染哺乳动物(人、猪、雪紹、马)和禽类。由于此类病毒已导致世界范围的疾病大流行，其对人类非常重要。B型流感病毒(也简称做流感B)仅感染人类。其偶尔导致流感的局部爆发。C型流感病毒也仅感染人类。它们感染大多数年轻人且很少导致严重的疾病。[0008]A型流感病毒感染种类繁多的哺乳动物，包括人、马、猪、雪貂和禽类。该主要的人类病原体与时疫和疾病大流行相关。有至少15种已知的血凝素(H)血清型和9种已知的神经氨酸酶(N)血清型。认为猪和禽类是特别重要的储存宿主，产生了在遗传和抗原性方面不同的病毒库，其通过人与动物之间的亲密接触而反向传播至人群。B型流感病毒仅感染哺乳动物且导致疾病，但通常不如A型严重。与A型流感病毒不同，B型流感病毒没有可区分的血清型。C型流感病毒也仅感染哺乳动物，但很少导致疾病。它们在遗传和形态学上不同于A型和B型。[0009]流感病毒中存在4种抗原:血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核壳体(NA)、基质(M)和核壳体蛋白(NP)。NP是以A、B和C三种形式存在的类型特异性抗原，其提供了人流感病毒的分类基础。基质蛋白(M蛋白)环绕核壳体且构成35-45%的颗粒质量。在表面上观察到呈棒状突起的两种表面糖蛋白。血凝素(HA)首先合成为包含三条相同蛋白链的三聚前体(HAO)，其中每条蛋白链经蛋白水解加工成通过单个二硫键共价结合在一起的两个亚基HAl和HA2。HA介导病毒与细胞受体的附着。神经氨酸酶(NA)分子以较少的量存在于外壳中。流通的人类株因其常年累积突变并导致周期性时疫的趋势而众人皆知。[0010]在真核生物中，糖残基通常与4种不同的氨基酸残基相连。这些氨基酸残基分类为0-连接(丝氨酸、苏氨酸和羟赖氨酸)和N-连接(天冬酰胺)。0-连接糖在高尔基体或粗内质网(ER)从核苷酸糖合成而来。N-连接糖由常见前体合成，随后进行加工。已知N-连接糖链的添加对于稳定折叠、预防内质网中的降解、寡聚化、生物活性和糖蛋白的运输具有重要意义。向特定的Asn残基添加N-连接的寡糖在调控病毒成熟蛋白的活性、稳定性或抗原性中发挥重要作用(OpdenakkerG.等人FASEBJournal7,1330-13371993)。现在也已提出N-连接的糖基化是折叠、运输、细胞表面表达、糖蛋白分泌(Helenius,A.，MolecularBiologyoftheCell5，253-2651994)、防止蛋白降解和增强糖蛋白溶解性(Doms等人，Virologyl93，545-5621993)所需的。病毒表面糖蛋白不仅是正确的蛋白折叠所需的，而且还提供了对抗中和抗体的“聚糖防御物”的保护作用。因此，强宿主特异性选择经常与潜在N-连接糖基化的密码子位置相关。因此，N-连接糖基化位点在株间和进化枝之间趋于保守。[0011]A型流感病毒暴发不断在全世界导致普遍的发病和死亡。仅在美国，估计每年有5-20%的人口被A型流感病毒感染，导致约200，000例住院治疗和36，000例死亡。全面免疫政策的建立已成为限制流感发病率的有效方法。然而，病毒的频繁遗传漂变需要每年重新配制疫苗，潜在地造成疫苗中存在的病毒株与流行的病毒株之间的不匹配。因此，抗流感病毒的抗病毒疗法是限制疾病严重性和传播的重要工具。[0012]自2003年，高致病性H5N1流感病毒已导致在家禽和野生禽类中爆发疫情(LiKS等人(2004)Nature430:209-213)。从2010年2月起，这些病毒不仅感染禽类，而且还感染了超过478例人类,其中286例证实是致死的(www.wh0.1nt/csr/disease/avian_influenza/country/cases_table_2010_02_17/en/index.html)。高致病性H5N1和2009年的猪源A型流感(HlNl)病毒已导致全球性暴发并引起极大的担心，即病毒可能发生进一歩的改变，从而带来致命的疾病大流行(GartenRJ,等人(2009)Science325:197-201；NeumannG,等人(2009)Nature459:931-939)。还高度担心的是，流感病毒可能获得在人际之间有效传播的能力，从而成为大流行病的威胁。因此，流感疫苗必须成为任何大流行病预防计划的完整部分。[0013]理解流感感染的重要贡献来自于对血凝素(HA)的研究，HA是病毒外壳糖蛋白，其结合到呼吸道中的特异唾液酸化的聚糖受体，从而允许病毒进入细胞(KuikenT,等人(2006)Science312:394-397;MainesTR,等人(2009)Science325:484-487;SkehelJJ,WileyDC(2000)AnnRevBiochem69:531-569；vanRielD,等人(2006)Science312:399-399)。为了跨越种间屏障并感染人群，禽HA必须将其受体结合偏好由包含a2，3(禽)-连接的末端唾液酸化聚糖改变为a2，6(人)-连接的唾液酸基序(ConnorRJ,等人(1994)Virology205:17-23)，且这种转换仅通过两个突变即可发生，例如在1918流感大流行中的情形(TumpeyTM,等人(2007)Science315:655-659)。