专利名称：肽的重构和糖缀合的制作方法肽的重构和糖缀合本申请为申请号为拟820073.乂，申请日为2002年10月09日，发明名称为“肽的重构和糖缀合”的发明的分案申请。大多数天然存在的肽含有在一级肽链的长度上通过与选定数目的氨基酸的特定键合而附着到肽上的糖类部分。因而，许多天然存在的肽称为“糖肽”。任何给定的肽上的糖基化模式的可变性对于该肽的功能具有巨大的意义。例如，肽上N-连接的聚糖的结构可影响肽的各种特征，包括细胞或生物中肽的蛋白酶敏感性、细胞内运输、分泌、组织定向、生物学半衰期和抗原性。这些特征的一种或多种的改变大大地影响了肽在其天然环境中的功效，且也影响了肽作为治疗剂在一定状况中的功效，在该状况中该肽即是为该目的而生成的。附着到肽链上的糖类结构已知为“聚糖”分子。在肽上存在的特定的聚糖结构影响该肽的可溶性和聚集特征、一级肽链的折叠及其功能或酶活性、该肽对蛋白水解攻击的抗性和对导致肽的无活性形式向活性形式转变的蛋白水解的控制。重要的是，存在于聚糖分子上的末端唾液酸残基影响哺乳动物循环系统中肽的半衰期的长度。其聚糖不含有末端唾液酸残基的肽将由肝快速从循环中去除，这是使肽的任何潜在的治疗益处失效的事件。天然发现存在于糖肽上的聚糖结构一般分为两类，即N-连接的和0-连接的。在真核细胞中表达的肽一般是在肽一级结构的位点上在天冬酰胺残基上N-糖基化的，该位点含有天冬酰胺-X-丝氨酸/苏氨酸的序列，其中X可为除脯氨酸和天冬氨酸之外的任何氨基酸。这种肽中的糖类部分已知为N-连接的聚糖。N-糖基化的早期事件发生于内质网(ER)中且在哺乳动物、植物、昆虫和其他高等真核生物中是相同的。首先，包含14 个糖残基的寡糖链在脂质载体上构建。当新生肽翻译并转位进入ER时，整个寡糖链则在膜结合的糖基转移酶催化的反应中转移到天冬酰胺残基的酰胺基团上。N-连接的聚糖进一步在ER和高尔基体两者中进行加工。进一步的加工通常需要在由糖基化酶和糖基转移酶催化的反应中去除一些糖残基并添加其他的糖残基，其中所述酶对于去除和添加的糖残基是特异性的。—般地，N-连接的聚糖的最终结构依赖于产生该肽的生物。例如，细菌产生的肽通常是完全无糖基化的。在昆虫细胞中表达的肽含有高的甘露糖、Paimci-甘露糖N-连接的寡糖链以及其它。哺乳动物细胞培养物中产生的肽通常依赖于如物种和细胞培养条件而有差别地糖基化。即使在相同的物种中和在相同的条件下，有时也遇到糖基链中某些异质性。 进一步地，植物细胞中产生的肽包含显著与那些动物细胞中产生的不同的聚糖结构。在生产重组肽的领域(特别是当该肽用作治疗剂时)中的困境是能够生成正确糖基化的肽，即能够生成具有与存在于肽的天然形式中的相似或相同的聚糖结构的肽。大多数重组方法产生的肽包含与天然存在的聚糖不同的聚糖结构。在本领域中已提出了多种方法来定制肽的糖基化模式，包括那些描述于WO 99/22764,WO 98/58964,WO 99/54342 和美国专利 No. 5，047, 335 中的，以及其它。基本地， 对肽的体外糖基化所必需的许多酶已进行了克隆和测序。在一些情况中，这些酶已在体外用于将特定的糖添加到肽上不完全的聚糖分子上。在另一些情况中，细胞已进行了基因工程加工以表达酶和想要的肽的组合，从而可在细胞中发生想要的糖部分向表达的肽中的添加。肽也可通过添加0-连接的聚糖而修饰，该聚糖由于其在粘蛋白糖肽上的普遍存在也称为粘蛋白类型的聚糖。与连接到天冬酰胺残基上并通过整体从脂质结合的中间体上转移寡糖而形成的N-聚糖不同，0-聚糖主要连接到丝氨酸和苏氨酸残基上并通过逐步添加来自核苷酸糖类的糖而形成(Tanner等人，Biochim. Biophys. Acta. 906 :81-91(1987)； 和Hounsell等人，Glycoconj. J. 13 19-26 (1996))。肽功能可受到在其上存在的O-连接聚糖结构的影响。例如，P-选择蛋白配体的活性受到其上存在的O-连接聚糖结构的影响。对于O-连接聚糖结构的综述，参见khachter和Brockhausen，The Biosynthesis ofBranched O-Linked Glycans,1989, Society for Experimental Biology, pp. 1—26 (英国)。其他糖基化模式是通过向蛋白质羧基末端羧基基团连接糖基磷脂酰肌醇而形成的 (Takeda 等人，Trends Biochem. Sci. 20 :367-371 (1995)；和 Udenfriend 等人，Ann. Rev. Biochem. 64 :593-591(1995))。尽管目前存在各种修饰肽的N-连接聚糖的技术，但本领域需要生成肽的通用方法，该肽具有想要的即定制的糖基化模式。本领域特别需要肽的定制(Customize)的体外糖基化，其中结果所得的肽可在工业规模上生产。本发明可满足这个和其他的需要。给予糖基化和非糖基化的肽以产生特定的生理学反应是医药领域众所周知的。用于该目的的最知名的肽之一是胰岛素，它用于治疗糖尿病。酶也已因其治疗益处而使用。限制了治疗性肽的应用的主要因素是大多数肽的免疫原性特性。在患者中，对给予的肽的免疫原性反应可中和肽和/或导致患者中变态反应的发展。治疗性肽的其他不足包括亚最优的效力和快速的清除速率。在本领域中已认识到肽治疗剂固有的问题，且已研究了各种消除所述问题的方法。为了提供可溶性的肽治疗剂，已将合成的聚合物附着到肽主链上。聚(乙二醇)(“PEG”)是已与肽缀合的示例性的聚合物。已证明使用PEG来使肽治疗剂衍生化可降低肽的免疫原性并延长从循环中的清除时间。例如，U. S. Pat. No. 4，179，337 (Davis等人)涉及无免疫原性的肽，如与聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇偶联的酶和肽激素。每摩尔肽使用了 10 100摩尔的聚合物且维持了至少15%的生理学活性。WO 93/15189 (Veronese等人)涉及通过将蛋白水解酶连接到大分子化的抑制剂上而维持聚乙二醇修饰的蛋白水解酶活性的方法。该缀合物计划用于医学应用。PEG及其衍生物向肽附着的主要模式是通过肽氨基酸残基的非特定的连接。例如， 美国专利No. 4，088，538公开了与PEG共价连接的酶的酶活性聚合物-酶缀合物。类似地， 美国专利No. 4，496，689公开了 α -1蛋白酶抑制剂与聚合物如PEG或甲氧基聚(乙二醇) (“mPEG”)共价附着的复合物。Abuchowski 等人(J. Biol. Chem. 252 :3578(1977))公开了 mPEG与牛血清白蛋白的氨基团的共价附着。美国专利No. 4，414，147公开了通过将其与二羧酸的酸酐如聚(乙烯琥珀酸酐)的缀合而使干扰素疏水性较低的方法。PCT WO 87/00056 公开了 PEG和聚氧乙基化多元醇与蛋白质如干扰素-β、白细胞介素-2和免疫毒素的缀合。 EP 154，316公开并请求保护化学修饰的淋巴因子如含有直接与淋巴因子的至少一个一级氨基基团连接的PEG的IL-2。美国专利No. 4，055，635公开了与聚合物质如多糖共价连接的蛋白水解酶水溶性复合物的药物组合物。PEG与肽附着的另一种模式是通过肽上糖基残基的非特定的氧化。氧化的糖可用作将PEG部分附着到肽上的座位。例如，M，Timkulu (W0 94/05332)公开了胼-PEG或氨基-PEG将PEG添加到糖蛋白质上的应用。糖基部分随机地氧化为相应的醛，并随后与氨基-PEG偶联。在上述每一种方法中，聚(乙二醇)是以随机的非特异性的方式添加到肽主链的反应性残基上的。为了生产治疗性的肽，明显想要的是一种衍生化策略，该策略导致特定标记的、易于表征的且基本均一的产物的形成。在糖类合成中使用两类主要的酶，即糖基转移酶(如唾酸转移酶、寡糖基转移酶、 N-乙酰葡糖胺转移酶)和糖苷酶。糖苷酶进一步分为外切糖苷酶(如甘露糖苷酶、 β-葡糖苷酶)和内切糖苷酶(如End0-A、End0-M)。