专利名称：用于预防或治疗烟碱成瘾的缀合物的制作方法吸烟对健康有许多严重的不良作用且由于许多减少或防止吸烟的政府倡议，吸烟已经变得越来越不为社会所接受。因此，每年有许多吸烟者希望戒烟，并同时作出尝试，但只有少数完成戒烟者不复吸。非常高的失败率是烟碱成瘾性加上香烟容易取得的结果。随着吸烟，或使用其他形式的烟碱(例如，窦道、贴片、口香糖)，烟碱进入血流中且之后迅速进入脑中，其在脑中刺激烟碱乙酰胆碱受体，造成多巴胺的释放，其转而活化奖赏中心。随着戒烟尝试，有奖赏(reward)反应的损失，以及包括认知功能下降的戒断症状。复吸的主要原因是奖赏的损失和令人不快的戒断症状可因吸烟而立即解除。 有各种用于戒烟的非疫苗疗法。烟碱替代疗法如含有烟碱的口香糖或皮肤贴片，可以帮助戒除吸烟者隔断香烟，但他们不破坏烟碱导致成瘾周期。另一种方法是使用针对烟碱乙酰胆碱受体的药物，如伐尼克兰。此类药物，降低由吸烟通常遇到的奖赏，已比较成功地帮助戒烟，然而药物治疗结束之后复吸率都很高，因为失效(例如，吸单次烟)可以很容易地转成完全复吸与再活化奖赏中心。最近的烟碱戒除战略重点在于疫苗，其刺激免疫系统产生结合血液中的烟碱的抗烟碱抗体，从而减少烟碱可以进入脑的量和比率。这转而防止奖赏中心被活化和帮助破坏成瘾周期。因为由疫苗诱发的抗体可长期存活，所以抗烟碱疫苗对于协助戒烟以及预防复吸是有用的。此外，因为抗体作用于周边，所以没有中枢神经系统(CNS)副作用的风险。此类疫苗的实例描述于 WO 00/32239, WO 02/49667, WO 03/82329 和 US 2006/111271 中。烟碱衍生物描述于 EP-A-421762、WO 01/70730、WO 01/80844 和 US2005/119480 中。此外烟碱衍生物已确认为注册号 136400-02-7、250683-10-4、861023-80-5 和 861025-04-9。烟碱半抗原描述于 WO 99/61054、WO 02/58635、WO 03/82329、WO 2005/40338 和 EP-A-1849780中。
本发明涉及烟碱衍生的半抗原、半抗原-间隔基缀合物以及可用于制备免疫原性半抗原-载体缀合物的缀合方法，所述免疫原性半抗原-载体缀合物用于为了提高戒烟治疗努力的戒烟率或降低复吸率而设计的疫苗。本发明也涉及含有上述缀合物以及佐剂或赋形剂的疫苗制剂，其用于免疫接种吸烟者以便引起针对所述半抗原的抗体，其转而识别和特异性结合烟碱。本发明进一步涉及一种在戒烟治疗努力中提高戒烟率或减少复吸率的方法，其包括将半抗原-载体缀合物给予希望戒烟的吸烟者。在其他实施方案中，疫苗可用于非吸烟者，以防止他们对烟碱上瘾，如果他们随后因吸烟或其他手段而暴露于烟中。本发明烟碱衍生的半抗原-载体缀合物的优点为它们比本领域中已知的烟碱衍生的半抗原-载体缀合物更具有免疫原性、更具特异性、更稳定、或具有其他更有用的性质。本发明烟碱衍生的半抗原-载体缀合物用于抗烟碱疫苗中可以为比其他已知烟碱衍生的半抗原-载体缀合物更具免疫原性的抗原。同样，包含本发明烟碱衍生的半抗原-载体缀合物作为抗原以及佐剂的疫苗制剂可比其他其通常添加佐剂氢氧化铝的抗烟碱疫苗制剂更具免疫原性，且导致依赖于烟碱/烟草和希望戒烟的患者较高戒烟率和较低复吸率。由于抗原内较好的固有免疫原性，以及通过佐剂增强，本发明的疫苗制剂也可更快速和用更少的剂量达成较高的抗烟碱抗体效价，相对于现有技术中已知的疫苗制剂，产生改良的顺应性。 本发明烟碱衍生的半抗原化合物的合成路径的优点为它们提供增加的总合成收率(优选增加总合成收率多达20倍)，包括合成步骤数的减少、导致所产生的烟碱衍生的半抗原的纯度增加(例如>99%纯度)或具有其他比现有技术中已知的合成路径更有用的性质。图I显示用包含本发明烟碱衍生的半抗原-缀合物与佐剂的疫苗免疫接种小鼠在不同的时间点对血浆中抗烟碱抗体水平的影响。通过肌肉内接种(在第0、28、42天)，用缀合于白喉类毒素(DT ;IOyg)的烟碱衍生的半抗原(来自制备4、7、8和12)，在氢氧化铝(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和 CpG24555 (含有免疫刺激 CpG 基序(motif)的 21-兀(mer) TLR9激动剂)(50 μ g)存在下，将BALB/c小鼠(η = 12每组)免疫接种。以ELISA测量血浆中的抗烟碱抗体水平(总IgG)。