专利名称：凝血蛋白缀合物的制作方法治疗性多肽例如凝血蛋白(包括因子IX(FIX)、因子VIII (FVIII)、因子 VIIa(FVIIa)、冯威利布兰德因子(Von Willebrand Factor，VWF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、 因子XI (FXI)、因子XII (FXII)、凝血酶(FII)、蛋白质C、蛋白质S、tPA、PAI-I、组织因子 (TF)及ADAMTS 13蛋白酶)，会被蛋白水解酶快速降解并被抗体中和。这会缩短其半衰期及循环时间，从而限制其治疗效果。必需相对较高剂量及频繁施用来达到并维持这些凝血蛋白的期望治疗或预防效果。因此，难以实现适当的剂量调节，且对频繁静脉内施用的需要给患者的生活方式造成限制。多肽药物的聚乙二醇化在循环中对所述药物进行保护，且改善其药效学及药物动力学特性(Harris 和 Chess，Nat Rev Drug Discov. 2003:2:214-21)。聚乙二醇化过程使乙二醇重复单元(聚乙二醇(PEG))连接至多肽药物。PEG分子具有大流体动力学体积(球状蛋白大小的5-10倍)，具有高度水溶性且为水合的、无毒性、非免疫原性的，并快速自身体内清除。分子的聚乙二醇化可增强药物对酶促降解的抗性，增加体内半衰期、减少给药频率、降低免疫原性、增强物理及热稳定性、增强溶解性、增强液体稳定性及减少聚集。第一种聚乙二醇化药物在20世纪90年代早期获得FDA批准。此后，FDA批准了数种聚乙二醇化药物用于口服、注射及局部施用。聚唾液酸(PSA)(也称为多聚乙酰神经氨糖酸(colominic acid, CA))为天然存在的多糖。其为含α Q —8)酮苷键合的N-乙酰基神经氨糖酸的同聚物且在其非还原末端含有邻二醇基团。其带负电且为人体的天然组成部分。其可容易地由细菌以大量及预定生理特征制造(美国专利第5，846，951号)。因为细菌产生的PSA在化学及免疫方面与人体所产生的PSA相同，所以细菌PSA即使与蛋白质偶联也是非免疫原性的。不同于某些聚合物，聚唾液酸为生物可降解的。多聚乙酰神经氨糖酸与过氧化氢酶及天门冬酰胺酶的共价偶联已显示增强在蛋白水解酶或血浆存在下的酶稳定性。用聚唾液酸化天门冬酰胺酶与未经修饰的天门冬酰胺酶进行的体内比较研究揭示聚唾液酸化增加酶的半衰期(Femandes 禾口 Gregoriadis， Int Biochimica Biophysica Acta 134126-34，1997)。通过在水溶性聚合物与治疗性蛋白质之间形成共价键联来制备缀合物可利用多种化学方法进行。举例而言，Roberts等人(Adv Drug Deliv Rev 2002 :54:459-76)回顾了 PEG衍生物与肽或蛋白质的偶联。一种使水溶性聚合物与治疗性蛋白质偶联的方法为使聚合物经由蛋白质的碳水化合物部分缀合。可容易地用过碘酸钠(NaIO4)氧化蛋白质中碳水化合物的邻羟基(OH)以形成活性醛基(Rothfus和Smith，J Biol Chem 1963 238:1402-10 ；van Lenten 和 Ashweli，J Biol Chem 1971:246:1889-94)。接着，可通过使用含有例如活性酰胼基的试剂使聚合物与碳水化合物的醛基偶联(Wilchek M和Bayer EA, Methods Enzymol 1987 138 429-42)。新近技术为使用含有与醛反应形成肟键合的氨氧基的试剂(WO 96/40662、W02008/025856)。描述使水溶性聚合物缀合于治疗性蛋白质的其它实例描述于以下文献中W0 06/071801，教导氧化冯威利布兰德因子中的碳水化合物部分，并接着使用酰胼化学与PEG 偶联；美国公开第2009/0076237号，教导氧化rFVIII，并接着使用酰胼化学与PEG及其它水溶性聚合物(例如PSA、HES、葡聚糖)偶联；WO 2008/025856，教导氧化不同凝血因子(例如rFIX、FVIII及FVIIa)，并接着使用氨氧基化学经由形成肟键合与例如PEG偶联；及美国专利第5，621，039号，教导氧化FIX，并接着使用酰胼化学与PEG偶联。