这几类酶的每一个已成功地合成用于制备糖类。对于一般综述，参见 Crout 等人，Curr. Opin. Chem. Biol. 2 :98-111 (1998)。糖基转移酶修饰肽上的寡糖结构。糖基转移酶对于以良好的立体化学和区域化学 (regiochemical)控制产生特定产物是有效的。糖基转移酶已用于制备寡糖和用于修饰末端的N-或0-连接的糖类结构，特别是在哺乳动物细胞产生的肽上的。例如，糖肽的末端寡糖已完全唾酸化和/或岩藻糖基化已提供更坚固的糖结构，这改善了糖肽的药物动力学和各种其他的生物学特性。例如，β-1，4-半乳糖基转移酶可用于合成乳糖胺，这是糖基转移酶用于糖类合成的一个例子(参见如Wong等人，J. Org. Chem. 47 :5416-5418 (1982))。 此外，许多合成程序使用α-唾酸转移酶以将唾液酸从胞苷_5’ -单磷酸-N-乙酰神经氨酸转移到半乳糖的 3-0Η 或 6-0Η(参见如 Kevin 等人，Chem. Eur. J. 2 1359-1362 (1996))。 岩藻糖基转移酶可用于合成途径以将岩藻糖单位从鸟苷-5’ - 二磷酸岩藻糖转移到糖受体的特定羟基上。例如，Ichikawa通过涉及唾酸化的乳糖胺由克隆的岩藻糖基转移酶进行岩藻糖基化的方法制备了唾酸Lewis-X (Ichikawa等人，J. Am. Chem. Soc. 114 9283-拟98(1992))。对于用于治疗用途的糖缀合物合成的最近进展的讨论，参见Koeller 等人，Nature Biotechnology 18 :835-841(2000) 也参见美国专利 No. 5，876，980、 6，030，815,5,728，554,5, 922，577 和 W0/9831826。糖苷酶也可用于制备糖类。糖苷酶通常催化糖苷键的水解。然而，在适当条件下，它们可用于形成该键。用于糖类合成的大多数糖苷酶是外切糖苷酶；糖基转移发生于底物的非还原末端。糖苷酶在糖基-酶中间体中结合糖基供体，该中间体可由水劫取而产生水解产物，或由受体劫取生成新的糖苷或寡糖。应用外切糖苷酶的一个示例性途径是所有N-连接的糖肽的核心三糖的合成，包括由甘露糖苷酶作用形成的甘露糖苷键 (Singh 等人，Chem. Commun. 993-994 (1996))。在应用糖苷酶以形成糖苷键的另一个示例性应用中，制备了突变的糖苷酶，其中活性位点的正常的亲核氨基酸改变为非亲核氨基酸。该突变的酶不水解糖苷键，但仍可形成该键。这种突变的糖苷酶可用于用α-糖基氟化物供体和糖苷受体分子制备寡糖 (Withers 等人，美国专利 No. 5，716，812)。尽管其应用不如外切糖苷酶的普遍，但内切糖苷酶也用于制备糖类。基于应用内切糖苷酶的方法具有可转移寡糖而不是单糖的优点。已用endo-β-Ν-乙酰葡糖胺如endo-F、endo-M将寡糖片段添加到底物上了(Wang等人，Tetrahedron Lett. 37 1975-1978)；和 Haneda 等人，Carbohydr. Res. 292 :61-70 (1996))。除其在制备糖类的应用之外，上述的酶也可应用于合成糖肽。已发表了核糖核酸酶B的均质糖形式(glycoform)的合成(Witte K.等人，J. Am. Chem. Soc. 119 2114-2118 (1997))。核糖核酸酶B的高甘露糖核心可通过用内切糖苷酶H处理糖肽而切割。 该切割特定地发生于两个核心GIcNAC残基之间。然后通过依次应用β_1，4_半乳糖基转移酶、α-2，3-唾酸转移酶和α-1，3-岩藻糖基转移酶，四糖唾酸Lewis X可在均质的蛋白质上剩余的GIcNAC锚定位点上酶促重建。然而，尽管每一个酶催化步骤都以极好的产量进行，但这种程序不能适用于在工业规模上生成糖肽。结合化学和酶合成元件的方法也是本领域中公知的。例如，Yamamoto及同事 (Carbohydr. Res. 305 :415-422(1998))报道了用内切糖苷酶对糖肽、糖基化的肽T的化学酶促(chemoenzymatic)合成。N-乙酰葡糖胺肽是完全由化学方法合成的。该肽随后精心用人类运铁蛋白肽的寡糖进行酶处理。糖部分是通过用内切-N-乙酰葡糖胺酶 (acetylglucosaminidase)处理而添加到肽上的。结果所得的糖基化的肽与肽T和N-乙酰葡糖胺肽T相比是高度稳定的并对蛋白水解有抗性。也已探究了用于修饰具有报道基团的肽结构的糖基转移酶的应用。例如， Brossmer等人(美国专利No. 5，405，753)公开了唾液酸的荧光标记的胞苷单磷酸(“CMP”) 衍生物的形成和荧光糖苷在测定唾酸转移酶活性和细胞表面、糖蛋白和肽的荧光标记中的应用。Gross 等人(Analyt. Biochem. 186 =127(1990))描述了类似的测定。Bean 等人(美国专利No. 5，432，059)公开了利用对不充分糖基化的蛋白质的重新糖基化对糖基化缺陷病症的测定。该缺陷蛋白质是用荧光标记的CMP糖苷重新糖基化的。每一个荧光唾液酸衍生物都用荧光部分在唾液酸中通常乙酰化的9-位置或胺上取代。应用荧光唾液酸衍生物的方法是对糖基转移酶或非糖基化的或不正确糖基化的糖蛋白是否存在的测定。该测定是在生物学来源的样品中对少量的酶或糖蛋白进行的。在现有技术领域中尚未公开或提出利用修饰的唾液酸以制备或工业规模对糖基化的或非糖基化的肽进行酶促衍生化。也已有相当多的努力涉及通过改变由细胞表面呈现的糖基残基而修饰该细胞表面。例如，Fukuda及同事已发展了将具有限定结构的糖苷附着到细胞表面的方法。该方法利用岩藻糖基转移酶不严格的底物特异性，该酶可转移岩藻糖和具有不同糖基底物的岩藻糖类似物(Tsuboi 等人，J. Biol. Chem. 271 :27213 (1996))。酶促方法也已用于活化糖肽上的糖基残基以有助于随后的化学处理。糖基残基一般是用半乳糖氧化酶活化的，该酶将末端半乳糖残基转变为相应的醛。该醛随后与含有氨的修饰基团偶联。例如，Casares等人(Nature Biotech. 19 :142(2001))已将阿霉素附着到重组的MHCII-肽嵌合体的氧化的半乳糖残基上。也已对糖基残基进行修饰以使其含有酮基团。例如，Mahal及同事(Science 276 1125(1997))已制备了 N-乙酰丙酰甘露糖胺(“ManLev”)，它在天然底物中通常由乙酰基团占据的位置具有酮官能团。用ManLev处理细胞，从而将酮基团整合入细胞表面。也参见 Saxon 等人，Science 287 :2007 (2000) ；Hang 等人，J. Am. Chem. Soc. 123 1242 (2001)； Yarema 等人，J. Biol. Chem. 273 :31168(1998)；和 Charter 等人，Glycobiology 10 1049(2000)。修饰细胞表面的方法尚未在不存在细胞时应用于修饰糖基化的或非糖基化的肽。 进一步地，细胞表面修饰方法未用于将修饰的糖基供体部分酶促整合入肽中。此外，没有一种细胞表面修饰方法在以工业规模生产糖基修饰的肽中是可行的。尽管有涉及对糖结构酶促处理的努力，但仍需要有工业上可行的方法以用于用修饰基团对糖基化的和非糖基化的肽进行修饰，该修饰基团如水溶性聚合物、治疗部分、生物分子等。特别感兴趣的是其中修饰的肽具有改善的特性的方法，该改善的特性增强了该肽作为治疗或诊断剂的应用。本发明满足了这些和其他的需要。发明_既述本发明包括多个对肽进行重构以使其具有附着于其上的聚糖结构的方法。尽管在此处描述了特定的聚糖结构，但本发明不应该理解为限制于任何一个特定的结构。此外，尽管在此处描述了特定的肽，但本发明不应该受所描述的肽的特性的限制，而应该包含任何或所有适当的肽及其变体。随后的描述公开了本发明优选的实施方案并提供了附加的权利要求的书面描述。 本发明包含任何和所有这些实施方案的变体，该变体在阅读了本发明的说明书之后是或者将是显而易见的。本发明包括对具有如下分子式的肽进行重构的无细胞的体外方法1.一种对具有如下分子式的肽进行重构的无细胞体外方法2.权利要求1的方法，该方法进一步包含(c)去除X1，从而暴露所述AA；和(d)使所述AA与至少一种糖基转移酶和至少一种糖基供体在适合于将所述至少一种糖基供体转移到所述AA的条件下接触，从而对所述肽进行重构。3.权利要求1的方法，该方法进一步包含(e)在步骤(b)之前，去除在翻译后修饰过程中添加到所述糖上的基团。4.权利要求3的方法，其中该基团是选自磷酸、硫酸、羧酸及其酯的成员。