图2显示用含有包含本发明半抗原的缀合物抗原的抗烟碱疫苗免疫接种小鼠在不同的时间点对所产生的抗烟碱抗体在血浆中的亲和性的影响。通过肌肉内接种(在第0、28、42天)，用缀合于白喉类毒素(DT;10yg)的烟碱衍生的半抗原(来自制备4、7、8和12)，在氧氧化招(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和 CpG 24555 (50 μ g)存在下，将 BALB/c小鼠(η = 12每组)免疫接种。亲和性指数对应于从烟碱-BSA涂覆板洗脱50%的抗烟碱抗体所需要的硫氰酸铵的浓度，且较高浓度的要求表示具有较高的亲和性的抗体。图3显示用含有包含本发明半抗原的缀合物抗原的抗烟碱疫苗免疫接种小鼠对静脉内(IV)给予的3H-烟碱在脑和血液中的分布的影响。通过肌肉内注射(在第0、28、42天)，用缀合于白喉类毒素(DT;10yg)的烟碱衍生的半抗原(来自制备4、7、8和12)，在氢氧化招(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和 CpG 24555 (50 μ g)存在下，将 BALB/c 小鼠(n=6每组)免疫接种。在最后激发(boost) 2周之后,通过IV注射给予3H-烟碱(O. 05mg/kg烟碱，包含3 μ Ci3H-nic)，收集血液，灌注动物，取出大脑，定量3H的水平和测定3H的血浆/脑的比例。图4显示用得自本发明半抗原的疫苗免疫接种小鼠后与抗烟碱抗体的烟碱的相互作用。通过肌肉内接种(在第0、28、42天)，用缀合于白喉类毒素(DT;10yg)的烟碱衍生的半抗原(来自制备4、7、8和12),在氢氧化招(alum ；Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和CpG24555 (50 μ g)存在下，将BALB/c小鼠(η = 12每组)免疫接种。在最后激发2周之后，以竞争ELISA证明抗烟碱抗体与烟碱之相互作用。图5显示用含有本发明半抗原的疫苗免疫接种小鼠之后抗烟碱抗体的特异性。通过肌肉内注射(在第0、28、42天)，用缀合于白喉类毒素(DT;10yg)的烟碱衍生的半抗原(来自制备 4 和 12)，在氢氧化招(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和 CpG 24555 (50 μ g)存在下，将BALB/c小鼠(η = 12每组)免疫接种。在最后激发2周之后，抗烟喊抗体对对烟碱、可替宁、乙酰胆碱和伐尼克兰的特异性以竞争ELISA测量。图6显示以使用不同间隔基将本发明烟碱衍生的半抗原缀合于载体的抗烟碱疫苗免疫接种的小鼠在不同的时间点对血浆中的抗烟碱抗体水平的影响。通过肌 肉内注射(在第0、28、42天)，用缀合于白喉类毒素(DT;10yg)且缀合物使用不同接头(制备24-34)的烟碱衍生的半抗原(制备4;5’氨基丙基烟碱)，在氢氧化铝(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和 CpG 24555 (50 μ g)存在下，将 BALB/c 小鼠(η = 12 每组)免疫接种。以ELISA测量血浆中的抗烟碱IgG Ab水平。图7显示以使用不同间隔基将本发明烟碱衍生的半抗原缀合于载体的抗烟碱疫苗免疫接种的小鼠对血浆中抗烟碱抗体的水平和亲和性及对血浆和脑中3H-烟碱的分布的影响。通过肌肉内接种(在第0、28、42天)用缀合于白喉类毒素(DT;10yg)且缀合物使用不同接头(制备24-34)的烟碱衍生的半抗原(制备4;5’氨基丙基烟碱)，在氢氧化铝(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和 CpG 24555 (50 μ g)存在下，将 BALB/c 小鼠(η = 12 每组)免疫接种。在第三次免疫接种2周之后，以ELISA测量血浆中的抗烟碱IgG Ab水平及以硫氰酸铵分析测量亲和性。通过IV注射给予3H-烟碱(O. 05mg/kg烟碱包含3 μ Ci3H_nic)，收集血液，灌注动物，取出大脑，定量3H的水平和测定3H的血浆/脑的比例。图8显示以使用不同间隔基将本发明烟碱衍生的半抗原缀合于载体的抗烟碱疫苗免疫接种的小鼠在不同的时间点对血浆中抗烟碱抗体的水平的影响。