因此，理解影响流感结合聚糖受体的因素对于开发用于控制具有大流行可能性的任何未来交叉流感株的方法至关重要。[0014]流感病毒血凝素(HA)是同源三聚跨膜蛋白，带有由球状头部和干区组成的胞外域(KuikenT,等人(2006)Science312:394-397)。这两个区域都携带N-连接的寡糖(KeilW,等人(1985)EMBOJ4:2711-2720)，其影响HA的功能性质(ChenZY,等人(2008)Vaccine26:361-371；0huchiR,等人(1997)JVirol71:3719-3725)。HA是病毒体表面糖蛋白，其将病毒连接到其宿主细胞上的受体并使病毒外壳与内吞膜泡的膜融合以启动感染过程。(CreceliusD.M.,等人(1984)Virologyl39,164-177)。HA还是刺激保护性抗体形成的病毒体组分。HA糖基化的性质和程度牵涉到改变其受体结合性质以及具有增强的致细胞病性(AytayS.，Schulze1.T.(1991)J.Virol.65，3022-3028)和毒力(DeshpandeK.L.，等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.84，36-40)的病毒变体的出现以及隐藏其抗原位点(SkehelJ.J.,等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.81，1779-1783)。HA糖基化位点的突变删除会影响病毒受体结合(GuntherI,等人(1993)VirusRes27:147-160)。[0015]HA的氨基酸序列和由此产生的其N-糖基化位点的定位由病毒基因组決定。这些寡糖的结构似乎由其在HA上的位置(KeilW.,等人(1985)EMBOJ.4，2711-2710)以及由病毒生长其中的宿主细胞提供的生物合成和修饰的酶决定的。病毒基因组的可塑性和宿主特异性的糖基化机制能够共同产生出病毒群，这些病毒群在结构和功能上比任一过程单独产生的更为异质性。认为这种多样性是这些病毒存活以及克服中和抗体和抗病毒剂的抑制作用的能力的原因。[0016]HA似乎具有一些必须被糖基化的区域，一些必须不含寡糖的区域，还有ー些区域，其中的糖基化对病毒的存活有利或有害。分离自多种动物和人的A型流感病毒HA上的某些位置的糖基化位点高度保守，因此，可能是形成和/或維持功能性HA所必需的(GallagherP.J.，等人(1992)J.Virol.66，7136-7145)。相反地，HA某些区域内糖基化位点的产生降低了其向细胞表面的运输及其稳定性和/或功能(GallagherP.，等人(1988)J.CellBiol.107，2059-2073)。依赖于病毒预期生长的特异环境，在其中糖基化既不被功能性HA形成抑制也不被功能性HA形成所需的区域中，寡糖多祥性可具有主要的选择作用。[0017]肽序列在糖基化位点上或其附近的变化可改变HA的三维结构，并由此改变受体结合特异性和亲和カ。实际上，来自不同H5N1亚型的HA具有不同的聚糖结合模式(StevensJ,等人(2008)JMolBiol381:1382-1394)。已在完整病毒系统中研究了Hl和H3上糖基化位点的诱变(ChandrasekaranA,等人(2008)NatBiotechnol26:107-113；DeomCM,等人(1986)ProcNatlAcadSciUSA83:3771-3775)。糖基化变化可影响受体结合特异性和亲和力，特别是对大多数致病性H5N1HA。[0018]血凝素中糖基化较低或无糖基化的区域持续突变以逃避宿主免疫系统。使用单糖基化HA的疫苗设计公开于美国专利申请公开N0.2010/0247571(Wong等人)。因此，需要用于生产单糖基化流感病毒颗粒的新颖且有效的方法。【
发明内容】[0019]本文的公开提供了生产单糖基化流感病毒的示例性证明。所公开的方法同样可应用于生产在结构蛋白上具有简化聚糖的病毒。一旦将存在于这些位点的糖基化模式简化为単-、二-、三-或其他糖基化区域，具有高糖基化的结构蛋白的保守区域即可成为疫苗设计的靶标。[0020]具体地，需要可用于疫苗生产方法的设计和验证的交叉中和单克隆抗体，所述疫苗生产方法維持或增强目前和将来所生产的疫苗中交叉中和表位的质量和抗原性。假设抗体结合抗原是结构完整性和抗原性潜力的反映，可尝试结合交叉中和抗体，例如单糖基化HA多肽，并定量评估其交叉中和潜力。预期所生成的抗流感HA单糖基化衍生物的疫苗提高了对通用表位的免疫原性。[0021]通过部分除去病毒糖蛋白的糖以暴露糖基化位点(其高度保守且不突变或不攻击性地突变)，同时保留足够的糖以保留糖蛋白的三级结构，从而产生抗原。通过将糖蛋白部分脱糖基化而产生部分糖基化的病毒糖蛋白，从而使特定的糖基化位点保留1、2或3个糖単元。在ー些方面，可通过在ー个或多个特定糖基化位点提供脱糖基化的蛋白或多肽并在糖基化位点连接单_、二-或三糖而产生部分糖基化的糖蛋白。[0022]所公开的疫苗包含至少ー个部分糖基化的HA糖蛋白和药学可接受的载体。在一些实施方式中，所述部分糖基化的HA糖蛋白选自部分糖基化的流感病毒H1、H3和H5组成的组。[0023]所公开的方法包括向易患流感的受试者施用包含至少ー种脱糖基化的HA糖蛋白和药学可接受的载体的疫苗。