专利名称：抗-间皮素免疫缀合物及其应用的制作方法抗-间皮素免疫缀合物及其应用本发明提供了免疫缀合物，所述免疫缀合物包含具有对间皮素(mesothelin)蛋白的特异性的抗体或其片段以及治疗剂。这种免疫缀合物的组合物可以用于治疗、预防或诊断间皮素相关病症，例如癌症。癌症的发生最常见地与老化有关，由此所有新癌症病例中的65%是65岁及以上的患者。在美国，癌症是第二大死亡原因，排名第一的是心脏病。实际上，美国癌症学会 (American Cancer Society)已经估计，假定当前的死亡率保持不变，在美国将有1/4的人死于癌症。仅在美国，预期在2008年有1，437，180个新癌症病例，且565，650人死于癌症。基于抗体的疗法被证实可以非常有效地治疗各种癌症，包括实体瘤。例如，赫赛汀 已经成功地用于治疗乳腺癌。开发成功的基于抗体的疗法的关键是，分离出抗体，所述抗体针对经发现在肿瘤细胞上优先表达的细胞表面蛋白。间皮素前体多肽是一种糖磷脂酰肌醇(GPI)-锚定的、糖基化的细胞表面蛋白，其被蛋白水解地裂解成30 kDa N-端分泌型多肽和40 kDa C-端多肽，其主要以膜-结合的、GPI-锚定的形式存在(Chang，K.和 I. Pastan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1996) 93 (1) 136)，且在本文中命名为间皮素。间皮素被某些肿瘤细胞(特别是间皮瘤细胞、胰腺肿瘤细胞和卵巢癌细胞)优先表达，同时它在正常组织中的表达受到限制，使它成为开发肿瘤疗法的一种有吸引力的靶标 (Argani, P. ^A , Clin. Cancer Res. (2001) 7(12) 3862; Hassan, R., ^A , Clin. Cancer Res. (2004) 10(12 Pt 1) :3937)。间皮素的功能是未知的，在间皮素基因表达缺陷型的小鼠中，没有观察到明显的生殖异常、血液学异常或解剖学异常(Berii, Τ. K.和I. Pastan, Mol. Cell. Biol. (2000) 20(8) :2902) 已经提出，将针对表达间皮素的癌细胞的、基于抗体的靶向疗法用于治疗肺癌、 卵巢癌和胰腺癌。Mab Kl是被描述的第一种针对膜-结合的间皮素多肽的抗体(Chang， K.，藥Λ，Int. J. Cancer, (1992) 50 (3) 373) 通过免疫小鼠，制备 Mab Kl0 由于该抗体的低亲和力和差的内化率，认为由与化学修饰的截短形式的假单胞菌外毒素A相连的 Mab Kl组成的免疫毒素不适用于临床开发(Hassan, R.，，J. Immunother. (2000) 23(4) :473; Hassan, R. , , Clin. Cancer Res. (2004) 10(12 Pt 1): 3937)。随后， 开发了具有更高亲和力的单链抗体，包括SSl-(dsFv)-PE38，其表现出在体外杀死肿瘤细胞的活性(Hassan, R.，藥Λ，Clin. Cancer Res. (2002) 8(11) 3520)以及在表达人间皮素的肿瘤的鼠模型中的效力(Fan, D., #U , Mol. CancerTher. (2002) 1(8) 595)。 这些数据证实了间皮素是开发用于治疗多种癌症的免疫疗法的一种有吸引力的靶标。已经证实，SSl-(dsFv)-PE38具有快速的血液清除率，且报道了通过聚乙二醇化融合蛋白来增加分子量的尝试(Filpula, D. , , Bioconjugate Chem. (2007) 18(3) 773)。MS-I、MS-2和MS-3是结合间皮素的抗体，它们在细胞表面处引起免疫效应活性， 这是由于它们的人IgGl同种型和内化进表达间皮素的细胞中(W0 2006/099141 A2)。这些抗体之一，即未缀合的、嵌合的(小鼠/人)IgGl抗-间皮素抗体MORAb 009，目前正在临床试验中测试用于治疗胰腺癌的治疗效果。假定的MORAb 009作用机理是，触发免疫效应功能诸如ADCC和功能阻断。具有改善的与攻击性癌症(诸如卵巢癌、胰腺癌和肺癌)做斗争的效力的新疗法是非常合乎需要的，并代表着本领域的进展。这样，本发明公开了新的免疫缀合物组合物，其可用于治疗、预防和/或诊断间皮素相关病症，例如癌症。
