专利名称：糖基化相关的材料和方法多数天然多肽含有糖部分，所述部分在一级多肽链的一些氨基酸残基处共价连接至所述多肽。在本领域中，这些多肽一般称为糖肽或糖蛋白。还已知，当多肽存在于生物系统(例如，细胞或个体)时，任何给定多肽上的糖基化模式的性质可影响其特性，所述特性包括蛋白酶抗性、细胞内运输、分泌、组织靶向、生物半衰期和抗原性。多肽的糖基化是翻译后修饰的天然形式，其改变多肽的结构和功能。在自然界中， 通过酶促的过程引入糖基化，导致不同类型糖基化多肽的位点特异性修饰。在N-连接的糖基化中，聚糖被连接至天冬酰胺侧链的酰胺氮，而在0-连接的糖基化中，聚糖连接至丝氨酸和苏氨酸侧链的羟基氧。其他形式的糖基化包括糖胺聚糖(其连接至丝氨酸的羟基氧)、 糖脂(其中聚糖连接至神经酰胺)、透明质烷(其不连接至蛋白或脂质)和GPI锚(其通过聚糖连接将蛋白连接至脂质)。本领域中的普遍问题是糖基化通常加至真核细胞中的多肽，但很少加至经常用于治疗性多肽重组表达的原核宿主中所表达的多肽。原核宿主中产生的多肽中糖基化的缺乏可导致所述多肽被识别为外源物，或者意味着其具有其他不同于其天然形式的特性。还有一个问题是，在试图在没有天然糖基化的位置将糖基化改造进入多肽来调节肽特征时，发现其非常困难。因此，例如在多肽的表达可引起多肽的天然糖基化形式改变(例如，在细菌宿主中表达)或需要修饰多肽的糖基化形式以改进所述多肽的一个或多个特征(尤其是当所述多肽是治疗性蛋白时)的情况下，本领域中一直在尝试引入或修饰多肽的糖基化形式。例如，参见US专利No =7226903中描述的干扰素β的修饰。连接至多肽的聚糖分子具有一系列直链和支链结构和不同长度的聚糖链，并且多肽上存在的特定聚糖分子影响所述多肽的特征。很多类型的聚糖分子包括末端唾液酸。这些在生理ρΗ下带负电荷的9个碳原子的糖被认为参与配体-受体相互作用，所述相互作用可极大地影响特定的细胞-细胞、病原体-细胞或药物-细胞的通讯。包含末端唾液酸残基的聚糖链的一个特别的特征是其增加以所述唾液酸糖基化的治疗性多肽的半衰期。通过这样的观察而得知包含无末端唾液酸残基的聚糖被肝从循环中迅速地除去，因而降低治疗性多肽的半衰期。氟取代的糖已被用作不可加工的底物用于结晶酶，例如CstII (Chiu等，Nat. Struct. Mol. Biol. (2004) 11，163-170)。在这种情况下，在含氟糖的糖苷连接处，含氟的糖已知对酶促加工有抗性。2，3-二氟唾液酸衍生物已被合成，并且用作来自寄生虫克氏锥虫(Trypanosoma cruzi) (Watts 等，J. Am. Chem. Soc. (2003) 125,7532-7533)和让氏锥虫(Trypanosoma rangeli) (Watts 等，Can. J. Chem. (2004)82,1581-1588)之唾液酸酶的灭活剂。该前期工作导致发现这些唾液酸酶通过共价的唾液酸基酶中间体的参与而运作，并且确立例如该衍生物的化合物作为锥虫唾液酸酶的时间依赖性的共价灭活剂而发挥作用。随后，还已知在C-5具有羟基(而非天然的N-乙酰基基团)的2，3-二氟神经氨酸衍生物也作为让氏锥虫(T. rangeli)唾液酸酶的共价灭活剂而发挥作用，但显示出对原抑制剂(Watts等，J. Biol. Chem. (2006) 281，4149-4155)非常不同的动力学行为(k非活性和k反应性)。总之，多肽糖苷的修饰(尤其是对其生物特性的修饰)仍然是本领域中具有挑战性的问题和尚未被以满意的方式解决的问题。发明概述广义上，本发明的基础是这样的认识氟唾液酸化合物(例如，3-氟唾液酸化合物)可被用于与糖接受体形成缀合物，其调节所述缀合物或整合有所述缀合物的治疗性部分(therapeutic moiety)的一个或多个生物特性。因此，使用这些方法所产生的修饰的糖基化结构可被引入治疗性部分(例如，多肽)或者是其一部分。