在一些实施方式中，所述脱糖基化的HA糖蛋白选自H1、H3和H5组成的组。[0024]在一些实施方式中，脱糖基化在糖蛋白的一个或多个糖基化位点留下单糖基化(保留ー个糖)。在一些实施方式中，脱糖基化在糖蛋白的至少ー个糖基化位点留下二糖基化(保留2个糖)。在一些实施方式中，脱糖基化在糖蛋白的一个或多个糖基化位点留下三糖基化(保留3个糖)。在一些实施方式中，脱糖基化在糖蛋白的至少ー个糖基化位点留下单糖基化、二糖基化和三糖基化中的至少ー种。[0025]在一些实施方式中，流感HA抗原是在细胞培养物中重组生产的。细胞培养物包括MDCK细胞、Vero细胞或PER.C6细胞。向带有重组流感HA抗原的宿主细胞添加基夫碱(kifunensine)。[0026]在ー些方面，抑制a-甘露糖苷酶I产生带有Man9(GlcNAc)2的糖蛋白。[0027]在其他实施方式中，流感HA抗原包括完整流感病毒。所述完整流感病毒生长在无特异病原的(SPF)含胚鸡蛋宿主中。[0028]随后，向无特异病原的(SPF)含胚鸡蛋的尿囊腔添加基夫碱。[0029]在ー些方面，以0.005至0.5mg/ml的浓度添加基夫碱。[0030]使用约0.1至约100ug/mLEndoH处理回收的流感病毒HA抗原。[0031]在ー些方面，通过包括密度梯度超速离心的方法分离单糖基化流感病毒。[0032]在ー些方面，所述方法还包括利用包括超滤的方法纯化单糖基化流感病毒HA抗原。在一些实施方式中，所述超滤包括使用0.2iim滤器。[0033]在ー些方面，所述方法还包括通过电子显微镜分析所述单糖基化流感病毒。[0034]在ー些方面，所述方法还包括通过包括PNGase(肽-N4-(N-乙酰-P-D-葡糖胺基)天冬酰胺酰胺酶)处理的方法量化所述单糖基化流感病毒。在ー些方面，所述方法还包括通过包括SDS-PAGE电层析的方法量化所述单糖基化流感病毒。[0035]在ー些方面，所述方法还包括通过包括质谱的方法分析所述分离的单糖基化流感病毒的聚糖组成。[0036]本发明涉及通过本文公开的任何方法制备的单糖基化流感病毒HA抗原(完整病毒或重组体)。[0037]本发明涉及通过本文公开的任何方法制备的单糖基化流感病毒HA抗原(完整病毒或重组体)用于制备疫苗的应用。[0038]本发明的这些和其他方面通过结合以下附图的以下优选实施方式的描述而变得明显，尽管可影响其中的变化和改变而不脱离本公开新概念的精神和范围。[0039]以下附图构成本申请说明书的一部分，并且包含在本申请中以进ー步证明本申请公开的某些方面，通过參考这些附图中的一幅或多幅并结合本文提供的的详细说明，可更好地理解本发明。此专利或申请文件包含至少ー副彩图。专利局将在提交请求并缴纳必要的费用后提供带有彩色附图的此专利或专利申请公开的副本。[0040]图1:显示了单糖基化NIBRG-14病毒的制备。(图1A)病毒生长在不同浓度的N-糖基化加工抑制剂(基夫碱)中。(图1B)利用不同浓度的EndoH将高甘露糖糖基化病毒消化成单糖基化病毒。(图1C)与纯化的完全糖基化病毒相比，纯化的单糖基化病毒具有HAl和HA2二者的显著下调。使用抗H5HA兔抗血清,通过Western印记分析来分析这些样品。[0041]图2:显示了完全糖基化和单糖基化病毒的电子显微照片。(图2A)完全糖基化的NIBRG-H0(图2B)单糖基化的NIBRG-14。使用2%甲胺钨酸盐使病毒颗粒染色，并利用透射电子显微镜进行分析。[0042]图3:显示了血凝素的量化。通过PNGaseF脱糖基化HAl在SDS-PAGE中的密度测定NIBRG-14病毒的血凝素的量。[0043]图4:显示了单糖基化NIBRG-14血凝素的糖肽分析。(图4A)NIBRG_14血凝素的糖基化位点由氨基酸残基编号标记。此结构由PDB编码Ijsm产生，且糖基化位点的颜色为红色。(图4B)单糖基化NIBRG-14血凝素的糖肽分析。在EndoH降解后，大多数糖基化位点是单糖基化的，但糖基化位点295和489仍部分(〈10%)高甘露糖糖基化。[0044]本申请说明书中使用的术语在本发明上下文中，以及在每ー个术语使用的具体语境中通常具有其在本领域中的通常含义。下文或本说明书其他部分讨论了用于描述本发明的某些术语，以向专业人士提供关于本发明描述的额外指导。为了方便起见，例如使用斜体字和/或引号突出显示某些术语。突出显示的应用不影响术语的范围和含义；在相同的语境中，无论是否突出显示，术语的范围和含义是相同的。可理解，相同的事物可通过不止一种方式进行表达。[0045]因此，可对本文讨论的任意一个或多个术语使用替代的用语和同义词，不管某个术语在本文中是否经过详尽描述或讨论，没有ー个具有任何更特殊的重要性。提供了某些术语的同义词。详述ー个或多个同义词并没有排除其他同义词的应用。本说明书各处示例的使用，包括本文讨论的任何术语的示例，都仅是说明性的，不以任何方式限制本发明或任何示例术语的范围和意义。同样，本发明不局限于本说明书中提供的各种实施方式。[0046]除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。在有冲突的情况下，以本文，包括定义为准。