专利名称：蛋中预防传染性支气管炎的制作方法 发明领域本发明涉及提供宿主动物如小鸡蛋中预防传染性支气管炎(下文，“IB”)的新方法。更特别的是，已经证明传统商业上可获得IB疫苗衍生地疫苗如这里描述的适当的蛋中给予宿主动物是安全和有效的。 IB是影响所有年龄小鸡的高度传染性/可传播呼吸道疾病。IB疾病是由一种冠状病毒引起的。IB疾病的症状多样，报道的作用包括死亡、呼吸道窘迫、产量降低、蛋高峰产量降低、蛋壳异常、腹泻和肾病/肾炎症状。年幼小鸡不期望的体重下降和/或下蛋鸡蛋产量不充足/低质量是IB疾病对小鸡的商业上明显的不利影响。商业上可获得的IB疫苗不给予蛋中。而是以各种形式在孵化后给予。简言之，这种疫苗典型地通过喷雾的劳动密集型方法(例如，爪喷、背喷或自动喷雾装置)或以滴剂形式(眼睛或鼻子)给予。如下更加充分的解释，本发明的蛋中接种提供了比目前采用的不方便和耗时的孵化后给药途径突出的优点。 发明概述简言之，本发明涉及商业上可获得的IB疫苗衍生的蛋用疫苗(下文，“IOV”)。实验结果证实了有关蛋中给予小鸡的IOV的安全性和功效。也建立了适当的剂量参数。除了IOV，本发明包含适合蛋中给药的相关组合物。预防宿主动物发生IB的方法也在本发明的范围内。这种给药方式提供了经济上的优势，因为蛋用疫苗更简单，更快捷，以及使用的疫苗剂量比传统给予的疫苗更少。
发明详述
本发明涉及蛋中接种动物，尤其是家禽。这里使用的术语，家禽是指商业上饲养的任何鸟或飞禽，因此包括小鸡、火鸡、鸭、鹅、矮脚鸡、鹌鹑、鸽子等等。其中特别感兴趣的是小鸡。
考虑用于接种的各种疫苗可用于本发明，尤其是，抗传染性支气管炎或IB疫苗。疫苗可以从工业可获得的任何来源得到。优选的疫苗是商标POULVAC_销售的IB疫苗，可从Fort Dodge Animal Health in FortDodge，lowa or Weesp，荷兰得到。也可以利用其它IB疫苗。本发明的疫苗优选含有传染性物质的活的无毒株，包括IB。疫苗应该诱导宿主的免疫反应，产生足够带来免疫的抗体。
待给予宿主蛋的疫苗中包含的致病物质的量可以变化，依赖于特定的致病物质，和动物大小(较大的动物需要物质的量可能更大)。每疫苗剂量中致病物质，例如病毒(尤其是IB)期望的量在大约10-1.0EID50至大约102.0EID50的范围内。每疫苗剂量中致病物质的量在大约100.0EID50至大约101.0EID50的范围内在这里也有效。在整个申请中，“EID50”指50％蛋传染性剂量。
除了前述的，疫苗可以与已知的添加剂，包括佐剂配制而成。期望的佐剂的例子包括丙烯酸的聚合物和共聚物，以及其它烷基酯衍生的。其它组分包括其量足够达到一剂的介质，如水、盐水溶液，或油包水乳状液。致病物质可以溶解或悬浮于刚才描述的介质中。在本发明的优选方案中，疫苗与基本上无病毒的中和因子配制而成。
典型的疫苗剂量在大约0.001mL至大约1.0mL的范围内，更优选在大约0.01至0.1mL的范围内，大约0.05mL是更优选的。
最期望疫苗的剂量安排包括蛋中给予在受精卵中发育，尚未孵出的小鸡。一般给予一次剂量是优选的，但给予多于一次也在本发明范围内。选择的剂量安排应该确保发育中动物的安全和免疫的功效。
一剂疫苗可以在达到大约1天和包括孵出前大约几分钟的时间范围内蛋中给予。更优选，在大约5天至大约25天的时间段内蛋中给予一剂。甚至更期望，在大约10天至大约20天的期间给予一剂。特别期望在大约18天给予一剂。
可以用手给予疫苗，但更典型和经济地使用商业上可获得的蛋注射装置给予，如从Embrex，Inc.of North Carolina得到。