因此，一方面，本发明涉及用于使活化的3-氟唾液酸化合物与糖接受体基团反应的方法，其中所述3-氟唾液酸化合物并不像本领域中常规使用的那样连接至CMP基团。该方法可酶促进行(例如使用唾液酸转移酶(sialyl transferase)、转唾液酸酶(trans_sialidase)或使用来自糖化学领域的合成技术)。唾液酸转移酶被用于转移唾液酸衍生物至接受体糖，使用天然或修饰的天然底物(S卩，CMP-唾液酸或其衍生物)作为所述酶的供体。反转唾液酸转移酶(inverting sialyl transferase) PmSTl已被证明将3_氟-CMP唾液酸转移至半乳糖基接受体，然而，该反应使用二酶一锅法(two-enzyme one-pot method)原位产生天然供体糖的3_氟类似物 (Harshal 等，J. Am. Chem. Soc. (2007) 129，10630-10631)。然而，使用唾液酸转移酶，从未将非天然的活化3-氟唾液酸转移至糖接受体，且在此之前，尚未提出将3-氟唾液酸的特性整合进入多肽的糖基化结构。因此，在第一个方面，本发明提供包括在糖接受体和3-氟唾液酸化合物之间形成共价缀合物的方法，所述方法包括将糖接受体与3-氟唾液酸化合物相接触，该接触步骤在适于使3-氟唾液酸化合物与糖接受体反应并与其共价键合的条件下发生，其中所述3-氟唾液酸化合物不包含胞嘧啶一磷酸(CMP，cytosine monophosphate)基团。在一个实施方案中，该方法包括将糖接受体、3-氟唾液酸化合物和能够将3-氟唾液酸化合物转移至所述糖接受体的酶相接触，该接触步骤在适宜使3-氟唾液酸化合物转移至糖接受体并取其共价键合的条件下发生。该酶可包括唾液酸转移酶或转唾液酸酶。作为替代或补充，3-氟唾液酸化合物与糖接受体的共价键合还通过合成化学反应来进行。一般来说，与3-氟唾液酸化合物之共价缀合物的形成调节糖接受体或包含所述糖接受体的治疗性部分的生物特性，例如酶水解(例如，通过外-唾液酸酶 (exo-sialidase)或神经氨酸苷酶)抗性、生物稳定性或药代动力学特性。优选地，该方法作为体外无细胞方法而进行。在转移反应为酶促反应的情况下，其可发生时伴有在3-氟唾液酸化合物和接受体糖基团之间异头连接处的倒转(inversion)。 与现有技术中基于CMP的方法不同，本发明的方法可使用一种酶进行。本发明还帮助克服了现有技术中存在的问题，即已知的CMP 3-氟唾液酸化合物的少量已知例子被证明对唾液酸转移酶非常稳定，因而在合成氟唾液酸缀合物中并不实用。在一些实施方案中，该方法可包括修饰已存在于多肽上的糖基化结构(例如，表达产生的或之前合成产生的糖基化结构)的步骤。在一个典型的情况下，其可包括从初始存在于多肽上的糖基化结构中除去一个或多个末端糖基基团以形成接受体基团和/或用一个或多个3-氟唾液酸基团替代糖基化结构的末端糖基基团的额外步骤。为了方便起见， 酶促地进行除去所述末端糖基基团的步骤，例如通过使用唾液酸酶来进行。或者，现有的糖基化结构可被进一步切割或改变(例如不仅除去末端糖基基团)以提供根据本发明可使用的糖接受体。此外，在一些实施方案中，本发明的方法可包含将多个3-氟唾液酸基团转移至多肽的接受体基团。这样做是为了提供额外保护，以使核心糖基化结构免受降解。举例来说， 通过重复连接连续的3-氟唾液酸基团或将3-氟唾液酸基团寡聚物共价连接至接受体的方法，两个、三个或更多个3-氟唾液酸基团可共价连接至接受体基团。在一些实施方案中， 3-氟唾液酸基团可缀合至多肽上存在的糖基化结构的末端糖基残基。优选地，本申请中公开的方法使用通式(I)所示的3-氟唾液酸化合物描述了糖基化技术，且更具体地说，生产糖基化结构的技术，所述结构耐受酶促降解，因而调节其一个或多个生物特性或整合了它们的治疗性部分的生物特性，且特别是使活化的含氟糖底物(例如，3-氟唾液酸化合物)与糖接受体反应以产生糖接受体与一种或多种唾液酸化合物的共价缀合物的技术。