一种肺炎球菌多糖蛋白缀合疫苗及其制备方法[0002]由肺炎球菌(肺链)所引起的感染是全世界发病率和死亡率的主要起因。肺炎、发热性菌血症和脑膜炎是侵入性肺炎球菌性疾病的最常见表现形式，而呼吸道内的细菌扩散可导致中耳感染、窦炎或复发性支气管炎。与侵入性疾病相比，非侵入性的表现形式通常不那么严重，但更多见。由于抗生素耐药性传染病的扩散，以及肺炎球菌肺炎经常在流感感染之后出现，肺炎球菌疾病在流感期间发作的可能性进一步增加。由肺炎链球菌引发的疾病已成为全球一个重要的公共卫生问题。肺炎球菌已成为全球儿童的头号杀手。[0003]我国肺炎的病死率为16.4%，其中50岁以上中老年人及I岁以下婴幼儿分别高达28.6%和22.0%。我国肺炎球菌在健康儿童中的携带率较高，资料统计显示，在北方地区健康儿童中的携带率为24.2%，南方地区为31.3%。而该病是导致5岁以下儿童死亡的重要原因。主要原因在于婴幼儿免疫系统的发育尚不完善，免疫力较弱。并且年龄越小的婴儿，免疫力越弱。[0004]肺炎球菌大约有90种血清型(菌株)，我国的统计资料显示肺炎球菌感染菌株前几个血清型依次为:5、6、19、23、14、2、4型。据一项收集了 860株肺炎球菌分离株的研究显示，有109株(12.7%)表现为血清群6，在中国肺炎球菌血清型6的红霉素耐药性达100%，其中的 6A、6B 和 6C 型分别为 62 株(56.9%)、38 株(34.9%)和 9 株(8.2%)。[0005]中国生物技术集团成都生物制品研究所生产的23价肺炎球菌疫苗是选取了23种最常见的致病菌(1，2，3，4，5，6B，7F，8，9N，9V，10A, 11A, 12F, 14，15B, 17F, 18C, 19A, 19F，20，22F，23F，33F)，分别发酵培养并分离提纯肺炎球菌荚膜上的各型多糖，按等比例混合制成疫苗。[0006]细菌的多糖是一种胸腺非依赖性抗原，这种抗原与胸腺依赖性抗原的主要区别在于前者不需要T淋巴细胞的辅助来产生抗体。因此多糖疫苗存在以下问题:(I)在幼小动物或婴幼儿体内只能产生微弱的免疫反应，甚至不产生免疫反应，免疫反应随年龄的增长而增强；(2)产生低亲和力的抗体；(3)只产生短暂的免疫反应，不具备反复接种时的免疫记忆和免疫增强效应；(4)容易产生免疫耐受；(5)普通的佐剂对这种抗原不易起到免疫增强的作用。23价多糖疫苗对于侵入型肺链感染的保护率为50-70%。而且只能用于2岁以上的人群接种，而肺炎的高峰发病年龄为6-12月龄。[0007]多糖蛋白缀合疫苗(结合疫苗)是目前最先进的疫苗技术，在特异抗原上加上蛋白质载体，可增加其免疫原性。蛋白质载体具有T细胞依赖特性，多糖蛋白缀合疫苗可将非T细胞依赖性质的多糖抗原转变为T细胞依赖性质的抗原，激发机体的T辅助细胞产生一系列的免疫增强效应。荚膜多糖结合疫苗，在多糖上加蛋白载体，由非T细胞依赖性抗原变为T细胞依赖性抗原，增加其免疫原性。结合疫苗接种后产生的抗体在质量和数量上是一代疫苗的400-1000倍，产生免疫保护更广更强，保护时间更长久，达到高效保护。[0008]2000年，美国辉瑞公司第一个7价肺炎球菌结合疫苗上市；美国辉瑞公司开发婴幼儿更有针对性的7(4、68、抑、14、18(:、19?和23F)价肺炎球菌蛋白疫苗，对5岁以下儿童也有效。荚膜多糖蛋白结合疫苗，在多糖上加蛋白载体，由非T细胞依赖性抗原变为T细胞依赖性抗原，可增加其免疫原性，可用于6周龄以上的儿童。目前辉瑞公司正在中国注册13价结合疫苗，增加了 6个血清型(1，3，5，7F，6A，19A)。[0009]但是我国的资料显示肺炎球菌感染菌株血清型依次为:5、6、1、19、23、14、2、4，辉瑞7价肺炎球菌结合疫苗对我国常见致病菌型覆盖率只有50%左右，而13价结合疫苗的覆盖率也仅有70%。惠氏7价肺炎球菌结合疫苗需要接种4针剂，每针860元，价格昂贵，不利于推广。13价疫苗估计其价格将更为昂贵。因此美国辉瑞公司的7和13价结合疫苗不太适合我国大范围的儿童肺炎预防。