以下文献为技术人员提供了本发明中使用的很多术语的通用定义=Singleton等人，DictionaryofMicrobio丄ogyandMolecularBiology(2ndEd.1993)；TneCambridgeDictionaryofScienceandTechnology(Walkered.,CambridgeUniversityPress.1990)；TheGlossaryofGenetics,5thed.，R.Rieger等人(eds.),SpringerVerlag(1991)；和Hale&Margham,TheHarperCollinsDictionaryofBiology(1991)。[0047]通常，本文所公开的与细胞和组织培养、分子生物学以及蛋白质和寡-或多核苷酸化学和杂交相关的术语和技术所使用的命名法是本领域公知且常用的那些。使用标准技术进行重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养以及转化(如电穿孔、脂质体转染)。根据制造商的说明或按照本领域通常执行的或按照本文所述的进行酶反应和纯化技木。除非专门给出相反的指示，本发明的实施将采用本领域技术之内的病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法，出于说明目的，下文对其中一些进行了描述。此类技术详述于文献中。參见，例如Sambrook,等人MolecularCloning:ALaboratoryManual(2ndEdition,1989)；Maniatis等人MolecularCloning:ALaboratoryManual(1982);DNACloning:APracticalApproach,vol.1&II(D.Glover,ed.)；OligonucleotideSynthesis(N.Gait,ed.,1984)；NucleicAcidHybridization(B.Hames&S.Higgins,eds.,1985)!TranscriptionandTranslation(B.Hames&S.Higgins,eds.,1984)；AnimalCellCulture(R.Freshney,ed.,1986);Perbal1APracticalGuidetoMolecularCloning(1984)。[0048]术语“A亚型流感”或“A亚型流感病毒”可互換使用，是指以血凝素⑶病毒表面蛋白为特征的A型流感病毒变体，因此，以H数字进行标记，例如，H1、H3和H5。此外，还可通过神经氨酸酶(N)病毒表面蛋白进ー步表征所述亚型，标示为N数字，例如NI和N2。这样，亚型可由H和N数字二者标示，例如H1N1、H5N1和H5N2。所述术语特异性地包括每种亚型内的所有株(包括灭绝株)，其通常源自突变且显示不同的致病谱。此类株还可标示为病毒亚型的各种“分离物”，包括过去、现在和将来的所有分离物。因此，在本文中，术语“株”和“分离物”可互換使用。亚型包含基于A型流感病毒的抗原。所述抗原可基于血凝素病毒表面蛋白，并可称为“HA抗原”。在一些情况下，此类抗原基于具体亚型的蛋白，例如Hl亚型和H5亚型，其可分别称为Hl抗原和H5抗原。[0049]本公开中使用的术语“脱糖基化”或“部分糖基化”蛋白是指已从完全糖基化情形的蛋白的聚糖结构除去一个或多.个糖的蛋白，其中，所述蛋白基本保留了其天然构象/折叠。“脱糖基化”蛋白包括部分糖基化蛋白，其中所述脱糖基化处理在存在于糖蛋白的ー个或多个糖基化位点留下单糖基化、二糖基化或三糖基化。[0050]“部分糖基化”蛋白包括“脱糖基化”蛋白，其中在各糖基化位点保留ー个或多个糖，且与完全糖基化情形的糖蛋白中的位点相比，各部分糖基化位点包含的聚糖结构较小(包含较少的糖単元)，且所述部分糖基化蛋白基本保留其天然构象/折叠。通过完全糖基化情形的糖蛋白的至少ー个糖基化位点的聚糖结构的部分脱糖基化产生“部分糖基化”蛋白。还通过在蛋白的无糖基化位点引入糖基化，以使添加的糖基化序列小于完全糖基化情形的糖蛋白中该位点的聚糖结构，从而产生“部分糖基化”蛋白。还通过合成病毒糖蛋白序列或其片段，在所述序列的糖基化位点引入糖基化的氨基酸単元(例如，GlcNAc-精氨酸半体)，以使所添加的聚糖结构小于完全糖基化情形的糖蛋白中该位点的聚糖结构，从而产生“部分糖基化”蛋白。[0051]病毒传播起始于位于流感病毒外売上的血凝素(HA)糖蛋白与位于宿主细胞表面上的含唾液酸(SA)聚糖之间的关键相互作用。为了说明HA糖基化在此重要相互作用中的职责，制备了各种指定的HA糖型，并通过使用合成SA微阵列研究了它们的结合亲和カ和特异性。HA上N-聚糖结构的截短提高了SA结合亲和力，同时降低了对不同SA配体的特异性。定量剖析了SA配体结构内的各单糖和硫酸基对HA结合能的贡献。发现硫酸基使完全糖基化HA的结合能几乎加大了100倍(2.04kcal/mol)，二分支聚糖对单糖基化HA糖型也是如此。与由完全糖基化HA激发的抗体相比，针对在各糖基化位点仅带有单个N-连接GIcNAc的HA蛋白的抗体显示了对流感亚型更好的结合亲和性和中和活性。因此，除去病毒表面糖蛋白上结构非必要性的具糖是用于针对流感和其他人病毒的疫苗设计的非常有效且通用的途径。[0052]多肽的糖基化通常为N-连接或0-连接。