根据本发明的蛋用疫苗的优点是疫苗可用于每个单独的鸟(蛋)。这与更传统疫苗程序(非蛋中)相比，准确性变得更好。在接种过的禽保护攻击的百分比高反应了这一点。而且，由于在很早年龄蛋中接种的鸟与那些蛋中后接受疫苗接种的鸟相比，在接触可能存在病毒毒力株的外界周围环境前，其免疫力有更多的时间发育。这个结果是出乎意料的。正常情况下，预期活病毒导入胚胎可产生明显的致死作用。发育中胚胎是非常脆弱的生物体，活病毒如IB的存在一般可杀死发育中的动物。最多，当蛋中接种小鸡时，本领域主要要求使用病毒中和因子以防止这种事件。相反，接种被认为是极少量的活病毒，不杀死胚胎，但也不能给生物体带来满意的致免疫性能。
提供下列实施例仅为说明，不应解释成其限制本发明的范围。
(A)疫苗
IOV的制备是使用Fort Dodge Animal Health in Fort Dodge，lowa或Weesp，荷兰的商业上可获得的IB疫苗(Poulvac_IB MM)，用盐水重配成浓度102.0、101.0、100.0和10-1.0IB/每剂量病毒疫苗(0.05ml)。Poulvac_IB MM含有传染性支气管炎Massachusetts血清型病毒株1263。这种商业上可获得的IB疫苗尚未批准或指出用于蛋中给药。
(B)实施例1小鸡蛋中接种的安全研究
无特定病原体(下文，“SPF”)鸡蛋可从Charles River SPAFAS，Inc.[190 Route 165，Preston，Connecticut 06365]商业获得。简言之，SPAFAS的SPF蛋是在适当的设备中孵化的。在孵化18天时，使用等级剂量的Poulvac_IB MM衍生的IOV给4组共25个蛋蛋中接种。
本发明的IOV制备如下。得到Fort Dodge Animal Health in Fort Dodge，lowa或Weesp，荷兰的商业上可获得的IB疫苗(Poulvac_IB MM)。该疫苗含有冻干环境下的活减毒IB病毒。这里在它使用前，该疫苗每小瓶含有106.4EID50 IB病毒效价。接下来，该疫苗重配于盐水中，接着进一步与盐水混合直到达到下列浓度制备分别含有102.0、101.0、100.0和10-1.0效价IB/每剂量病毒疫苗(0.05ml)的溶液。
在孵化18天时，用分别含有下列IB病毒效价102.0、101.0、100.0和10-1.0效价IB病毒/每剂量疫苗的本发明的疫苗，每个蛋0.05ml剂量蛋中给1-4组(每组由25个蛋组成)注射。作为对照，组5(也由25个蛋组成)在孵化18天时不接受任何蛋中注射。使用来自Embrex，Inc.[P.O.B.13989，Research Triangle Park，North Carolina 27709-3989]的商业上可获得的设备(Inovoject_蛋注射器)，根据制造商的规程进行注射。
接种蛋(即25个蛋/组的1-4组共100个蛋)和对照蛋(组525个蛋)均在相同的孵化器中孵化，直到孵出。在孵化20、21和22天时，实验记录孵化蛋的数量。
表1和2列出得到的结果。
表1孵化率的计算结果
表2未加工孵化率结果
接种蛋的孵化率从72％至84％，阴性对照组5的蛋为96％。这些观察的孵化率百分比全部在通常限度内。在接种组(即1-4组)之间没有观察到全身的(系统的)作用。
基于上述实验1的结果，得出在孵化18天时使用从10-1.0EID50 IB疫苗的低剂量至102.0EID50 IB疫苗的高剂量范围的剂量对于孵化率是安全的。
(C)实施例2SPF小鸡蛋蛋中接种的功效研究
SPF小鸡蛋得自Charles River SPAFAS，Inc。200个蛋全部在适当的设备中孵化。在孵化18天时，对光检查所有蛋；14个蛋未受精，20个蛋中的胚胎已经死亡。将蛋分成5组，每组25个蛋。