5.权利要求1的方法，其中该肽具有分子式
6.权利要求1的方法，其中至少一种所述糖基供体包含修饰基团。
7.权利要求1的方法，其中该修饰基团是选自水溶性聚合物、治疗部分、可探测的标记、反应性连接体基团和导向部分的成员。
8.权利要求7的方法，其中该修饰基团是水溶性聚合物。
9.权利要求8的方法，其中该水溶性聚合物包含聚(乙二醇)。
10.权利要求9的方法，其中该聚(乙二醇)具有基本单分散的分子量分布。
11.权利要求1的方法，其中该肽选自粒细胞集落刺激因子、干扰素-α、干扰素_β、 凝血因子Vila、凝血因子IX、促卵泡激素、促红细胞生成素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、干扰素-Y、α -1-蛋白酶抑制剂、β -葡糖苷酶、组织纤溶酶原激活物蛋白质、白细胞介素_2、凝血因子VIII、嵌合的肿瘤坏死因子受体、尿激酶、嵌合的抗-糖蛋白Ilb/IIIa抗体、嵌合的抗-HER2抗体、嵌合的抗-呼吸道合胞病毒抗体、嵌合的抗-CD20抗体、DNase、嵌合的抗-肿瘤坏死因子抗体、人胰岛素、乙型肝炎表面抗原和人生长激素。
12.—种对具有如下分子式的肽进行重构的无细胞体外方法2
13.权利要求12的方法，其中所述去除步骤(a)产生了其中a、b、c、e和χ各自为0的截短的聚糖。
14.权利要求12的方法，其中X3、X5和X7选自(甘露糖)2和(甘露糖)z_(X8)y其中X8是选自单糖和寡糖的糖基部分；y是选自0和1的整数；和ζ是1-20的整数，其中当ζ是3或更大时，(甘露糖)z选自线性和分支的结构。
15.权利要求12的方法，其中X4选自GIcNAC和木糖。
16.权利要求12的方法，其中X3、X5和X7是(甘露糖)u，其中u选自1-20的整数，且当u是3或更大时，(甘露糖)u选自线性和分支的结构。
17.权利要求12的方法，其中至少一种所述糖基供体包含修饰基团。
18.权利要求17的方法，其中该修饰基团是选自水溶性聚合物、治疗部分、可探测的标记、反应性连接体基团和导向部分的成员。
19.权利要求18的方法，其中该修饰基团是水溶性聚合物。
20.权利要求19的方法，其中该水溶性聚合物包含聚(乙二醇)。
21.权利要求20的方法，其中该聚(乙二醇)具有基本单分散的分子量分布。
22.权利要求12的方法，其中该肽选自粒细胞集落刺激因子、干扰素-α、干扰素、 凝血因子Vila、凝血因子IX、促卵泡激素、促红细胞生成素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、干扰素-Y、α -1-蛋白酶抑制剂、β -葡糖苷酶、组织纤溶酶原激活物蛋白质、白细胞介素-2、凝血因子VIII、嵌合的肿瘤坏死因子受体、尿激酶、嵌合的抗-糖蛋白Ilb/IIIa抗体、嵌合的抗-HER2抗体、嵌合的抗-呼吸道合胞病毒抗体、嵌合的抗-CD20抗体、DNase、嵌合的抗-肿瘤坏死因子抗体、人胰岛素、乙型肝炎表面抗原和人生长激素。
23. —种对包含聚糖的具有如下分子式的肽进行重构的无细胞体外方法
24.权利要求23的方法，其中至少一种所述糖基供体包含修饰基团。
25.权利要求23的方法，其中该修饰基团是选自水溶性聚合物、治疗部分、可探测的标记、反应性连接体基团和导向部分的成员。
26.权利要求25的方法，其中该修饰基团是水溶性聚合物。
27.权利要求沈的方法，其中该水溶性聚合物包含聚(乙二醇)。
28.权利要求27的方法，其中该聚(乙二醇)具有基本单分散的分子量分布。
29.权利要求23的方法，其中该肽选自粒细胞集落刺激因子、干扰素-α、干扰素、 凝血因子Vila、凝血因子IX、促卵泡激素、促红细胞生成素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、干扰素-Y、α -1-蛋白酶抑制剂、β -葡糖苷酶、组织纤溶酶原激活物蛋白质、白细胞介素-2、凝血因子VIII、嵌合的肿瘤坏死因子受体、尿激酶、嵌合的抗-糖蛋白Ilb/IIIa抗体、嵌合的抗-HER2抗体、嵌合的抗-呼吸道合胞病毒抗体、嵌合的抗-CD20抗体、DNase、嵌合的抗-肿瘤坏死因子抗体、人胰岛素、乙型肝炎表面抗原和人生长激素。
30.权利要求1的方法，其中该肽具有分子式
31.权利要求1的方法，其中该肽具有分子式
32.权利要求31的方法，其中X11和X12是(甘露糖),，其中q是选自1-20的整数，且当q是3或更大时，(甘露糖)，选自线性和分支的结构。
33.权利要求30的方法，其中该肽具有分子式
34.权利要求33的方法，其中X14和X15是独立选自GIcNAc和Sia的成员；且i和k独立地选自整数0和1，前提是i 和k中的至少一个是1，且如果k是1，那么g、h和j是0。
35.权利要求1的方法，其中该肽具有分子式
36.权利要求1的方法，其中该去除步骤利用糖苷酶。
37.一种对具有如下分子式的肽进行重构的无细胞体外方法
38.权利要求37的方法，其中该修饰基团是选自水溶性聚合物、治疗部分、可探测的标记、反应性连接体基团和导向部分的成员。
39.权利要求38的方法，其中该修饰基团是水溶性聚合物。
40.权利要求39的方法，其中该水溶性聚合物包含聚(乙二醇)。
41.权利要求40的方法，其中该聚(乙二醇)具有基本单分散的分子量分布。
42.权利要求37的方法，其中该肽选自粒细胞集落刺激因子、干扰素-α、干扰素、 凝血因子Vila、凝血因子IX、促卵泡激素、促红细胞生成素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、干扰素-Y、α -1-蛋白酶抑制剂、β -葡糖苷酶、组织纤溶酶原激活物蛋白质、白细胞介素_2、凝血因子VIII、嵌合的肿瘤坏死因子受体、尿激酶、嵌合的抗-糖蛋白Ilb/IIIa抗体、嵌合的抗-HER2抗体、嵌合的抗-呼吸道合胞病毒抗体、嵌合的抗-CD20抗体、DNase、嵌合的抗-肿瘤坏死因子抗体、人胰岛素、乙型肝炎表面抗原和人生长激素。
43.一种肽和改变所述肽的特性的修饰基团之间的共价缀合物，其中该修饰基团通过完整的糖基连接基团在所述肽的预先选择的糖基或氨基酸残基上共价地附着到所述肽上。
44.权利要求43的共价缀合物，其中该修饰基团是选自水溶性聚合物、治疗部分、可探测的标记、反应性连接体基团和导向部分的成员。
45.权利要求43的共价缀合物，其中该修饰基团和完整的糖基连接基团前体是作为共价附着单位经过酶的作用与肽结合的，该酶将所述前体转变为所述完整的糖基连接基团， 从而形成该缀合物。
46.权利要求43的共价缀合物，该共价缀合物包含通过第一个完整的糖基连接基团与所述肽的第一个残基共价结合的第一个修饰基团，和通过第二个完整的糖基连接基团与所述肽的第二个残基共价结合的第二个糖基连接基团。
47.权利要求46的共价缀合物，其中该第一个残基和第二个残基是结构上相同的。
48.权利要求46的共价缀合物，其中该第一个残基和第二个残基具有不同的结构。
49.权利要求46的共价缀合物，其中该第一个残基和第二个残基是糖基残基。
50.权利要求46的共价缀合物，其中该第一个残基和第二个残基是氨基酸残基。
51.权利要求43的共价缀合物，其中该肽是在形成所述缀合物之前进行重构的。
52.权利要求51的共价缀合物，其中重构的肽是进行重构以引入所述完整糖基连接基团的受体部分的。
53.权利要求43的共价缀合物，其中该修饰基团是水溶性聚合物。