通过肌肉内接种(在第0、28、42天)，用缀合于白喉类毒素(DT;10yg)且缀合物使用不同接头(制备24-34)的烟碱衍生的半抗原(制备12 ;5’氨基乙氧基烟碱)，在氢氧化铝(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和 CpG 24555 (50 μ g)存在下，将 BALB/c 小鼠(η = 12 每组)免疫接种。以ELISA测量血浆中的抗烟碱抗体水平(总IgG)。图9显示以使用不同间隔基将本发明烟碱衍生的半抗原缀合于载体的抗烟碱疫苗免疫接种的小鼠对血浆中抗烟碱抗体的水平和亲和性及对血浆和脑中3H-烟碱的分布的影响。通过肌肉内接种(在第0、28、42天)，用缀合于白喉类毒素(DT;10yg)且缀合物使用不同接头(制备24-34)的烟碱衍生的半抗原(制备12;5’氨基乙氧基烟碱)，在氢氧化铝(alum;Alhydrogel-85:40y gAl3+)和 CpG 24555 (50 μ g)存在下，将 BALB/c 小鼠(η =12每组)免疫接种。在第三次免疫接种2周之后，以ELISA测量血浆中的抗烟碱IgG Ab水平及以硫氰酸铵分析测量亲和性。通过IV注射给予3H-烟碱(0.05!1^/1^烟碱，包含3 4以3H-nic)，收集血液，灌注动物，取出大脑，定量3H的水平和测定3H之血浆/脑的比例。图10显示本发明半抗原-载体缀合物的丁二酰化在不同的时间点对血浆中抗烟碱抗体水平的影响。通过肌肉内接种(在第0、28、42天)，用缀合于白喉类毒素(DT;IOug)且缀合物使用2种不同条件制备(各为有或没有丁二酸酐步骤)的烟碱衍生的半抗原(制备4;5’氨基丙基烟碱)，在氢氧化招(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和CpG24555 (50 μ g)存在下，将BALB/c小鼠(η = 12每组)免疫接种。以ELISA测量血浆中的抗烟碱抗体水平(总IgG)。 图11显示本发明半抗原-载体缀合物的丁二酰化对3H-烟碱在血液和脑中的分布的影响。通过肌肉内接种(在第0、28、42天)，用缀合于白喉类毒素(DT;10yg)且缀合物使用2种不同条件制备(各为有或没有丁二酸酐步骤)的烟碱衍生的半抗原(制备4 ;5’氨基丙基烟碱)，在氢氧化招(alum; Alhydroge 1-85:40 μ gAl3+)和 CpG 24555 (50 μ g)存在下，将BALB/c小鼠(n= 12每组)免疫接种。在最后激发2周之后，通过IV注射给予3H-烟碱(0.0511^/1^烟碱，包含311(^ 3H-niC)，收集血液，灌注动物，取出大脑，定量3H在脑和血浆中的水平。图12显示以使用不同间隔基将本发明烟碱衍生的半抗原缀合于载体的抗烟碱疫苗免疫接种的小鼠在不同的时间点对血浆中抗烟碱抗体水平的影响。通过肌肉内接种(在第0、28、42天)，用缀合于白喉类毒素(DT5IOyg)或CRM197(IOyg)且缀合物使用不同接头(制备24-34)的烟碱衍生的半抗原(制备12;5’氨基乙氧基烟碱)，在氢氧化铝(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和 CpG 24555 (50 μ g)存在下，将 BALB/c 小鼠(η = 12 每组)免疫接种。以ELISA测量血浆中的抗烟碱抗体水平(总IgG)。图13显示用抗烟碱疫苗免疫接种的小鼠对3H-烟碱在小鼠中的分布的影响。通过肌肉内接种(在第0、28、42天)，用缀合于白喉类毒素(DT;10yg)或CRM197 (10 μ g)的烟碱衍生的半抗原(制备12 ;5’氨基乙氧基烟碱)，在氢氧化铝(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和 CpG 24555 (50 μ g)存在下，将 BALB/c 小鼠(η = 12 每组)免疫接种。在第三次免疫接种二周之后，通过IV注射给予3H-烟碱(O. 05mg/kg烟碱，包含3 μ Ci 3H-niC)，收集血液，灌注动物，取出大脑，定量3H的水平和测定相对于对照组动物的3H-烟碱在脑中的％改变。图14显示用抗烟碱疫苗免疫接种的小鼠在不同的时间点对血浆中的抗烟碱抗体水平的影响。通过肌肉内接种(在第0、28、42天)，用缀合于白喉类毒素(DT;10yg)或CRM197(IOyg)的烟碱衍生的半抗原(制备12 ;5’氨基乙氧基烟碱)，在氢氧化铝(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和 CpG 24555 (50 μ g)存在下，将 BALB/c 小鼠(n=12 每组)免疫接种。