[0010]尽管13价肺炎球菌结合疫苗已经上市，但是其中有几个血清型的免疫效果相对其他血清型较低，如3型。且随着不同血清型的增加和同种载体蛋白的重复使用，使得载体蛋白用量增多，其免疫原性反而降低。


[0011]本发明所要解决的技术问题在于提供一种肺炎球菌多糖蛋白缀合疫苗。[0012]本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述肺炎球菌多糖蛋白缀合疫苗的制备方法。
[0013]为解决上述技术问题，本发明的技术方案是:
[0014]一种肺炎球菌多糖蛋白缀合疫苗，是包括一种或多种肺炎链球菌荚膜多糖与蛋白质耦联结合的免疫缀合物，所述免疫缀合物中至少有一种免疫缀合物是一种单一的肺炎链球菌荚膜多糖与两种或两种以上的蛋白质耦联而形成的。
[0015]优选的，上述肺炎球菌多糖蛋白缀合疫苗，包含多价肺炎球菌缀合物的免疫组合物，是分离提纯多种血清型肺炎球菌荚膜上的荚膜多糖与蛋白质(载体蛋白)偶联结合后混合而成的。
[0016]优选的，上述肺炎球菌多糖蛋白缀合疫苗，所述用于与荚膜多糖耦联结合的蛋白质是能够用于和荚膜多糖直接耦联或者通过化学连接头进行耦联的蛋白质。
[0017]优选的，上述肺炎球菌多糖蛋白缀合疫苗，所述用于与荚膜多糖耦联结合的蛋白质为白喉类毒素，破伤风类毒素，载体蛋白CRM197，嗜血流感杆菌表面蛋白HiD，百日咳Prn表面蛋白，百日咳Fha抗原和/或肺炎链球菌表面蛋白PspA。
[0018]优选的，上述肺炎球菌多糖蛋白缀合疫苗，所述用于与荚膜多糖耦联结合的两种或两种以上的蛋白质中，其中一种蛋白质是具有保护性的抗原，而另一个蛋白是没有限制，可以任意选择。
[0019]优选的，上述肺炎球菌多糖蛋白缀合疫苗，所述用于与荚膜多糖耦联结合的两种或两种以上的蛋白质中，其中一种是嗜血流感杆菌表面蛋白HiD或者是PspA蛋白。
[0020]优选的，上述肺炎球菌多糖蛋白缀合疫苗，所述肺炎链球菌荚膜多糖是分离提纯血清型肺炎球菌荚膜上的荚膜多糖，所述血清型肺炎球菌的血清型包括1，2，3，4，5，6A，6B，7F，8，9N，9V，10A,11A,12F,14，15B,17F,18C,19A,19F，20，22F，23F 和 / 或 33F。
[0021]上述肺炎球菌蛋白疫苗的制备方法，具体步骤为:[0022] (I)分别分离提纯多种血清型肺炎球菌荚膜上的荚膜多糖；
[0023](2)分别分离提纯所选用的载体蛋白；
[0024](3)分别将各种荚膜多糖与载体蛋白偶联结合，其中，至少一种荚膜多糖与两种或两种以上的蛋白质耦联结合；
[0025](4)将各种偶联结合混合形成疫苗原液，其中，至少一种荚膜多糖与两种或两种以上的蛋白质耦联结合。
[0026]所述荚膜多糖的分离纯化的具体步骤是一般技术人员已经掌握的现有技术；载体蛋白的生产也是一般技术人员已经掌握的现有技术。
[0027]优选的，上述肺炎球菌蛋白疫苗的制备方法，所述步骤(3)中荚膜多糖与载体蛋白的偶联结合方式包括:
[0028](I)荚膜多糖用CDAP (1-氨基_4_ 二甲基-吡啶-四氟化硼)和三乙胺活化法偶联结合载体蛋白。该反应为异脲键连接反应。在高PH时，CDAP与多糖残基上的羟基反应，转化成氰酸酯，载体蛋白上的氨基与其迅速反应，形成异脲键。该方法操作简单，容易重复；或
[0029](2)先对多糖进行104活化形成自由醛基并和载体蛋白上的氨基进行连接结合；或
[0030](3)用己二酸二肼酰(ADH)和酸性多糖中的羧基(或者在多糖中氧化所获得的羧基)连接，然后再在EDAC存在的条件下和蛋白进行连接；或