N-连接是指糖半体连接到天冬酰胺残基的侧链。“序列子”是蛋白中3个连续氨基酸的序列，其可充当所谓N-连接-聚糖的多糖(糖)的连接位点。这是通过天冬酰胺侧链中的氮原子连接到蛋白的多糖。序列子是Asn-Xaa-Ser或Asn-Xaa-Thr,其中Xaa是脯氨酸之外的任意氨基酸。因此，多肽中这些三肽序列中任何ー个的存在产生了潜在的糖基化位点。0-连接的糖基化是指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸的连接，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。尽管序列子Asn-X-Ser/Thr是N-连接寡糖与糖蛋白的连接所绝对需要的(MarshallRD,BiochemicalSocietySymposia40,17-261974),但其存在不总是导致糖基化，而且糖蛋白中的ー些序列子会保持未糖基化(CurlingEM,等人，BiochemicalJournal272,333-3371990)。[0053]本发明的ー个方面是生产具有简化糖结构的非天然糖蛋白的方法。[0054]因此，所述方法可引用于逆转录病毒，例如HIV;黄病毒，例如丙肝病毒，登革病毒和西尼罗病毒等。[0055]人免疫缺陷病毒(HIV)的受体结合包膜蛋白gpl20的分子量的约一半由N-连接聚糖组成。这些聚糖中，近半数为高甘露糖型。这些高甘露糖聚糖在病毒表面提供了甘露糖残基的密林，使HIV成为了与免疫系统的甘露糖特异性凝集素相互作用的首要靶标。[0056]丙肝病毒(HCV)包膜糖蛋白是高度糖基化的，在El和E2上通常分别带有4和11个N-连接聚糖。多种聚糖在HCVcc组装和/或传染カ中发挥重要作用。E2上的至少5个聚糖(标示为￡2附』2吧、￡2财』2邮和￡2附1)强烈降低HCV对抗体中和的敏感性(HelleF等人，JVirol.2010Nov;84(22):11905-15)。[0057]大多数黄病毒的E蛋白在153/154残基被Asn-连接糖基化修饰，在4种登革病毒(DENV)血清型的情况下，由残基67的第二聚糖修饰。在登革病毒中，E蛋白上的N-连接聚糖是高甘露糖和复杂聚糖的混合物。西尼罗病毒包膜(E)蛋白包含位于残基154的单个N-连接糖基化位点。由于这些位点上聚糖的切除显著降低但不消除传染力，当给它们提供简化糖基化时，靶向所述保守位点的疫苗能够产生对病毒中的突变变化敏感较低的有效治疗。[0058]糖苷酶抑制剂[0059]糖苷水解酶(也称作糖苷酶或糖基水解酶)催化糖苷键水解以释放较小的糖。它们为常见的酶，其天然作用包括降解生物质，例如纤维素和半纤维素；抗菌防御策略(例如，溶菌酶)；发病机理(例如，病毒神经氨酸酶)和正常细胞功能(例如，參与N-连接糖蛋白生物合成的修饰性甘露糖苷酶)。糖苷酶与糖苷转移酶一起形成了糖苷键合成和分解的主要催化机制。[0060]认为糖基化抑制剂可用于本发明的方法。此类抑制剂的示例包括基夫碱(Kinefusine)、Australine(无对应中译文)、栗精胺(Castanospermine)、脱氧野尻霉素(Deoxynojirimycin)、脱氧甘露糖野尻霉素(Deoxymannojirimycin)、苦马豆素(Swainsoninne)、甘露抑制素A(MannostatinA)等。[0061]Australine是多羟基化吡咯双烷类生物碱，其是a-葡糖苷酶淀粉葡萄糖苷酶的良好抑制剂(在5.8microM达到50%抑制)，但不抑制P-葡糖苷酶，a-或0-甘露糖苷酶，或a-或3-半乳糖苷酶。栗精胺是吲哚嗪类生物碱，其抑制a-葡糖苷酶活性并改变糖原分布。栗精胺抑制登革病毒感染(WhitbyK等人，JVirol.2005July;79(14):8698-8706)。[0062]各种类型的N-连接寡糖结构的生物合成包括两个系列反应:1)通过向长萜醇-P分步添加GlcNAc、甘露糖和葡萄糖，形成脂连接的糖前体，Glc3Man9(GlcNAc)2-焦磷酰-长萜醇；和2)通过膜结合的糖苷酶除去葡萄糖和甘露糖，并通过定位于高尔基体的糖基转移酶添加GlcNAc、半乳糖、唾液酸和岩藻糖而产生不同的复杂寡糖结构。[0063]在不同步骤阻断修饰反应的抑制剂的应用导致细胞产生具有改变的糖结构的糖蛋白。现已鉴定出多种生物碱样的化合物，其是參与糖蛋白加工的葡糖苷酶和甘露糖苷酶的特异性抑制剂。取决于抑制位点，这些化合物导致具有含葡萄糖的高甘露糖结构或各种高甘露糖或杂合链的糖蛋白的形成(ElbeinADFASEBJ.1991Dec;5(15):3055-3063)。[0064]在N-连接糖蛋白的加工中发挥功能的前4个酶是糖苷酶。GlcNAc-磷酸转移酶催化甘露糖6-磷酸决定物合成的第一歩。正确的糖结构非常有利于GlcNAc-磷酸转移酶的有效磷酸化。与磷酸化配对的糖结构是GAA分子上甘露糖-6-磷酸信号的合成所必需的，其是高甘露糖N-聚糖。[0065]已知多种甘露糖苷酶加工抑制剂。分离自疯草的苦马豆素显示为高尔基体甘露糖苷酶II的强カ抑制剂，但对甘露糖苷酶I没有作用(James，L.F.，Elbein,A.D.，Molyneux,R.j.，andWarren,C.D.