54.权利要求53的共价缀合物，其中该水溶性聚合物包含聚(乙二醇)。
55.权利要求43的共价缀合物，其中该肽选自粒细胞集落刺激因子、干扰素-α、干扰素-β、凝血因子Vila、凝血因子IX、促卵泡激素、促红细胞生成素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、干扰素-Y、α -1-蛋白酶抑制剂、β -葡糖苷酶、组织纤溶酶原激活物蛋白质、白细胞介素-2、凝血因子VIII、嵌合的肿瘤坏死因子受体、尿激酶、嵌合的抗-糖蛋白Ilb/IIIa 抗体、嵌合的抗-HER2抗体、嵌合的抗-呼吸道合胞病毒抗体、嵌合的抗-CD20抗体、DNase、嵌合的抗-肿瘤坏死因子抗体、人胰岛素、乙型肝炎表面抗原和人生长激素。
56.权利要求43的共价缀合物，其中该完整的糖基连接单位是选自唾液酸残基、Gal残基、GlcNAc残基和feilNAc残基的成员。
57.权利要求M的共价缀合物，其中该聚(乙二醇)具有基本单分散的分子量分布。
58.一种在聚合物和糖基化或非糖基化的肽之间形成共价缀合物的方法，其中该聚合物是通过完整的糖基连接基团与所述肽缀合的，该完整的糖基连接基团插入所述肽和所述聚合物之间并共价地与两者连接，该方法包含使该肽与一种混合物在足以形成该缀合物的条件下接触，其中该混合物包含与该聚合物共价连接的核苷酸糖和以该核苷酸糖为底物的糖基转移酶。
59.权利要求58的方法，其中该聚合物是水溶性聚合物。
60.权利要求58的方法，其中该糖基连接基团是共价附着于在该肽上共价附着的糖基残基上的。
61.权利要求58的方法，其中该糖基连接基团是共价附着于该肽的氨基酸残基上的。
62.权利要求58的方法，其中该聚合物包含选自聚环氧烷和多肽的成员。
63.权利要求62的方法，其中该聚环氧烷是聚(乙二醇)。
64.权利要求63的方法，其中该聚(乙二醇)具有约1 约20，000的聚合度。
65.权利要求64的方法，其中该聚乙二醇具有约1 约5，000的聚合度。
66.权利要求65的方法，其中该聚乙二醇具有约1 约1，000的聚合度。
67.权利要求58的方法，其中该糖基转移酶选自唾酸转移酶、半乳糖基转移酶、葡糖基转移酶、GalNAc转移酶、GlcNAc转移酶、岩藻糖基转移酶和甘露糖基转移酶。
68.权利要求58的方法，其中该糖基转移酶是重组生产的。
69.权利要求68的方法，其中该糖基转移酶是重组的原核生物酶。
70.权利要求68的方法，其中该糖基转移酶是重组的真核生物酶。
71.权利要求58的方法，其中该核苷酸糖选自UDP-糖苷、CMP-糖苷和GDP-糖苷。
72.权利要求71的方法，其中该核苷酸糖选自UDP-半乳糖、UDP-半乳糖胺、UDP-葡萄糖、UDP-葡糖胺、UDP-N-乙酰半乳糖胺、UDP-N-乙酰葡糖胺、GDP-甘露糖、GDP-岩藻糖、 CMP-唾液酸、CMP-NeuAc。
73.权利要求58的方法，其中该肽是治疗剂。
74.权利要求58的方法，其中该糖基化的肽在进行所述接触之前是部分去糖基化的。
75.权利要求58的方法，其中该完整的糖基连接基团是唾液酸残基。
76.权利要求58的方法，其中该方法在无细胞环境中进行。
77.权利要求58的方法，其中该共价缀合物是分离的。
78.权利要求77的方法，其中该共价缀合物通过膜过滤分离。
79.—种在第一个糖基化的或非糖基化的肽和第二个糖基化的或非糖基化的肽之间形成由连接体部分共同连接的共价缀合物的方法，其中该连接体部分通过在该第一个肽和该连接体部分之间插入并与两者共价连接的第一个完整糖基连接基团而与该第一个肽缀合，和该连接体部分通过在该第二个肽和该连接体部分之间插入并与两者共价连接的第二个完整糖基连接基团而与该第二个肽缀合；该方法包含(a)使该第一个肽与该连接体部分前体的衍生物接触，该前体包含该第一个完整糖基连接基团的前体和该第二个完整糖基连接基团的前体；(b)使(a)中的混合物与糖基转移酶在足以将该第一个完整糖基连接基团的该前体转变为该第一个完整糖基连接基团的条件下接触，其中该第一个糖基连接基团前体是该糖基转移酶的底物，从而在该连接体部分前体和该第一个肽之间形成第一个缀合物；(c)使该第一个缀合物和该第二个肽及糖基转移酶在足以将该第二个完整糖基连接基团的该前体转变为该第二个糖基连接基团的条件下接触，其中该第二个糖基连接基团的该前体是该糖基转移酶的底物，从而在该连接体部分和该第一个糖基化的或非糖基化的肽及该第二个糖基化的或非糖基化的肽之间形成该缀合物。
80.权利要求79的方法，其中该连接体部分包含水溶性聚合物。
81.权利要求80的方法，其中该水溶性聚合物包含聚(乙二醇)。
82.—种在第一个糖基化的或非糖基化的肽和第二个糖基化的或非糖基化的肽之间形成由连接体部分共同连接的共价缀合物的方法，其中该连接体部分与该第一个肽共价缀合，和该连接体部分通过在该第二个肽和该连接体部分之间插入并与两者共价连接的完整糖基连接基团而与该第二个肽缀合，该方法包含(a)使该第一个肽与该连接体部分的活化的衍生物接触从而形成第一个缀合物，其中该连接体部分的活化的衍生物包含与该第一个肽上的残基具有互补反应性的反应性官能团和该完整糖基连接基团的前体，并且其中接触是在足以于该反应性官能团和该残基之间形成共价键的条件下进行的；和(b)使该第一个缀合物和该第二个肽及糖基转移酶在足以将该完整糖基连接基团的该前体转变为该完整糖基连接基团的条件下接触，其中该糖基连接基团的该前体是该糖基转移酶的底物，从而在该第一个糖基化的或非糖基化的肽及该第二个糖基化的或非糖基化的肽之间形成由该连接体部分共同连接的该缀合物。
83.权利要求82的方法，其中该连接体部分包含水溶性聚合物。
84.权利要求83的方法，其中该水溶性聚合物包含聚(乙二醇)。
85.—种药物组合物，包含药物可接受的稀释剂和在聚合物和糖基化的或非糖基化的肽之间的共价缀合物，其中该聚合物是通过在该肽和该聚合物之间插入并与两者共价连接的完整糖基连接基团而与该肽缀合的。
86.一种用于在肽和修饰的糖之间形成缀合物的组合物，该组合物包含修饰的糖、糖基转移酶和肽受体底物的混合物，其中修饰的糖在其上共价地附着有选自聚合物、治疗部分和生物分子的成员。
87.一种由权利要求1的方法重构的肽。
88.一种包含权利要求87的肽的药物组合物。
89.一种由权利要求12的方法重构的肽。
90.一种包含权利要求89的肽的药物组合物。
91.一种由权利要求23的方法重构的肽。
92.一种包含权利要求91的肽的药物组合物。
93.一种由权利要求30的方法重构的肽。
94.一种包含权利要求93的肽的药物组合物。
95.一种由权利要求37的方法重构的肽。
96.一种包含权利要求95的肽的药物组合物。
97.一种具有下面分子式的化合物
98.权利要求97的化合物，具有下面分子式
99.一种对具有如下分子式的肽进行重构的无细胞体外方法
100.一种在粒细胞集落刺激因子(G-CSF)肽和修饰基团之间形成缀合物的方法，其中该修饰基团是通过完整糖基连接基团共价附着于该G-CSF肽上的，该G-CSF肽包含具有下面分子式的糖基残基
101.权利要求100的方法，该方法进一步包含(b)在步骤(a)之前，使该G-CSF肽与唾液酸酶在适合于从该G-CSF肽中去除唾液酸的条件下接触。
102.权利要求100的方法，该方法进一步包含(c)在步骤(a)之前，使该G-CSF肽与半乳糖基转移酶和半乳糖供体在适合于将该半乳糖转移到该G-CSF肽中的条件下接触。
103.权利要求100的方法，该方法进一步包含(d)使步骤(a)的产物和与该修饰基团反应的部分接触，从而在该完整糖基连接基团和该部分之间形成缀合物。
104.权利要求100的方法，该方法进一步包含(e)在步骤(a)之前，使该G-CSF肽与N-乙酰半乳糖胺转移酶和felNAc供体在适合于将(ialNAc转移到该G-CSF肽中的条件下接触。