[0031](4)荚膜多糖与载体蛋白偶联结合还可以通过对多糖进行片段，衍生加入链接头后再和载体蛋白上的氨基或羧基进行连接。
[0032]优选的，上述肺炎球菌多糖蛋白缀合疫苗的制备方法，所述步骤(3)中荚膜多糖与载体蛋白的偶联结合的5种方式均可以将肺链多糖链接的表面蛋白上，本发明以上述第
(2)种为优选。
[0033]优选的，上述肺炎球菌多糖蛋白缀合疫苗的制备方法，所述步骤(3)中一种荚膜多糖与两种或两种以上的蛋白质耦联结合的连接方式包括:
[0034](I)单步反应法，将两种载体蛋白和荚膜多糖同时加入到反应容器中进行反应，这种方法较为简单，但是缀合物中不同蛋白的比例并不容易准确控制；或
[0035](2)顺序法，先将荚膜多糖与其中一种载体蛋白进行连接，然后经过纯化，去除未结合的游离蛋白和游离多糖，再加入第二种载体蛋白进行连接，可以产生具有稳定结合比例的结合产品。
[0036]优选的，上述肺炎球菌多糖蛋白缀合疫苗的制备方法，具体步骤为:
[0037](I)选取24种血清型的肺炎球菌培养，该24种血清型为1，2，3，4，5，6A，6B，7F，8，9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14，15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20，22F, 23F 和 33F ；
[0038](2)分别提纯以上各种血清型肺炎球菌中抗原性强的荚膜多糖:肺炎球菌，灭活后离心收集上清液，经超滤浓缩，根据各肺炎球菌血清型特性分别加入适量(体积分数为70%的)预冷乙醇，离心收集，得粗制多糖；将粗制多糖溶于乙酸钠溶液中，然后按1:2比例以冷酚混匀，离心去除蛋白，反复酚提5-6次，收集上清，用蒸馏水透析，透析后液体加2mol/L氯化钙溶液,加入乙醇搅拌,离心去除核酸,收集上清,补加乙醇(终浓度80%搅拌)，离心收集沉淀，用乙醇、丙酮洗涤沉淀，脱水干燥后即为精制荚膜多糖，置-20°C保存备用，具体方法和参数可以参见美国专利US2007/0231340[1](惠氏13价专利)；
[0039](3)通过现有的疫苗工艺生产CRM197 (参照中国专利CN102766647)，白喉类毒素(参照美国专利US2005/0002957)，破伤风类毒素(参照中国专利CN102961741)，百日咳的各种抗原(参照中国专利CN102793915)，或将HiD (又称Protein D，参照欧洲专利EP0594610及国际专利W02007/071710)，PspA蛋白(参照中国专利CN103288936)克隆至大肠杆菌进行表达并分离纯化；
[0040](4)取检测合格的各种血清型肺炎球菌的荚膜多糖，用高碘酸钠活化法获得醛基然后和两种蛋白同时结合，得到目标缀合物；或将其中一种蛋白和多糖先进行耦联，在不封闭活性基团的情况下进行纯化，将得到的纯化产物与第二种蛋白进一步进行耦联得到目标缀合物。
[0041]上述肺炎球菌蛋白疫苗在制备用于诱导对肺炎链球菌荚膜多糖缀合物和载体蛋白的免疫应答的药物方面的应用。
[0042]本发明的有益效果:
[0043]上述肺炎球菌多糖蛋白缀合疫苗，是含两种或两种以上不同载体蛋白的免疫缀合物，与现有的肺炎球菌结合疫苗相比，其免疫原性更强，可以在更广阔的人群中引起免疫应答；同时由于2种载体蛋白通过多糖共价耦联，其中具有保护性的蛋白抗原表位也会诱导比两种蛋白混合注射时更高的免疫反应，相互协同作用，进一步增进了载体蛋白的免疫原性，增加了机体对多糖的免疫反应；其制备方法简单，适合规模化工业生产的需要。

[0044]下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