评估不同半抗原装载的范围。以ELISA测量血浆中的抗烟碱抗体水平(总IgG)。图15显示用抗烟碱疫苗免疫接种的小鼠对小鼠中的3H-烟碱分布的影响。通过肌肉内接种(在第O、28、42天)，用缀合于白喉类毒素(DT ；10μ g)或CRM197 (10 μ g)的烟碱衍生的半抗原(制备12 ;5’氨基乙氧基烟碱)，在氢氧化招(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和CpG 24555 (50 μ g)存在下，将BALB/c小鼠(η = 12每组)免疫接种。评估不同半抗原装载的范围。在第三次免疫接种二周之后，通过IV注射给予3H-烟碱(0.05mg/kg烟碱，包含3 μ Ci3H-nic)，收集血液，灌注动物，取出大脑，定量3H的水平和测定相对于对照组动物的3H-烟碱在脑中的％改变。图16-18显示用抗烟碱疫苗免疫接种的小鼠在不同的时间点对血浆中的抗烟碱抗体水平和亲和性的影响。通过肌肉内接种，用缀合于CRM197(IOyg)的烟碱衍生的半抗原(制备12;5’氨基乙氧基烟碱)，在氢氧化铝(alum;Alhydrogel-85:40y gAl3+)和CpG24555 (50 μ g)存在下或者在 ISC0MATRIXaMX;0. 1-3. O 单位)存在下，将 BALB/c 小鼠(η =10每组)免疫接种。以ELISA (第21和28天)测量血浆中的抗烟碱抗体水平(总IgG)和以抑制ELISA测量亲和性。图16 [i]显示第I次剂量3周后的结果；且[ii]显示示第2次剂量I周后的结果。图17显不在弟_■次剂量一周后的未和性(IC5tl)。图18显不烟喊在血浆中的螯合(上)；烟碱吸收于脑中(下)。图19和20显示表6的烟碱衍生的半抗原-载体缀合物的缀合条件对抗烟碱抗体水平和对应IC5tl值的影响。通过肌肉内接种，用烟碱衍生的半抗原，在氢氧化铝(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和 CpG 24555 (50 μ g)存在下，将 BALB/c 小鼠(η = 10 每组)免疫接种。以ELISA测量血浆中的抗烟碱抗体水平(总IgG)和以抑制ELISA测量亲和性。图21和22显示对于表6的半抗原-载体缀合物的3H-烟碱在血液和脑中的分布。通过肌肉内接种，用烟碱衍生的半抗原，在氢氧化招(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和CpG 24555 (50 μ g)存在下，将BALB/c小鼠(η = 10每组)免疫接种。在第二次免疫接种一周之后，通过IV注射给予3H-烟碱(0.0511^/1^烟碱，包含311(^ 3H_nic)，收集血液，灌注动 物，取出大脑，定量3H的水平和测定相对于对照组动物的3H-烟碱在血液和脑中之％改变。图23显示测试具有不同百分比单体载体蛋白的半抗原-载体缀合物结合于CpG/Alhydrogel的结果。通过用已知量的半抗原-载体缀合物温育CpG/Alhydrogel,然后测量温育后留在溶液的缀合物浓度来测定结合。缀合物浓度的％减少等同于结合至CpG/Alhydrogel的％缀合物。通过肌肉内注射,用10 μ g不同缀合物将BALB/c小鼠(η = 10每组)在氢氧化招(alum;Alhydrogel-85:40 μ gAl3+)和10 μ gCpG 24555存在下免疫接种。在第二次免疫接种一周之后，通过IV注射给予3H-烟碱(O. 05mg/kg烟碱，包含3 μ Ci3H_nic)，收集血液，灌注动物，取出大脑，定量3H的水平和测定相对于对照组动物的3H-烟碱在血液和脑中的％改变。序列表SEQ ID NO: I为免疫刺激寡核苷酸ODN CpG 24555的核苷酸序列。

X, η ΓΛ
、5 W2 GH3
(I)其中W 为-CH2-或-O-;且 X 为-NH2 或-SH。在一实施方案中，W位于吡啶环的位置2、5或6。在另一实施方案中，W位于吡啶环的位置5。在另一实施方案中，W为-O-。在另一实施方案中，W为-O-;且W位于吡啶环的位置5。在一另外实施方案中,所述半抗原为


本发明部分地涉及式(III)的烟碱衍生的半抗原-载体缀合物，其中m、n、W、-(间隔基)-、X*和Y如说明书中所定义。在某些实施方案中，所述烟碱衍生的半抗原-载体缀合物可用于制备用于治疗和/或预防烟碱成瘾的疫苗。