根据上面实施例1的步骤制备待给予的疫苗。
在孵化18天时，用类似上面实施例1使用的方案，用0.05ml/蛋的剂量中含下列EID50 IB疫苗/病毒效价102.0、101.0、100.0和10-1.0给1-4组蛋中注射。作为对照，在孵化18天，组5的蛋不注射任何疫苗。
接下来，已孵化和对照蛋置于每组蛋分隔的孵化器(不旋转)中，在它们所住的分离围栏中留下孵化。在孵化20、21和22天实验记录孵化蛋的数量。在孵化22天，从孵化器中取出所有剩下的蛋。
小鸡住在正大气压的各自分离的围栏中。所有小鸡停在木片上。房间提供加热灯以产生基本在室温以上的当地温度。通过调节小鸡与加热灯之间的距离，小鸡能够选择它最喜欢的温度。小鸡随意饮食，自动饮水器中可随意得到饮用水。孵化后一周内，所有小鸡用包括颜色和数字的识别翅膀标记来标记。待攻击的(如下所述)4周龄小鸡就在攻击前移到1个正大气压的动物房间。此外，整个研究中实验观察小鸡的IB临床征象。
表3和4列出孵化率结果。
表3孵化率的计算结果
表4未加工孵化率结果
所有接种组(从32％至56％的范围)观察到的孵化率很低，随着疫苗剂量的增加而降低。在组5的对照蛋中，80％的蛋孵化。推断关于孵化率，得到的结果不具有代表性，是由于蛋质量差，不是由于蛋中接种IB病毒的不利作用。如实施例1中详细描述的，前面得到了可接受的孵化率结果。
未攻击小鸡的临床征象(如死亡率)分析进一步加强了孵化率结果不具有代表性的上述结论。下表5列出孵化/4个接种组(即1-4组)和1个阴性对照组(即组5)小鸡的死亡率数据。在表5中，“PH”是孵化后的缩写。观察的临床征象包括下列结果。由于腹泻，所有组都有几只小鸡情况差。有些小鸡表现呼吸困难或脐疝。共5只小鸡死于卵黄囊炎症，情况如下1组，死亡1只小鸡；2组，死亡3只小鸡；和4组，死亡1只小鸡。表5示出孵化后死亡率结果(包括由卵黄囊炎症造成的死亡)。对于1组，未观察到1只小鸡死亡(解释了在PH21天，1组中有4只小鸡活着的发现)。在组5中，孵化后不久死亡了30％(即6只孵化/小鸡)。蛋中接种前对光检查，10％的蛋中胚胎已经死亡。这些接种前死亡与本研究所述的死亡率特征联合说明蛋质量低下(而不是蛋中接种造成的不利作用)造成了孵化率结果和攻击前观察的临床征象。
表5未攻击小鸡的临床征象
攻击研究如下进行。简言之，从the Poultry Health Institute，Doom，荷兰商业获得有毒力IB M41病毒。该攻击病毒每小瓶效价105.9 EID50。用软化水适当重配和用营养肉汤培养基稀释1小瓶攻击病毒制备每毫升含104.5EID50终浓度的攻击病毒。
在4周龄时，所有接种和对照小鸡每只小鸡给予103.5EID50的0.1ml(0.05眼睛和0.05鼻内)毒力IB M41病毒攻击。使用纤毛停止测试(下文，＂CST＂)评估小鸡。简言之，攻击后(下文，“PC”)6天，杀死小鸡，去除它们的气管。收集每段气管的一部分进行显微镜检查，评定纤毛活性。评定使用下列标记+＝全部运动；±＝运动受损；和-＝不运动。在受损的情况下，使用另外气管部分证实这个发现。用下列分子式计算保护这个IB毒力株攻击的百分比保护％＝(A+1/2B)(100)/C，其中A＝#评定+的小鸡；B＝#评定±的小鸡；和C＝所有#小鸡。
表6和7列出攻击研究结果。
表6攻击后保护的计算结果
表7未加工攻击后保护的结果
CST方法学测定，在孵化18天用Poulvac_IB MM衍生的IB病毒/疫苗蛋中接种给予的对3周龄接触毒力IB病毒攻击的保护作用极好。保护百分比范围从低至92％到高至100％。