本发明涉及免疫缀合物，所述免疫缀合物包含结合间皮素的抗体(例如，单克隆抗体)或其片段，所述抗体或其片段缀合到细胞毒性剂(例如，美坦辛类(maytansinoid)或其衍生物)上，且/或所述免疫缀合物与一种或更多种额外的抗癌剂共同施用或共同配制。本发明的免疫缀合物可以用于治疗和/或诊断和/或监测间皮素相关病症，例如癌症。本发明的一个目的是，提供免疫缀合物，所述免疫缀合物包含对间皮素前体多肽的40 kDa C-端胞外部分是高度选择性的且在有癌抗原125 (CA125; MUC16)存在下不结合间皮素的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体，和效应物部分。在PCT/EP2008/009756 中，已经描述了间皮素抗体的具体性质，且在本发明的一个方面，它们的在有CA125存在下特异性地与间皮素发生免疫反应的特殊能力与细胞毒性剂(例如美坦辛类)缀合的组合，会提供胜过功能阻断抗体的提高的效能，所述功能阻断抗体与CA125竞争间皮素结合。在一个方面，本发明的抗体或其片段是IgG抗体或IgG片段。所述抗体或片段也可以是 IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgD、IgE、IgA 或 IgM 抗体、Fab 片段、F (ab’)2 片段、 scFv片段、Fv片段、双特异抗体、直链抗体、单链抗体、生物特异性的抗体、多特异性的抗体或嵌合的抗体(例如包含移植到人或非人抗体结合区上的人抗体支架，或移植到人或非人抗体结合区上的非人抗体支架)。所述嵌合的抗体可以包括，例如，来自非人来源(例如， 牛、小鼠、美洲驼羊、骆驼或兔)的抗体支架区。关于抗体工程化的其它信息，可以参考文献， 例如，HolIiger 和 Hudson, Nature Biotechnology, (2005 年 9 月)23: 11洸_1136，它通过引用并入本文。前述片段可以从免疫球蛋白得到，或通过合适的方式(例如重组表达)以片段形式制备。本发明的抗体或抗体片段也可以是人源化的，其中所述CDR序列或区域(例如 ⑶Rl、⑶R2、⑶R3)可以是非人的，例如鼠的。本发明的抗体或抗体片段，或包含所述抗体或片段的组合物，可以包括缀合到抗体或其片段上的细胞毒性剂。在一个方面，所述细胞毒性剂是美坦辛类或其衍生物，但是，也提供了其它细胞毒性剂，它们可以包括，例如，和其它细胞毒性剂，例如，aplidin、 auristatin、阿扎立平、阿那曲唑、氮胞苷、博来霉素、硼替佐米、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺钼、伊立替康(CPT-I 1)、 SN-38、卡钼、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、多西他赛、更生霉素、道诺霉素葡萄糖醛酸苷、柔红霉素、地塞米松、己烯雌酚、多柔比星、多柔比星葡萄糖醛酸苷、表柔比星葡萄糖醛酸苷、炔雌醇、雌莫司汀、依托泊苷、依托泊苷葡萄糖醛酸苷、依托泊苷磷酸盐、氮尿苷(FUdR)、3’，5’-0-二油酰基-FudR (FUdR-d0)、氟达拉滨、氟他胺、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、吉西他滨、己酸羟孕酮、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、L-门冬酰胺酶、亚叶酸、洛莫司汀、氮芥、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、6-巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、丁酸苯酯、泼尼松、丙卡巴胼、紫杉醇、喷司他丁、PSI-341、司莫司汀、链佐星、他莫昔芬、紫杉烷类、泰素、丙酸睾酮、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、乌拉莫司汀、万珂、长春碱、长春瑞滨、长春新碱、蓖麻蛋白、相思豆毒蛋白、 ribomiclease、onconase、rapLRI、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素或它们的组合。任一种细胞毒性剂也可以包括其功能类似物或其衍生物。