最近，描述了一种改良方法，所述方法包括以过碘酸盐适度氧化唾液酸以产生醛，接着在催化量的苯胺存在下与含氨氧基的试剂反应(Dirksen A和Dawson ΡΕ, Bioconjugate Chem. 2008 19，2543-8 ；及 Zeng Y 等人，Nature Methods 2009:6:207-9)。 苯胺催化作用显著加速肟连接，从而允许使用极低浓度的所述试剂。纵使存在可用于使水溶性聚合物缀合于治疗性蛋白质的方法，但仍需要开发改良蛋白质的药效学和/或药物动力学性质同时使与各种试剂相关的成本降至最低的使水溶性聚合物缀合于蛋白质的材料和方法。发明内容本发明提供使聚合物缀合于蛋白质的材料和方法，其改善蛋白质的药效学和/或药物动力学性质同时使与各种试剂相关的成本降至最低。
在本发明的一个实施方案中，使水溶性聚合物缀合于凝血蛋白的氧化的碳水化合物部分的方法包括使氧化的碳水化合物部分与活化的水溶性聚合物在允许缀合的条件下接触；所述凝血蛋白选自由以下所组成的组因子IX(FIX)、因子VIII (FVIII)、因子Vila(FVIIa)、冯威利布兰德因子(VffF)、因子FV(FV)、因子X(FX)、因子XI (FXI)、因子 XII (FXII)、凝血酶(FII)、蛋白质C、蛋白质S、tPA、PAI-I、组织因子(TF)及ADAMTS 13 蛋白酶或其生物活性片段、衍生物或变异体；所述水溶性聚合物含有活性氨氧基且选自由以下所组成的组聚乙二醇(PEG)、分支PEG、聚唾液酸(PSA)、碳水化合物、多糖、普鲁兰 (pullulane)、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基-葡聚糖、 聚环氧烷(PAO)、聚亚烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰基吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚噁唑啉、聚乙烯-共-顺丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-顺丁烯二酸酐、聚(1-羟基甲基亚乙基-羟基甲基缩甲醛)(PHF)、磷酸2-甲基丙烯酰氧基-2’-乙基三甲基铵(MPC)；且所述碳水化合物部分通过用包含氧化剂的缓冲液孵育而氧化，所述氧化剂选自由以下所组成的组过碘酸钠(NaI04)、四乙酸铅(Pb(0Ac)4) 及过钌酸钾(KRu04)；其中肟键合在氧化的碳水化合物部分与水溶性聚合物上的活性氨氧基之间形成。
在本发明的另一实施方案中，根据上述方法的水溶性聚合物为PSA。在相关实施方案中，PSA包含约5-500或10-300个唾液酸单元。在又一实施方案中，根据上述方法的凝血蛋白为FIX。在另一实施方案中，根据上述方法的凝血蛋白为FVIIa。在又一实施方案中， 根据上述方法的凝血蛋白为FVIII。在又一实施方案中，提供一种上述方法，其中氧化剂为过碘酸钠(NaI04)。在另一实施方案中，根据上述方法的凝血蛋白的氧化的碳水化合物部分位于凝血蛋白的活化肽中。
在本发明的又一实施方案中，提供一种上述方法，其中所述PSA通过使活化的氨氧基连接基团与氧化的PSA反应来制备；其中所述氨氧基连接基团选自由以下所组成的组 下式的3-氧杂-戊烷-1，5- 二羟基胺连接基团


本发明涉及使水溶性聚合物缀合于凝血蛋白的氧化的碳水化合物部分的材料和方法，所述方法包括使所述氧化的碳水化合物部分与活化的水溶性聚合物在允许缀合的条件下接触。更具体地，本发明涉及上述材料和方法，其中所述水溶性聚合物含有活性氨氧基，且其中肟键合在所述氧化的碳水化合物部分与所述水溶性聚合物上的活性氨氧基之间形成。在本发明的一个实施方案中，所述缀合在亲核性催化剂苯胺存在下进行。另外，所产生的肟键合可通过用NaCNBH3还原形成烷氧基胺键合来稳定。