105.权利要求100的方法，该方法进一步包含(f)在步骤(a)之前，使该G-CSF肽与起合成作用的内切-N-乙酰半乳糖胺酶和(ialNAc 供体在适合于将felNAc转移到该G-CSF肽中的条件下接触。
106.权利要求100的方法，其中该修饰基团是选自聚合物、毒素、放射性同位素、治疗部分和糖缀合物的成员。
107.权利要求100的方法，其中a、b、c禾口 e 是 0。
108.权利要求100的方法，其中a和e是独立选自0和1的成员；且b、c禾口 d 是 0。
109.权利要求100的方法，其中a、b、c、d和e是独立选自0和1的成员。
110.一种由权利要求100的方法形成的G-CSF肽缀合物。
111.一种在干扰素α肽和修饰基团之间形成缀合物的方法，其中该修饰基团是通过完整糖基连接基团共价附着到该糖肽上的，该糖肽包含具有选自下面的分子式的糖基残
112.权利要求111的方法，该方法进一步包含(b)在步骤(a)之前，使该糖肽与唾液酸酶在适合于从该糖肽中去除唾液酸的条件下接触。
113.权利要求111的方法，该方法进一步包含(c)使步骤(a)的产物和与该修饰基团反应的部分接触，从而在该完整糖基连接基团和该部分之间形成缀合物。
114.权利要求111的方法，该方法进一步包含(d)在步骤(a)之前，使该糖肽与糖苷酶和唾液酸酶的组合进行接触。
115.权利要求111的方法，该方法进一步包含(e)在步骤(a)之前，使该糖肽与内切聚糖酶在适合于将糖基部分从该糖肽中切除的条件下接触。
116.权利要求111的方法，该方法进一步包含(f)在步骤(a)之前，使该糖肽与N-乙酰葡糖胺转移酶和GIcNAc供体在适合于将 GlcNAc转移到该糖肽中的条件下接触。
117.权利要求111的方法，该方法进一步包含(g)在步骤(a)之前，使该糖肽与半乳糖基转移酶和半乳糖供体在适合于将半乳糖转移到该产物中的条件下接触。
118.权利要求111的方法，该方法进一步包含(h)在步骤(b)之前，使该糖肽与内切聚糖酶在适合于将糖基部分从该糖肽中切除的条件下接触。
119.权利要求111的方法，该方法进一步包含(i)在步骤(a)之前，使该糖肽与甘露糖苷酶在适合于将甘露糖从该糖肽中去除的条件下接触。
120.权利要求111的方法，该方法进一步包含(j)使步骤(a)的产物与唾酸转移酶和唾液酸供体在适合于将唾液酸转移到该产物中的条件下接触。
121.权利要求111的方法，其中该修饰基团是选自聚合物、毒素、放射性同位素、治疗部分和糖缀合物的成员。
122.权利要求111的方法，其中 a、b、c、d、aa 禾口 bb 是 1 ；e、f、g和h是独立选自1 4的整数的成员； i、j、k、l、m、r、s、t、u* cc是独立选自0和1的成员；且 n、o、p、q、v、w、x、y、z、dd 禾口 ee 是 0。
123.权利要求111的方法，其中a、b、c、d、f、h、j、k、l、m、n、o、p、q、s、u、v、w、x、y、z、cc、dd 禾口 ee 是 0 ； e、g、i、r和t是独立选自0禾Π 1的成员；且 aa 禾口 bb 是 1 ο
124.权利要求111的方法，其中&、13、(；、(1、6、厂8、1、]_、1^、1、111、1~、83和11是独立选自 0 和 1 的成员； h是独立选自1 3的整数的成员； dd、ν、w、χ 禾口 y 是 0 ；且 aa 禾口 bb 是 1 ο
125.权利要求111的方法，其中a、b、c、d、f、h、j、k、l、m、s、u、v、w、x、yff!dd;^0; e、g、i、r和t是独立选自0禾Π 1的成员；且 aa 禾口 bb 是 1 ο
126.权利要求111的方法，其中a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、1、m 禾口 dd 是 0 ； ! 、8、仏11、乂、1、1和7是独立选自0和1的成员；且 aa 禾口 bb 是 1 ο
127.权利要求111的方法，其中a、b、c、d、e、f、g、h、i、r、s、t和u是独立选自0和1的成员； j、k、1、m、ν、W、χ、y 禾口 dd 是 0 ；且aa 禾口 bb 是 1 ο
128.权利要求111的方法，其中&、13、(；、(1、6、厂8、1、]_、1^、1、111、1~、83和11是独立选自 0 和 1 的成员； h是独立选自1 3的整数的成员； V、W、χ、y 禾口 dd 是 0 ；且aa 禾口 bb 是 1 ο
129.权利要求111的方法，其中a、b、c、d、f、h、j、k、l、m、s、u、v、w、x、yff!dd;^0; e、g、i、r和t是独立选自0禾Π 1的成员；且 aa 禾口 bb 是 1 ο
130.权利要求111的方法，其中η、ο和ρ是独立选自0和1的成员；q是1 ；和z、cc 禾口 ee 是 0。
131.权利要求111的方法，其中η和q是独立选自0和1的成员；且 ο、ρ、ζ、cc 禾口 ee 是 0。
132.权利要求111的方法，其中 η是 或1 ；q是1 ；且ο、ρ、ζ、cc 禾口 ee 是 0。
133.权利要求111的方法，其中η、ο、ρ和f是独立选自0和1的成员； q是1 ；且 ζ禾口 ee是0。
134.权利要求111的方法，其中η、ο、ρ和q是独立选自0和1的成员；且 z、cc 禾口 ee 是 0。
135.权利要求111的方法，其中η和q是独立选自0和1的成员；且 ο、ρ、ζ、cc 禾口 ee 是 0。
136.权利要求111的方法，其中 η、O、p、q、ζ、cc 禾口 ee 是 0。
137.一种由权利要求111的方法形成的干扰素α肽缀合物。
138.—种在干扰素β肽和修饰基团之间形成缀合物的方法，其中该修饰基团是通过完整糖基连接基团共价附着到该干扰素β肽上的，该干扰素β肽包含具有下面分子式的糖基残基
139.权利要求138的方法，该方法进一步包含(b)在步骤(a)之前，使该干扰素β肽与唾液酸酶在适合于从该干扰素β肽中去除唾液酸的条件下接触。
140.权利要求138的方法，该方法进一步包含(c)使步骤(a)的产物和与该修饰基团反应的部分接触，从而在该完整糖基连接基团和该部分之间形成缀合物。
141.权利要求138的方法，该方法进一步包含(d)在步骤(a)之前，使该干扰素β肽与糖苷酶和唾液酸酶的组合进行接触。
142.权利要求138的方法，该方法进一步包含(e)在步骤(a)之前，使该干扰素β肽与内切聚糖酶在适合于将糖基部分从该干扰素 β肽中切除的条件下接触。
143.权利要求138的方法，该方法进一步包含(f)在步骤(a)之前，使该干扰素β肽与N-乙酰葡糖胺转移酶和GIcNAc供体在适合于将GIcNAC转移到该干扰素β肽中的条件下接触。
144.权利要求138的方法，该方法也进一步包含(g)在步骤(a)之前，使该干扰素β肽与半乳糖基转移酶和半乳糖供体在适合于将半乳糖转移到该产物中的条件下接触。
145.权利要求138的方法，该方法进一步包含(h)在步骤(b)之前，使该干扰素β肽与内切聚糖酶在适合于将糖基部分从该干扰素 β肽中切除的条件下接触。
146.权利要求138的方法，该方法进一步包含(i)在步骤(a)之前，使该干扰素β肽与甘露糖苷酶在适合于将甘露糖从该干扰素β 肽中去除的条件下接触。
147.权利要求138的方法，该方法进一步包含(j)使步骤(a)的产物与唾酸转移酶和唾液酸供体在适合于将唾液酸转移到该产物中的条件下接触。
148.权利要求138的方法，其中该修饰基团是选自聚合物、毒素、放射性同位素、治疗部分和糖缀合物的成员。
149.权利要求138的方法，其中h是独立选自1 3的整数的成员；&、13、(；、(1、6、厂8、1、]_、1^、1、111、1~、83和11是独立选自 0 和 1 的成员； η、V、W、χ 禾口 y 是 0 ；且 q、P 是
150.权利要求138的方法，其中 a、b、c、d、f、h、j、k、l、m、n、s、u、v、w、xff!y;^0; e、g、i、r和t是独立选自0禾Π 1的成员；且q、P 是