(1989)bwainsonmeanarelatedglycosidaseinhibitors.1owaStatePress,Ames,1wa)。脱氧甘露糖野尻霉素是大鼠肝甘露糖苷酶I的非常強力抑制剂。在完整细胞中，脱氧甘露糖野尻霉素阻断复杂类型的N-连接寡糖的合成，并导致具有Man7_9(GlcNAc)2结构的糖蛋白的累积，并以Man9(GlcNAc)2寡糖为主(Elbein,A.D.,等人(1984)Arch.Biochem.Biophys.235，579-588)。甘露抑制素A是由微生物轮枝链霉菌(Streptoverticilliumverticillus)产生的代谢物，据报道这种化合物是大鼠附睾a-甘露糖苷酶的強力抑制剂(Aoyagi，T.，等人(1989)J.Antibiot.42,883-889)。[0066]基夫喊(Kif)最初由放线菌KitasatosporiakifunenseN0.9482分离(M.1wami,0.等人J.Antibiot.，40,612，1987)，是1-氨基-甘露糖野尻霉素的环草酰胺衍生物。基夫碱抑制动物高尔基体酶甘露糖苷酶I。在以IUg/ml或更高的浓度向培养的哺乳动物细胞添加基夫碱时，其导致N-连接寡糖的结构从复杂链完全转化成Man9(GlcNAc)2结构，这与其对甘露糖苷酶I的抑制作用相符。另ー方面，即便50yg/ml的脱氧野尻霉素也不抑制所有复杂链的形成(Elbein,A.D.,等人(1990)Kifunensine,apotentinhibitoroftheglycoproteinprocessingmannosidase1.JBiol.Chem.265,15599_1560dノ。因此，基夫碱是最有效的糖蛋白加工抑制剂之一。[0067]基夫碱也已在a-甘露糖苷酶抑制中显示出有前景的免疫调节活性。藤泽药品エ业株式会社(H.Kayakiri,等人，TetrahedronLett.,31,225,1990；H.Kayakiri,等人,Chem.Pharm.Bull.,39,1392,1991)和Hudlicky等人(J.RoudenandT.Hudlicky,J.Chem.Soc.PerkinTrans.1,1095,1993；J.Rouden,T.etal.,J.Am.Chem.Soc.，116，5099，1994)均报道了基夫碱的合成。[0068]使用基夫碱(Kif)处理细胞导致这些细胞中的糖基化加工受到抑制(Elbein等人(1991)FASEBJ(5):3055-3063；和Bischoff等人(1990)J.Biol.Chem.265(26):15599-15605)。Kif阻断复杂糖与修饰蛋白的连接。然而，如果使用足量的Kif以完全抑制溶酶体水解酶上的糖蛋白加工，所得水解酶具有甘露糖_9结构，其不是GlcNAc磷酸转移酶的最有效底物。[0069]根据本发明，以至少0.01V-g/ml至约至少500Ug/ml的量向细胞添加糖苷酶抑制剂如Kif，包括0.25,0.5,0.75、1.0、1.25、1.5、1.75,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5、6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,9.25,9.5,9.75和其间所有的数值。[0070]基夫碱抑制N-糖基化途径中a-甘露糖苷酶I的功能，并产生带有Man9GlcNAc2组成的糖蛋白。[0071]可使用已知的方法測量复杂糖结构的水平和/或类型。例如，可使用内切糖苷酶来区分高甘露糖和复杂型寡糖以表征糖蛋白及其结合的寡糖(Maley等人(1989)Anal.Biochem.180:195-204)。肽-N4-(N-乙酰-3-葡糖胺基)天冬酰胺酰胺酶(PNGaseF)能够在(6-天冬氨酰葡基胺键水解天冬酰胺-连接(N-连接)的寡糖，从而产生氨、天门冬氨酸和在还原端具有完整二-N-乙酰壳二糖的寡糖。由于以高甘露糖、杂合、二-、三-和四分支-复合物，硫酸化和多唾液酸基寡糖为底物，PNGase具有宽特异性。此外，内切-P_N_乙酰氨基葡糖苷酶H(EndoH)在3个甘露糖残基上有效水解杂合-及含甘露糖N-连接寡糖加工中的壳二糖単元，前提是a1，6-甘露糖臂具有另ー个连接的甘露糖。复杂寡糖具有EndoH消化抗性。[0072]为了表征存在于糖蛋白中的N-连接的寡糖的类型，可在还原性条件下使用PNGaseF(0.5%SDS、1%3-巯基乙醇、50mMNP_40、50mM磷酸钠，pH7.5)或EndoH(0.5%SDS、1%3-巯基乙醇、50mM柠檬酸钠，pH5.5)消化蛋白等份。随后，通过还原性条件下的SDS-聚丙烯酰胺电泳分析天然和消化的蛋白，并比较相对迁移率。如果糖蛋白仅包含高甘露糖寡糖，PNGaseF和EndoH处理的样品将具有比未处理蛋白更高的迁移率。由于在各N-连接糖基化位点剰余单个N-乙酰葡糖胺，EndoH处理的蛋白将具有略高的分子量。如果糖蛋白仅包含复杂寡糖，则与未处理的蛋白相比，EndoH处理的蛋白不会具有迁移率变化。如果有复杂和高甘露糖寡糖二者，则EndoH处理的蛋白将比未处理的糖蛋白小，但比PNGaseF处理的蛋白大。这种差异将大于由剩余N-乙酰葡糖胺导致的差异。[0073]为了在靶标糖蛋白产生简化聚糖，使用内切糖苷酶。