[0045]获得荚膜多糖和载体蛋白:
[0046](I)选取 24 种血清型(1，2，3，4，5，6A，6B，7F，8，9N，9V，10A, 11A, 12F, 14，15B, 17F,18C, 19A, 19F, 20，22F, 23F, 33F)的肺炎球菌培养；
[0047](2)分别提纯以上各种血清型肺炎球菌中抗原性强的荚膜多糖:肺炎球菌，灭活后离心收集上清液，经超滤浓缩，根据各肺炎球菌血清型特性分别加入适量(体积分数为70%的)预冷乙醇，离心收集，得粗制多糖；将粗制多糖溶于乙酸钠溶液中，然后按1:2比例以冷酚混匀，离心去除蛋白，反复酚提5-6次，收集上清，用蒸馏水透析，透析后液体加2mol/L氯化钙溶液,加入乙醇搅拌,离心去除核酸,收集上清,补加乙醇(终浓度80%搅拌)，离心收集沉淀，用乙醇、丙酮洗涤沉淀，脱水干燥后即为精制荚膜多糖，置-20°C保存备用；
[0048](3)通过上述技术方案中记载的现有疫苗工艺生产CRM197，白喉类毒素，破伤风类毒素，百日咳的各种抗原，也可以将HiD，PspA蛋白克隆至大肠杆菌进行表达并分离纯化。
[0049]实施例1 一种7F型荚膜多糖与两种不同载体蛋白缀合物的制备
[0050] 将5g肺链7F型多糖溶解于IL乙酸钠缓冲液(50mM pH4.5)中，在室温下，用带有磁子的磁力搅拌器搅拌20分钟，以使多糖充分的溶解，加入0.2g NaIO4,并室温下反应过夜，使多糖上相邻的双羟基被氧化成醛基。用纯化水进行20次等体积超滤换液，将反应中剩余的NaIO4及反应过程中所生成的小分子物质滤除，得到引入了活化度为6.2的7F活化多糖的水溶液；并可将活化好的多糖浓缩冻干。活化多糖的分子大小的确定利用凝胶过滤层析柱及利用多角度激光光散射来进行，利用葡聚糖分子大小标准来校准。多糖的含量通过蒽酮法确定，引入的醛基含量利用Park，J.T.和Johnson，M.J.(1949)生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry), 181,149-151页所述方法确定。活化多糖的结构完整性由质子IH和13C NMR确定。活化多糖的纯度通过测量LAL (内毒素)含量来确定。
[0051]将各个活化的7F多糖分别放入三角瓶中，用纯化水稀释多糖至llg/L，再加入1/9体积的无菌的磷酸缓冲液(500mM)，按表2所加入5g/L的CRM197蛋白粉末和5g/L的肺炎表面蛋白PspA粉末，并用带有磁子的磁力搅拌进行搅拌，加入2g/L氰基硼氢化钠，搅拌溶解,反应18小时后加入1.lg/L硼氢化钠,混合4小时后加入硫酸铵至lmol/L,用IM硫酸铵溶液+50mM磷酸缓冲液(pH7.5)平衡疏水层析柱(填料为Fractogel Propyl (S)，Merck)，上样后，再用上述缓冲液洗5个柱体积，最终用50mM磷酸缓冲液洗脱并收集多糖-蛋白质缀合物。在装备50KDa滤膜的超滤系统中用生理盐水对多糖-蛋白质缀合物溶液进行15次等体积超滤，收集回流并用囊式滤器过滤除菌，保存于4°C。
[0052]通过CL-4B即SEC-MALLS方法检测多糖蛋白缀合物的分子量分布情况；通过免疫双扩的方法使用不同的抗体血清确定多糖蛋白缀合物中的蛋白和多糖种类；通过蒽酮法检测多糖蛋白缀合物的多糖含量；L0Wry法蛋白含量检测多糖蛋白缀合物的总蛋白含量，再通过计算得到缀合物的多糖蛋白结合比(Ratio);CRM197、PspA蛋白浓度通过酶联免疫法检测。结果见表1，为实施例1所述7F型荚膜多糖与两种不同载体蛋白缀合物的多糖蛋白浓度。
[0053]表1 7F型多糖蛋白缀合物原液的多糖蛋白浓度
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