除了上面讨论的孵化率、临床征象和CST分析外，也进行血清学研究。简言之，在3周龄，从所有小鸡的翼静脉收集血液样本达每组最大24只小鸡的数量。在3周龄，最大每组5只小鸡的每只眼睛滴1滴甘油后收集泪液。采用HI试验测定血清和泪液中抗IB M41抗原的抗体效价。在实施的HI试验基础上计算几何平均效价(下文，“GMT”)。表8和9列出血清学结果。
表8血清学计算结果
表9未加工血清学结果
几乎所有小鸡，血清中抗体水平不超过2log HI效价＝3.0的检测限度。接种小鸡和对照小鸡泪液中的抗体效价都高。因此，推测(a)在泪液中，实验测定的抗体效价是非特异性的；和(b)收集泪液使用的甘油可能是造成这个观察效果的原因。上面讨论的这些血清学结果未得出清楚的结论。
基于上述实施例2的全部，推断在18天用低至每蛋10-1.0 EID50到高至每蛋102.0 EID50的剂量范围的IB病毒/疫苗接种SPF小鸡蛋的蛋中接种，对保护小鸡在3周龄接触毒力IB M41病毒攻击有效。
(D)实施例3给商业小鸡蛋蛋中接种的功效研究
用于烤焙的商业小鸡蛋得自Pronk，Meppel，荷兰。这些蛋在适当的设备中孵化。孵化18天后，对光检查所有蛋，用分级剂量的蛋用疫苗接种28-30个蛋的4个组。给予的蛋用疫苗，孵化和/或攻击病毒，血清学分析，和采用CST方法学测定保护均如前述实施例1和2实施。下表10-16列出用IB病毒给商业小鸡蛋蛋中接种的研究结果。
表10孵化率计算结果
表11未加工的孵化率结果
如上面表10和11阐述，接种组(即组1-4)的孵化率好，在通常限度内，范围从86％至93％。对照组(即，组5)的孵化率是86％。
表12未攻击小鸡的临床征象
上表12列出了用IB病毒毒力株攻击后组1-5的小鸡情况和死亡率。
在表5中，“BC”用作情况差的缩写。总结结果组1中2小鸡死亡(1死于卵黄囊炎症)；和组5中2对照小鸡情况差(1只在孵化后9天死亡，另一只小鸡在孵化后9天由于不能直立而杀死)。表12未列出临床呼吸征象。给予100.0或更大剂量的组中(即，组1-3)，几只小鸡表现出轻微呼吸征象，可能是由于从6日龄直到2周龄攻击(组1和2)或直到12日龄(组3)IB病毒复制。在攻击后6天，CST方法学测定，观察到的呼吸征象轻微且没有损害(下面列出)。
表13和14列出了攻击研究结果。
表13攻击后保护的计算结果
表14未加工的攻击后保护结果
在表13和14中，组2中1小鸡从攻击后当天到攻击后5天死亡时的情况差。这种死亡不是由于蛋中接种或随后的攻击。用CST技术测定在孵化18天用Poulvac_IB MM衍生的IB病毒/疫苗蛋中接种后，给予用于孵化的商业蛋对3周龄接触毒力IB病毒攻击极好的防御。保护百分比范围从低至89％到高至100％。对照小鸡(组5)没有产生在3周龄接触毒力IB病毒攻击后的保护。
下表15和16阐述产生的血清学分析结果。
表15血清学计算结果
表16未加工血清学结果
如在上面表15和16阐述，血清样本的血清学分析揭示所有接种组的平均抗体效价仅稍高于对照小鸡(即，组5)。然而，在接种组内，组1小鸡，即接受最大剂量蛋用疫苗的小鸡测得的平均抗体效价最高。另外，在接种小鸡中，相当数量的小鸡显示抗体效价在检测水平或高于检测水平。
基于上述实施例3的全部，推断用低至每蛋10-1.0EID50到高至每蛋102.0EID50的剂量范围的IB病毒/疫苗在用于孵化的商业小鸡蛋孵化18天时蛋中接种，对保护小鸡在3周龄接触毒力IB M41病毒攻击有效。
尽管已经在上面非常详细地描述了本发明，申请人期望所附权利要求限定和确定的可能专利保护的全部范围，根据上述教导但不限于前面阐述的任何特定实施例。


本发明涉及保护宿主动物(如鸡)接触毒力传染性支气管炎病毒的方法和组合物。每个蛋蛋中给予适当剂量水平的IB活的无毒力株，提供了具有可接受安全性和功效特征的有效和有效率接种。