在另一个方面，本发明提供了免疫缀合物，其中所述细胞毒性剂是非免疫原性的， 即不会通过向药物制剂贡献人或哺乳动物B细胞表位或T细胞表位而增加亲代抗体的免疫原性。除了所述抗体和片段(含有或没有前述缀合的细胞毒性剂)以外，本发明的组合物可以包含各种抗癌剂，它们可以包括，例如，博来霉素、多西他赛(泰索帝)、多柔比星、依达曲沙、厄洛替尼(塔西法)、依托泊苷、非那雄胺(保列治)、氟他胺(Eulexin)、 吉西他滨(健择)、吉非替尼(Lrresa)、醋酸戈舍瑞林(诺雷德)、格拉司琼(凯特瑞)、伊马替尼(格列卫)、伊立替康(Campto/Camptosar)、昂丹司琼(枢复宁)、紫杉醇(泰素)、培门冬酶(Oncaspar)、盐酸毛果芸香碱(Salagen)、卟吩姆钠(Photofrin)、 白介素-2 (Proleukin)、利妥昔单抗(Rituxan)、托泊替康(和美新)、曲妥单抗(赫赛汀)、Triapine、长春新碱和酒石酸长春瑞滨(诺维本)，或它们的治疗性抗体或片段，或抗血管生成剂，例如，血管生成抑制因子、贝伐单抗(Avastin )、索拉非尼(Nexavar )、 baculostatin、canstatin、maspin、抗-VEGF抗体或肽、抗-胎盘生长因子抗体或肽、 抗-Flk-I抗体、抗-Fit- 1抗体或肽、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原活化剂抑制剂、 组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素12、ΙΡ-Ι0、Gro-β、凝血酶敏感蛋白、2-甲氧雌二醇、增殖蛋白-相关的蛋白、羧基酰氨三唑(carboxiamidotriazole)、CM101、马立马司他、 聚硫酸戊聚糖、血管生成素2、干扰素-α、除莠霉素A、PNU145156EU6K催乳素片段、利诺胺、沙利度胺、己酮可可碱、染料木黄酮、ΤΝΡ-470、内皮他丁、紫杉醇、accutin、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM- 1470、血小板因子4或米诺环素。在另一个方面，本发明另外提供了用于治疗间皮素相关病症的方法，其中施用治疗有效量的本发明的免疫缀合物，或包含本发明免疫缀合物的本发明的组合物。所述间皮素相关病症可以包括，例如，癌症，例如，实体瘤癌。所述实体瘤可以是在下述部位中或源自下述部位卵巢、胰腺、呼吸道、肺、结肠、胃、食管、子宫颈、肝脏、乳房、头和颈。公开了这些和其它实施方案，或者，它们从下面的详细描述显而易见，并被包括在下面的详细描述中。图1显示了抗间皮素-免疫缀合物MF-T-SPDB-DM4对在间皮素转染的异种移植物模型中(A)以及在未转染的对照肿瘤中(B)的间皮素-转染的人胰腺癌细胞的抗肿瘤效能。图2显示了具有稳定的和可裂解的、以及极性的和非极性的连接物的抗-间皮素免疫缀合物在HeLaMATU异种移植物模型(其含有内源地表达间皮素的癌细胞)中的抗肿瘤效能。图3显示了具有稳定的和可裂解的、以及极性的和非极性的连接物的抗-间皮素免疫缀合物在间皮素转染的异种移植物模型中(A)以及在未转染的对照肿瘤中(B)的抗肿瘤效能。图4显示了 MF-T-SPDP-DM4对间皮素阳性的HelaMatu细胞的毒性的剂量响应曲线的一个实施例。除非另有定义，在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。但是，下面的参考文献可以为本发明所属领域的技术人员提供在本发明中使用的许多术语的一般定义，且可以参照和使用，只要这样的定义与本领域通常理解的含义相一致。这样的参考文献包括、但不限于=Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (1994年第 2版)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker编，1988)； Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)；禾口Lackie 等人，The Dictionary of Cell & Molecular Biology (1999 年第 3 版)；禾口 Cellular and Molecular Immunology, Abbas, Lichtman 和Pober编，第2版，W. B. Saunders Company。