内切糖苷酶是从糖蛋白或糖脂释放寡糖的酶。换而言之，尽管更常从结合的蛋白和脂质分子释放寡糖，但其仅在非末端残基的残基之间切割多糖链。其断裂聚合物中两个糖単体之间的糖苷键。内切糖苷酶的实例包括，但不限于，内切糖苷酶D、内切糖苷酶F、内切糖苷酶Fl、ft切糖苷酶F2、内切糖苷酶H和内切糖苷酶S。[0074]制备单糖基化流感病毒[0075]为了生产具有高甘露糖糖蛋白的蛋白，使带有流感病毒的细胞接触Kif(和/或DMJ)以抑制糖蛋白加工。为了生产单糖基化流感病毒，将所述病毒注射到带有如基夫碱的甘露糖苷酶抑制剂的无病源含胚鸡蛋的尿囊腔中。[0076]基夫碱抑制N-糖基化途径中a-甘露糖苷酶I的功能，并产生带有Man9(GlcNAc)2组成的糖蛋白。抑制血凝素糖基化的基夫碱浓度在5、10、25、50、75、100、200、5001^/111し和多达500iig/mL之间的范围，以及其间所有的数值。[0077]在孵育约1-3天后，收集基夫碱处理的尿囊液并使用内切糖苷酶(EndoH)消化以除去高甘露糖型聚糖，即，能够将Man9(GlcNAc)2-化为单个GlcNAc的浓度。用于产生单糖基化血凝素的尿囊液中的EndoH浓度在至少约0.1、0.5、1、2、5、7、10、20、30、40、50、60、75,100,150,200,500ug/mL尿囊液或更高的范围。[0078]随后，回收并纯化单糖基化病毒。[0079]单糖基化流感病毒的应用[0080]本文公开的单糖基化流感病毒抗原可用于对抗流感病毒感染的免疫。因为已知在流感病毒，特别是相同病毒亚型内发生不同分离物之间的交叉保护，获得所述抗原的具体病毒可以与为其提供防御的具体病毒相同或不同。[0081]目前使用的流感疫苗称作全病毒(WV)疫苗或亚病毒体疫苗(SV)(也称作〃裂解〃或〃纯化表面抗原")。WV疫苗包含完整的灭活病毒，而SV疫苗包含经过使用溶解含脂质病毒包膜的清洁剂裂解，随后将残余病毒化学灭活的纯化病毒。抗流感的减毒病毒疫苗也在研发中。关于制备常规疫苗的讨论可见于Wright,P.F.&ffebster,R.G.，FIELDSVIROLOGY,4dEd.(Knipe,D.M.etal.Ed.)，1464-65(2001)。[0082]在疫苗包含多于ー个流感株的情况下，不同株通常分隔培养，并在收获病毒且制备抗原后混合。或者，可将流感.病毒的不同分离物的不同片段组合以产生多效疫苗。用于本发明方法的流感疫苗可以是重配株，和/或通过反向遗传性技术获得。所述病毒是减毒的。所述病毒是温度敏感的。所述病毒是冷适应的。可以使用包括来自致病株的HA和/或NA病毒片段以及来自非致病株的其他6或7个片段的重配株。[0083]用于根据本发明的免疫原组合物的流感病毒抗原可以是活病毒的形式，或者，优选灭活病毒。病毒灭活通常包括使用化学品，例如福尔马林或P-丙内酯的处理。在使用灭活病毒的情况下，所述抗原是完整病毒、裂解病毒或病毒亚基。通过使用去污剂(例如，乙醚、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸、三-N-丁基磷酸酷、TritonX_100、TritonN101、溴化十六烧基三甲基铵)处理病毒体来获得裂解病毒，以产生亚病毒体疫苗制品。亚基疫苗包含流感表面抗原血凝素和神经氨酸酶中的ー个或二者。流感抗原还能够以病毒颗粒的形式呈现。[0084]在从流感病毒制备抗原(即，不是从不包括培养流感病毒的重组或合成系统中产生抗原)的情况下，病毒可生长在蛋或细胞培养物中。常规途径是在无特异病原的含胚蛋中的培养，由此培养用于疫苗生产的流感病毒，而细胞培养则是近年开发的。在使用细胞培养的情况下，流感病毒疫苗通常可培养在哺乳动物细胞上，例如MDCK细胞、Vero细胞或PER.C6细胞。这些细胞系可广泛地得自，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)收集，或卡瑞尔细胞库(CoriellCellRepositories)(Camden,NJ)。例如，ATCC提供目录号为CCL-81、CCL-81.2、CRL-1586和CRL-1587的各种不同Vero细胞，且提供目录号为CCL-34的MDCK细胞。还可能使用禽类细胞系培养，包括源自鸡，例如鸡胚成纤维细胞(CEF)的细胞系。[0085]同样，可将病毒(例如HIV、HCV、登革病毒、流感病毒、黄病毒等)培养在存在ー种或多种糖苷酶抑制剂(基夫碱、Australine、栗精胺、脱氧野尻霉素、脱氧甘露糖野尻霉素、苦马豆素、甘露抑制素A等)的细胞培养物中。用于培养这些病毒的细胞培养系统是本领域熟知的。西尼罗病毒可培养在猴肾上皮细胞或鸡胚细胞组织培养物中。HIV可培养在外周血单核细胞(PBMC)培养物中。HC可培养在源自人肝癌细胞系Huh-7的细胞中。[0086]本发明的免疫原和药物组合物适合向患者给药。这可通过多种途径实现，包括但不限于:皮内注射；经皮肤给药；和局部给药。这些可以与例如，通过砂纸或通过使用微磨料的擦皮法结合使用。[0087]本发明的免疫原和药物组合物优选以疫苗的形式呈现。[0088]本发明的组合物可包括佐剂。