151.权利要求138的方法，其中a、b、c、d、e、f、g、h、j、k、1、m、n、r、s、t、U、V、W、χ 禾口 y 是 0 ； q、p是1 ；且i是独立选自0和1的成员。
152.权利要求138的方法，其中a、b、c、d、e、f、g、h、I、j、k、1、m、r、s、t、U、V、W、χ 禾口 y 是 0 ；且 P、q 是
153.权利要求138的方法，其中a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、1、m 禾口 η 是 0 ； q、p是1 ；且! 、8、111、￥、《^和7是独立选自0和1的成员。
154.权利要求138的方法，其中a、b、c、d、e、f、g、h、i、r、s、t和u是独立选自0和1的成员； j、k、1、m、η、ν、W、χ 禾口 y 是 0 ；且 q、P 是
155.权利要求138的方法，其中&、13、(；、(1、11、」、1^、1、111、1~、8、{和11是独立选自 0 禾口 1 的成员； e、f、g是选自0 3的整数的成员； η、V、W、χ 禾口 y 是 0 ；且 q、P 是
156.权利要求138的方法，其中a、b、c、d、i、j、k、l、m、r、s、t、u、ρ 禾口 q 是独立选自 0 禾口 1 的成员； e、f、g和h是1 ；且 η、V、W、χ 禾口 y 是 0。
157.一种由权利要求138的方法形成的干扰素β肽缀合物。
158.—种在凝血因子VIIa肽和修饰基团之间形成缀合物的方法，其中该修饰基团是通过完整糖基连接基团共价附着到该凝血因子VIIa肽上的，该凝血因子VIIa肽包含具有选自下面的分子式的糖基残基
159.权利要求158的方法，该方法进一步包含(b)在步骤(a)之前，使该凝血因子Vila肽与唾液酸酶在适合于从该凝血因子Vila肽中去除唾液酸的条件下接触。
160.权利要求158的方法，该方法进一步包含(c)在步骤(a)之前，使该凝血因子Vila肽与半乳糖苷酶在适合于将半乳糖从该凝血因子VIIa肽中去除的条件下接触。
161.权利要求158的方法，该方法进一步包含(d)在步骤(a)之前，使该凝血因子Vila肽与半乳糖基转移酶和半乳糖供体在适合于将半乳糖转移到该凝血因子VIIa肽中的条件下接触。
162.权利要求158的方法，该方法进一步包含(e)使步骤(a)的产物与唾酸转移酶和唾液酸供体在适合于将唾液酸转移到该产物中的条件下接触。
163.权利要求158的方法，其中该修饰基团是选自聚合物、毒素、放射性同位素、治疗部分和糖缀合物的成员。
164.权利要求158的方法，其中a、b、c、d、e、g、i、j、1、o、p 禾口 q 独立选自 0 禾口 1 ； r 禾口 t 是 1 ；f、h、k、m、S、U、ν、W、χ 禾口 y 是 0 ；且 η选自0 4的整数。
165.权利要求158的方法，其中a、b、c、d、e、f > g、h、i、j、k、1、m、n、o、p、q、r> s、t 禾口 u 是独立选自 0 禾口 1 的成员； V、W、χ禾口 y是0 ；且η是选自0 4的整数的成员。
166.一种由权利要求158的方法形成的凝血因子VIIa肽缀合物。
167.一种在凝血因子IX肽和修饰基团之间形成缀合物的方法，其中该修饰基团是通过完整糖基连接基团共价附着到该凝血因子IX肽上的，该凝血因子IX肽包含具有选自下面的分子式的糖基残基
168.权利要求W7的方法，该方法进一步包含(b)在步骤(a)之前，使该凝血因子IX肽与唾液酸酶在适合于从该凝血因子IX肽中去除唾液酸的条件下接触。
169.权利要求W7的方法，该方法进一步包含(c)使步骤(a)形成的产物与唾酸转移酶和唾液酸供体在适合于将唾液酸转移到该产物中的条件下接触。
170.权利要求W8的方法，该方法进一步包含(d)使步骤(b)的产物与半乳糖基转移酶和半乳糖供体在适合于将该半乳糖转移到该产物中的条件下接触。
171.权利要求170的方法，该方法进一步包含(e)使步骤(d)的产物与ST3Gal3和唾液酸供体在适合于将唾液酸转移到该产物中的条件下接触。
172.权利要求167的方法，该方法进一步包含(d)使步骤(a)的产物和与修饰基团反应的部分接触，从而在该完整糖基连接基团和该部分之间形成缀合物。
173.权利要求167的方法，其中该修饰基团是选自聚合物、毒素、放射性同位素、治疗部分和糖缀合物的成员。
174.权利要求167的方法，其中 a、b、c 禾口 d 是 1 ；e、f、g和h是独立选自1 4的整数的成员；aa、bb、cc、dd、ee、ff > j、k、1、m、i、η、ο、ρ、q、r> s、t 禾口 u 是独立选自 0 禾口 1 的成员；且 V、W、χ、y、ζ 禾口 gg 是 0。
175.权利要求167的方法，其中3、13、(3、(1、11、9独立选自0和1； aa、e、f、g和h是独立选自1 4的整数的成员；^、沈、(1(1、66、??_、1^1、111、1、0、？、1~、83和11是独立选自0和1的成员；且 ν、W、χ、y、ζ 禾口 gg 是 0。
176.权利要求167的方法，其中a、b、c、d、n、bb、cc、dd 禾口是 1 ；e、f、g、h和aa是独立选自1 4的整数的成员；q、ee、i、j、k、1、m、ο、ρ、r、s、t禾口 u是独立选自0禾口 1的成员；且V、W、χ、y、ζ 禾口 gg 是 0。
177.权利要求167的方法，其中a、b、c、d和q是1； e、f、g和h是独立选自1 4的整数的成员；aa、bb、cc、dd、ee、ff、j、k、l、m、i、n、o、p、r、s、t 禾口 u 是独立选自 0 禾口 1 的成员；且V、W、χ、y、ζ 禾口 gg 是 0。
178.权利要求167的方法，其中a、b、c、d、q、bb、cc、dd和ff是1； aa、e、f、g和h是独立选自1 4的整数的成员； 66、丨、」、1^、1、111、0、？、1~、83和11是独立选自0和1的成员；且V、W、χ、y、ζ 禾口 gg 是 0。
179.—种由权利要求167的方法形成的凝血因子IX肽缀合物。
180.一种在促卵泡激素(FSH)肽和修饰基团之间形成缀合物的方法，其中该修饰基团是通过完整糖基连接基团共价附着到该FSH肽上的，该FSH肽包含具有下面分子式的糖基
181.权利要求180的方法，该方法进一步包含(b)在步骤(a)之前，使该FSH肽与唾液酸酶在适合于从该FSH肽中去除唾液酸的条件下接触。
182.权利要求180的方法，该方法进一步包含(c)使步骤(a)的产物与唾酸转移酶和唾液酸供体在适合于将唾液酸转移到该产物中的条件下接触。
183.权利要求180的方法，该方法进一步包含(d)在步骤(a)之前，使该FSH肽与半乳糖苷酶在适合于将半乳糖从该FSH肽中去除的条件下接触。
184.权利要求180的方法，该方法进一步包含(e)在步骤(a)之前，使该FSH肽与糖苷酶和唾液酸酶的组合进行接触。
185.权利要求180的方法，该方法进一步包含(f)在步骤(a)之前，使该FSH肽与半乳糖基转移酶和半乳糖供体在适合于将半乳糖转移到该FSH肽中的条件下接触。
186.权利要求180的方法，该方法进一步包含(d)使步骤(a)的产物和与该修饰基团反应的部分接触，从而在该完整糖基连接基团和该部分之间形成缀合物。
187.权利要求180的方法，该方法进一步包含(e)在步骤(b)之前，使该FSH肽与内切聚糖酶在适合于将糖基部分从该FSH肽中切除的条件下接触。
188.权利要求180的方法，本方法进一步包含(f)在步骤(a)之前，使该FSH肽与N-乙酰葡糖胺转移酶和GIcNAc供体在适合于将 GlcNAc转移到该FSH肽中的条件下接触。
189.权利要求180的方法，其中该修饰基团是选自聚合物、毒素、放射性同位素、治疗部分和糖缀合物的成员。
190.权利要求180的方法，其中3、13、(；、(1、丨、」、1^、1、111、9、1~、83和11是独立选自0和1的成员；e、f、g和h是1 ；且V、W、χ 禾口 y 是 0。