可以查阅本领域普通技术人员可得到的任何其它技术资源，只要本文使用的术语的定义具有本领域通常理解的含义。为了本发明的目的，进一步定义下述术语。其它术语在说明书的别处予以定义。在本文中和在所附的权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”以及“该”包括复数所指， 除非上下文另外清楚地指明。因而，例如，提及的“一个基因”是指一个或更多个基因，并包括本领域技术人员已知的其等同物，以此类推。本文使用的术语“抗体”包括从自然界分离的或通过重组方式制备的免疫球蛋白分子(例如，任意类型，包括IgG, IgE, IgM, IgD, IgA和IgY，和/或任意类别，包括，IgGU 1862、1863、1864、1841和18々2)。抗体也意在包括结合抗原的抗体片段，诸如Fab、F(ab’)2、 scFv (单链Fvs)、Fv、单链抗体、双特异抗体、二硫键连接的Fv (sdFv)和包含VL或VH结构域的片段，它们从完整的免疫球蛋白制备，或通过重组方式制备。本发明的抗体和/或结合抗原的抗体片段可以是单特异性的(例如单克隆的)、 双特异性的、三特异性的，或具有更大的多特异性。多特异性的抗体可以对抗原的不同表位是特异性的，或者可以对超过一种抗原的表位是特异性的。参见，例如，PCT公开WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt,等人，1991，J. Immunol. 147:60 69;美国专利号 4, 474, 893; 4，714，681; 4, 925, 648; 5，573，920; 5, 601, 819; Kostelny等人，1992，J. ImmunoL 148:1547 1553，它们各自通过引用并入本文。结合抗原的抗体片段可以包含单独的可变区，或与所有或一部分下述区域组合的可变区铰链区、CH1、CH2、CH3和CL结构域。本发明也包括结合抗原的抗体片段，其还包含可变区与铰链区、CHI、CH2、CH3和CL结构域的任意组合。优选地，所述抗体或结合抗原的抗体片段是人、人源化的、鼠(例如，小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼科、马或鸡。本文使用的“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，且包括从人免疫球蛋白文库、从人B细胞、或从一种或更多种人免疫球蛋白的转基因动物分离的抗体，如下文所述，和例如Kucherlapati等人在美国专利号5，939，598中所述。术语抗体也延伸至这样的其它蛋白支架其能够将抗体⑶R 插入物定向为与在天然抗体中发现的相同活性结合构象，使得与CDR的来源天然抗体的结合活性相比，维持用这些嵌合蛋白所观察到的靶抗原的结合。本文使用的术语“人源化的”形式的非人(例如，鼠)抗体是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。通常，人源化的抗体是这样的人免疫球蛋白(受体抗体)其中受体的高变区残基(例如互补性决定区“CDR”)被替换为来自非人物种(诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)(供体抗体)的具有希望的特异性、亲和力和能力的高变区残基(CDR)。在有些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基可以被替换为对应的非人残基。此外，人源化的抗体可以包含在受体抗体中或在供体抗体中不存在的残基。进行这样的修饰，以进一步优化抗体性能。一般而言，人源化的抗体可以包含基本上所有的至少一个或通常2个可变结构域，其中所有的或基本上所有的高变区对应着非人免疫球蛋白的高变区，且所有的或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化的抗体任选地也可以包含免疫球蛋白恒定区 (Fe)(通常是人免疫球蛋白的Fe)的至少一部分。