已用于流感疫苗的佐剂包括铝盐、壳聚糖、CpG寡聚脱氧核苷酸，如CpG7909;水包油乳液，如MF59;水包油包水乳液、大肠杆菌热不稳定毒素及其脱毒突变体、单磷酰基脂质A及其3-0-脱酰基衍生物、百日咳毒素突变体、胞壁酰二肽坐寸o[0089]实施例[0090]在不限制本发明范围的前提下，下文给出了根据本发明实施方式的示例性仪器、设备、方法及其相关結果。注意，实施例中可使用便于读者的标题或小标题，其不以任何方式限制本发明的范围。此外，本文提出且公开了某些理论；然而，只要根据本发明而不參考任何具体理论或行动方案实施本发明，则这些理论无论对错，都不限制本发明的范围。[0091]实施例1:完全糖基化和单糖基化病毒的制备[0092]将A型流感病毒NIBRG_14(H5N1)(NicolsonC，等人(2005)Vaccine23(22):2943-2952)注射(200uIPBS中1000TCID50(50%组织培养感染剂量))到10日龄的无特异病原的(SPF)含胚鸡蛋中，从而生产常规的完全糖基化病毒(WHO(2005)WHO动物流感的诊断和监视手册(世界卫生组织，日内瓦))。[0093]为了生产单糖基化病毒，将所述病毒注射到带有0.2mg/ml基夫碱(CaymanChemical)的尿囊腔中。基夫碱抑制N-糖基化途径中a-甘露糖苷酶I的功能，并生产出带有Man9GlcNAc2组成的糖蛋白(ElbeinAD,等人(1990)JBiolChem265(26):15599-15605)。[0094]分析了基夫碱抑制血凝素糖基化的浓度依赖性(图1A)。在孵育3天后，收集尿囊液并在3，OOOg离心10分钟以除去碎片。随后，在4°C使用内切糖苷酶EndoH(20iig/ml尿囊液)消化基夫碱处理的尿囊液12小吋，以除去高-甘露糖型多糖，即从Man9GlcNAc2转化为单GlcNAc。分析了EndoH在尿囊液中产生单糖基化血凝素的浓度依赖性(图1B)。[0095]随后，通过在46，OOOg超速离心90分钟沉淀单糖基化病毒，使用PBS重悬，并通过不连续蔗糖密度梯度(25%，40%)在270，000g90分钟进行纯化。收集梯度中的病毒，并通过在120，OOOg超速离心90分钟沉淀。最后，将沉淀物重悬在PBS中，并通过0.22iim滤器过滤(CDC(I982)ConceptsandProceduresforLaboratory-basedInfluenzaSurveillance(U.S.Dept,ofHealthandHumanServices.,Washington,DC);HarveyR,等人(2008)Vaccine26(51):6550-6554)。与纯化的完全糖基化病毒相比，纯化的单糖基化病毒具有HAl和HA2二者的明显下调(图1C)。[0096]实施例2:完全糖基化和单糖基化病毒的电子显微镜分析[0097]将病毒溶液放置在铜网(ElectronMicroscopySciences)的火棉胶-碳-包被的表面上。使用滤纸除去过量的液体，添加2%甲胺钨酸盐(TedPella,Inc.)，染色30秒。使用滤纸除去过量的液体，并用H2O清洗30秒。随后，将所述网风干4小时，并通过透射电子显微镜(HitachiH-7000)拍摄病毒颗粒的照片。完全糖基化和单糖基化流感NIBRG-14病毒在大小和形态上相近似(图2)。[0098]实施例3:病毒中血凝素的量化[0099]将病毒与变性缓冲液(5%SDS和10%^-巯基乙醇)混合并煮10分钟，随后向样品添加10%NP-40，并在25。C使用PNGaseF(NewEnglandBiolabs)处理过夜。将样品与SDS-PAGE样品缓冲液混合并在凝胶上样前在95°C加热10分钟。使用SYPRORUBY?(Invitrogen)将凝胶染色,并通过VERSADOC?成像系统(Bio-rad)进行分析。SDS-PAGE分析之前进行PNGaseF处理以将完全糖基化病毒样品的HAl与NP蛋白分离。这样就能够直接比较SDS-PAGE上来自完全糖基化和单糖基化病毒的HAl蛋白的密度，从而量化病毒中的血凝素(图3)。[0100]实施例4:使用LC-MS-MS的糖肽分析[0101]使用质谱分析单糖基化病毒的聚糖组成。将病毒溶液与非还原样品缓冲液混合，并在凝胶上样前在95°C加热10分钟。使用考马斯蓝进行凝胶染色。将HAO带切成小片以用于胰蛋白酶的凝胶内胰蛋白酶消化。消化后，通过LC-MS-MS分析样品(WuY，等人(2010)RapidCommunMassSpectrom24(7):965-972)(AgilentTechnologies,ThermoScientific)。流感NIBRG-14病毒有6个N-糖基化位点。除了在残基295(~10%Man6(GlcNAc)2)和残基489(~10%Man7_9(GlcNAc)2)中存在小百分比的高-甘露糖型聚糖之外，所有其他聚糖都是具有所连接的单个GlcNAc糖残基的单糖基化的(图4)。[0102]本说明书中引用的所有出版物和专利申请均通过引用并入本文，正如同各单个出版物或专利申请具体且分别地指定以通过引用并入本文一祥。[0103]尽管已出于清楚理解的目的而通过说明和实例详细描述了本发明，本领域技术人员容易理解，在本发明的教导下可进行某些变化和改进而不脱离后附权利要求书的精神或范围。齐晖·王,马澈,曾永杰申请人:中央研究院