191.权利要求180的方法，其中a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、q、r、s、t 禾口 u 是独立选自 0 禾口 1 的成员；V、W、χ 禾口 y 是 0。
192.权利要求180的方法，其中а、b、c、d、f、h、j、k、1、m、S、U、V、W、χ禾口 y 是 0 ；且б、8、1、9、1~和1是独立选自0和1的成员。
193.权利要求180的方法，其中a、b、c、d、e、f、g、h、j、k、1 禾口 m 是 0 ； 土、9、1~、8、扒11、￥、《、1和7是独立选自0和1的成员； P是1 ；R(分支的或线性的)是选自甘露糖和寡聚甘露糖的成员。
194.权利要求180的方法，其中a、b、c、d、e、f、g、h、j、k、1、m、r、s、t、U、V、w 禾口 y 是 0 ；i是0或1 ；且 q是
195.—种由权利要求180的方法形成的FSH肽缀合物。
196.—种在促红细胞生成素(EPO)肽和修饰基团之间形成缀合物的方法，其中该修饰基团是通过完整糖基连接基团共价附着到该EPO肽上的，该EPO肽包含具有选自下面的分子式的糖基残基
197.权利要求196的方法，该方法进一步包含(b)在步骤(a)之前，使该EPO肽与唾液酸酶在适合于从该EPO肽中去除唾液酸的条件下接触。
198.权利要求196的方法，该方法进一步包含(c)使步骤(a)的产物与唾酸转移酶和唾液酸供体在适合于将唾液酸转移到该产物中20的条件下接触。
199.权利要求196的方法，该方法进一步包含(d)在步骤(a)之前，使该EPO肽与起合成作用的半乳糖苷酶在适合于将半乳糖添加到该EPO肽中的条件下接触。
200.权利要求196的方法，该方法进一步包含(e)在步骤(a)之前，使该EPO肽与半乳糖基转移酶和半乳糖供体在适合于将半乳糖转移到该EPO肽中的条件下接触。
201.权利要求200的方法，该方法进一步包含(f)使步骤(e)的产物与ST3Gal3和唾液酸供体在适合于将唾液酸转移到该产物中的条件下接触。
202.权利要求196的方法，该方法进一步包含(g)使步骤(a)的产物和与修饰基团反应的部分接触，从而在该完整糖基连接基团和该部分之间形成缀合物。
203.权利要求196的方法，该方法进一步包含(h)在步骤(a)之前，使该EPO肽与N-乙酰葡糖胺转移酶和GIcNAC供体在适合于将 GlcNAc转移到该EPO肽中的条件下接触。
204.权利要求196的方法，其中该修饰基团是选自聚合物、毒素、放射性同位素、治疗部分和糖缀合物的成员。
205.权利要求196的方法，其中 a、b、c、d、e、f、g、η 禾口 q 是 1 ；h是选自1 3的整数的成员；土、」、1^、1、111、0、？、1~、83和11是独立选自0和1的成员；且 V、W、χ、y 禾口 ζ 是 0。
206.权利要求196的方法，其中a、b、c、d、f、h、j、k、1、m、q、s、U、v、w、x、y 禾口 ζ 是 0 ；且 e、g、i、r和t是独立选自0和1的成员。
207.权利要求196的方法，其中a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、1、m、η、O、p、q、r、s、t 禾口 u 是独立选自 0 禾口 1 的成员；且 V、W、χ、y 禾口 ζ 是 0。
208.权利要求196的方法，其中 a、b、c、d、e、f、g、η 禾口 q 是 1 ；h是选自1 3的整数的成员；土、」、1^、1、111、0、？、1~、83和11是独立选自0和1的成员；且 V、W、χ、y 禾口 ζ 是 0。
209.权利要求196的方法，其中а、b、c、d、f、h、j、k、1、m、ο、ρ、S、U、V、W、χ、y禾口 ζ 是 0 ；且б、8、1、11、9、1~和{是独立选自0和1的成员。
210.权利要求196的方法，其中a、b、c、d、f、h、j、k、1、m、η、ο、ρ、S、U、V、W、χ、y 禾口 ζ 是 0 ；且、6、8、1、9、1~和1是独立选自0和1的成员。
211.权利要求196的方法，其中q是1；a、b、c、d、e、f、g、h、i、n、r、s、t和u是独立选自0和1的成员；且 j、k、1、m、ο、ρ、ν、w、χ、y 禾口 ζ 是 0。
212.—种由权利要求196的方法形成的EPO肽缀合物。
213.—种在粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)肽和修饰基团之间形成缀合物的方法，其中该修饰基团是通过完整糖基连接基团共价附着到该GM-CSF肽上的，该GM-CSF肽包含具有选自下面的分子式的糖基残基
214.权利要求213的方法，该方法进一步包含(b)在步骤(a)之前，使该GM-CSF肽与唾液酸酶在适合于从该GM-CSF肽中去除唾液酸的条件下接触。
215.权利要求213的方法，该方法进一步包含(c)使步骤(a)的产物和与修饰基团反应的部分接触，从而在该完整糖基连接基团和该部分之间形成缀合物。
216.权利要求213的方法，该方法进一步包含(d)在步骤(a)之前，使该GM-CSF肽与糖苷酶和唾液酸酶的组合进行接触。
217.权利要求213的方法，该方法进一步包含(e)在步骤(a)之前，使该GM-CSF肽与内切聚糖酶在适合于将糖基部分从该GM-CSF肽中切除的条件下接触。
218.权利要求213的方法，该方法进一步包含(f)在步骤(a)之前，使该GM-CSF肽与N-乙酰葡糖胺转移酶和GIcNAc供体在适合于将GIcNAC转移到该GM-CSF肽中的条件下接触。
219.权利要求213的方法，该方法进一步包含(g)在步骤(a)之前，使该GM-CSF肽与甘露糖苷酶在适合于将甘露糖从该GM-CSF肽中切除的条件下接触。
220.权利要求213的方法，该方法进一步包含(h)在步骤(a)之前，使该GM-CSF肽与ST3feil3和唾液酸供体在适合于将唾液酸转移到该产物中的条件下接触。
221.权利要求213的方法，其中该修饰基团是选自聚合物、毒素、放射性同位素、治疗部分和糖缀合物的成员。
222.权利要求213的方法，其中a、b、c、d、i、j、k、1、m、o、p、q、r> s、t、u 禾口 aa 是独立选自 0 禾口 1 的成员； bb、e、f、g、h和η 是 1 ；且 cc、v、w、x、y 禾口 ζ 是 0。
223.权利要求213的方法，其中a、b、c、d、i、j、k、1、m、o、p、q、r> s、t、u 禾口 aa 是独立选自 0 禾口 1 的成员； bb、e、f、g、h和η是独立选自0和1的成员；且 cc、v、w、x、y 禾口 ζ 是 0。
224.权利要求213 的方法，其中 cc、a、b、c、d、f、h、j、k、l、m、o、p、s、u、v、w、x、yfPζ是0 ；且e、g、i、n、q、r、t和aa是独立选自0和1的成员；且 bb 是 1。
225.权利要求213的方法，其中a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、1、m、η、ο、ρ、ζ 禾口 cc 是 0 ；q、r、s、t、U、ν、w、χ、y和aa是独立选自0和1的成员；bb是1 ；且R是甘露糖或寡聚甘露糖。
226.权利要求213的方法，其中a、b、c、d、e、f > g、h、i、j、k、1、m、o、q、r> s、t、U、aa 禾口 bb 是独立选自 0 禾口 1 的成员；且n、p、v、w、x、y、z 禾口 cc 是 0。
227.—种由权利要求213的方法形成的GM-CSF肽缀合物。
228.—种在干扰素Y肽和修饰基团之间形成缀合物的方法，其中该修饰基团是通过完整糖基连接基团共价附着到该干扰素Y肽上的，该干扰素Y肽包含具有下面分子式的糖基残基
229.权利要求228的方法，该方法进一步包含(b)在步骤(a)之前，使该干扰素Y肽与唾液酸酶在适合于从该干扰素Y肽中去除唾液酸的条件下接触。
230.权利要求228的方法，该方法进一步包含(c)使步骤(a)的产物和与该修饰基团反应的部分接触，从而在该完整糖基连接基团和该部分之间形成缀合物。
231.权利要求228的方法，该方法进一步包含(d)在步骤(a)之前，使该干扰素Y肽与糖苷酶和唾液酸酶的组合进行接触。
232.权利要求228的方法，该方法进一步包含(e)在步骤(a)之前，使该干扰素Y肽与内切聚糖酶在适合于将糖基部分从该干扰素 Y肽中切除的条件下接触。
233.权利要求228的方法，该方法进一步包含(f)在步骤(a)之前，使该干扰素Y肽与N-乙酰葡糖胺转移酶和GIcNAc供体在适合于将GIcNAC转移到该干扰素、肽中的条件下接触。
234.权利要求228的方法，该方法进一步包含(g)在步骤(a)之前，使该干扰素Y肽与半乳糖基转移酶和半乳糖供体在适合于将半乳糖转移到该产物中的条件下接触。
235.权利要求228的方法，该方法进一步包含(h)使步骤(a)的产物与唾酸转移酶和唾液酸供体在适合于将唾液酸转移到该产物中的条件下接触。
236.权利要求228的方法，其中该修饰基团是选自聚合物、毒素、放射性同位素、治疗部分和糖缀合物的成员。
237.权利要求228的方法，其中a、b、c、d、i、j、k、l、m、q、p、r、s、t 禾口 u 是独立选自 0 禾口 1 的成员； e、f、g和h是1 ；且 η、V、W、χ 禾口 y 是 0。
238.权利要求228的方法，其中a、b、c、d、i、j、k、l、m、r、s、t和u是独立选自0和1的成员； P、q、e、f、g 禾口 h 是 1 ；且 η、ν、W、χ 禾口 y 是 0。
239.权利要求228的方法，其中а、b、c、d、f、h、j、k、1、m、η、S、U、V、W、χ禾口 y 是 0 ；且б、8、1、9、1~和1是独立选自0和1的成员；且 P是1。
240.权利要求228的方法，其中a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、1、m 禾口 η 是 0 ；q、r、s、t、U、ν、w、χ和y是独立选自0禾Π 1的成员；且P是1 ；且R是甘露糖或寡聚甘露糖。
241.权利要求228的方法，其中3、13、(；、(1、丨、」、1^、1、111、9、1~、83和11是独立选自0和1的成员； e、f、g、h和ρ是 1 ；且 η、V、W、χ 禾口 y 是 0。
242.一种由权利要求228的方法形成的干扰素γ肽缀合物。
243.一种在α-1蛋白酶抑制剂(A-I-PI)肽和修饰基团之间形成缀合物的方法，其中该修饰基团是通过完整糖基连接基团共价附着到该A-I-PI肽上的，该A-I-PI肽包含具有下面分子式的糖基残基
244.权利要求对3的方法，该方法进一步包含(b)在步骤(a)之前，使该A-I-PI肽与唾液酸酶在适合于从该A-I-PI肽中去除唾液酸的条件下接触。
245.权利要求对3的方法，该方法进一步包含(c)使步骤(a)的产物和与该修饰基团反应的部分接触，从而在该完整糖基连接基团和该部分之间形成缀合物。
246.权利要求243的方法，该方法进一步包含(d)在步骤(a)之前，使该A-I-PI肽与糖苷酶和唾液酸酶的组合进行接触。
247.权利要求243的方法，该方法进一步包含(e)在步骤(a)之前，使该A-I-PI肽与内切聚糖酶在适合于将糖基部分从该A-I-PI肽中切除的条件下接触。
248.权利要求对3的方法，该方法进一步包含(f)在步骤(a)之前，使该A-I-PI肽与N-乙酰葡糖胺转移酶和GIcNAc供体在适合于将GIcNAc转移到该A-I-PI肽中的条件下接触。
249.权利要求M4的方法，该方法进一步包含(g)在步骤(a)之前，使该A-I-PI肽与甘露糖苷酶在适合于将甘露糖从该A-I-PI肽中去除的条件下接触。
250.权利要求对3的方法，该方法进一步包含(h)在步骤(a)之前，使该A-I-PI肽与选自甘露糖苷酶、木糖苷酶、氨基己糖苷酶及其组合的成员在适合于将糖基残基从该A-I-PI肽中去除的条件下接触。
251.权利要求对3的方法，其中该修饰基团是选自聚合物、毒素、放射性同位素、治疗部分和糖缀合物的成员。
252.权利要求对3的方法，其中3、13、(；、(1、丨、」、1^、1、111、9、1~、83和11是独立选自0和1的成员；且 e、f、gfPh^ 1 ；且 η、ν、w、χ 禾口 y 是 0。
253.权利要求对3的方法，其中&、13、(；、(1、6、厂8、11、1、」、1^、1、111、9、1~、83和11是独立选自 0 和 1 的成员；且 η、V、W、χ 禾口 y 是 0。
254.权利要求对3的方法，其中а、b、c、d、f、h、j、k、1、m、η、S、U、V、W、χ禾口 y 是 0 ；且б、8、1、9、1~和1是独立选自0和1的成员。
255.权利要求对3的方法，其中n、a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、1 禾口 m 是 0 ；q、r、s、t、U、ν、w、χ和y是独立选自0禾Π 1的成员；且P是1。
256.权利要求对3的方法，其中a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、1、m、η、ρ 禾口 q 是 0 ； ! 、8、111、￥、《^和7是独立选自0和1的成员。
257.权利要求对3的方法，其中&、13、(；、(1、6、厂8、11、1、]_、1^、1、111、1~、83和11是独立选自 0 和 1 的成员； P、ν、W、χ 禾口 y 是 0 ；且 η禾口 q是1 ο
258.—种由权利要求对3的方法形成的α-1蛋白酶抑制剂肽缀合物。
259.—种在β葡糖苷酶肽和修饰基团之间形成缀合物的方法，其中该修饰基团是通过完整糖基连接基团共价附着到该β葡糖苷酶肽上的，该葡糖苷酶肽包含具有下面分子式的糖基残基
260.权利要求259的方法，该方法进一步包含(b)在步骤(a)之前，使该β葡糖苷酶肽与唾液酸酶在适合于从该β葡糖苷酶肽中去除唾液酸的条件下接触。
261.权利要求259的方法，该方法进一步包含(c)使步骤(a)的产物和与该修饰基团反应的部分接触，从而在该完整糖基连接基团和该部分之间形成缀合物。
262.权利要求259的方法，该方法进一步包含(d)在步骤(a)之前，使该β葡糖苷酶肽与糖苷酶和唾液酸酶的组合进行接触。
263.权利要求259的方法，该方法进一步包含(e)在步骤(a)之前，使该β葡糖苷酶肽与内切聚糖酶在适合于将糖基部分从该β葡糖苷酶肽中切除的条件下接触。
264.权利要求259的方法，该方法进一步包含(f)在步骤(a)之前，使该β葡糖苷酶肽与N-乙酰葡糖胺转移酶和GlcNAc供体在适合于将GIcNAC转移到该β葡糖苷酶肽中的条件下接触。
265.权利要求259的方法，该方法进一步包含(g)在步骤(a)之前，使该β葡糖苷酶肽与半乳糖基转移酶和半乳糖供体在适合于将半乳糖转移到该产物中的条件下接触。
266.权利要求259的方法，其中该修饰基团是选自聚合物、毒素、放射性同位素、治疗部分和糖缀合物的成员。
267.权利要求259的方法，其中3、13、(；、(1、丨、」、1^、1、111、9、1~、83和11是独立选自0和1的成员； p、e、f、g和h 是 1 ；且 η、V、W、χ 禾口 y 是 0。
268.权利要求259的方法，其中&、13、(；、(1、6、厂8、11、1、」、1^、1、111、9、1~、83和11是独立选自 0 和 1 的成员；且 η、V、W、χ 禾口 y 是 0。
269.权利要求259的方法，其中а、b、c、d、f、h、j、k、l、m、n、s、u、v、w、x禾口 y 是 0 ；б、8、1、9、1~和1是独立选自0和1的成员；且 P是1。
270.权利要求259的方法，其中n、a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、1 禾口 m 是 0 ；q、r、s、t