关于综述，参见Jones，等人，(Nature 321:522-525，1986) ； Reichmann,等人，(Nature 332:323-329, 1988)；和 Preste, (Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596，1992)。人源化的抗体的制备，可以参见美国专利号 7，049，135,6, 828，422,6, 753，136,6, 706，484,6, 696，248,6, 692，935,6, 667，150、 6，653，068,6, 300，064,6, 294，353 和 5，514，548，它们各自整体并入本文。本文使用的术语“单链Fv”或“sFv”抗体片段包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽另外包含在VH和VL结构域之间的多肽连接物，其使sFv形成抗原结合所需的结构。关于综述，参见Pluckthun(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 禾口 Moore 编著，Springer-Verlag, New York,第沈9-315页，1994)，其通过引用整体并入本文。术语“双特异抗体”表示具有两个抗原结合部位的小抗体片段，该片段在相同多肽链(VH-VL)中包含连接到轻链可变结构域(VL)上的重链可变结构域(VH)。通过使用连接物(其长度不足以使得在相同链上的两个结构域之间发生配对)，强制所述结构域与另一条链的互补结构域配对，并创建两个抗原结合部位。双特异抗体更完全地记载在，例如EP 404,097; WO 93/11161;和Hollinger等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448， 1993)，它们各自通过引用并入。表述“直链抗体”表示本领域所述的抗体，例如，在通过引用并入本文的Zapata等人(ProteinEng. 8(10) 1057-1062, 1995)中所述的抗体。简而言之，这样的抗体包含一对串联的Fd段(VH-CH1-VH- CHl)，它们形成一对抗原结合区。直链抗体可以是双特异性的或单特异性的。本文使用的术语“单克隆抗体”表示从一群基本上同源的抗体获得的抗体，也就是说，包含除了可能的天然发生的突变(其可能以较小量存在)外是相同的群体的各个抗体。 单克隆抗体是高度特异性的，也就是说，针对单一抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制品相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”表明所述抗体从一群基本上同源的抗体获得的特征，而不应理解为需要通过任何特定方法来生产所述抗体。例如，要根据本发明使用的单克隆抗体，可以通过由Kohler等人(Nature 256:495，197 首次描述的杂交瘤方法来制备，或可以通过重组DNA方法(参见，例如，美国专利号4，816，567)来制备。还可以使用例如Clackson，等人 (Nature 352 624-6 , 1991)和 Marks,等人(J. Mol. Biol. 222:581-597，1991)描述的技术，从噬菌体抗体文库分离单克隆抗体。单克隆抗体在本文中也包括“嵌合的”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，同时链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，以及这种抗体的片段，只要它们表现出所需要的生物学活性即可(参见，例如，美国专利号4，816，567; 和 Morrison,等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855，1984，它们各自通过引用并入)。本文使用的术语“生物样品”或“患者样品”表示从生物体或从生物体的组分(例如，细胞)得到的样品。所述样品可以属于任意生物组织或流体。所述样品可以是“临床样品”，即源自患者的样品。这样的样品包括、但不限于痰、血液、血清、血浆、血细胞(例如，白细胞)、组织样品、活组织检查样品、尿、腹膜液和胸膜液、唾液、精液、乳房渗出物、脑脊液、泪水、粘液、淋巴、胞质溶胶、腹水、羊水、膀胱洗液和支气管肺泡灌洗液或源自它的细胞，以及其它体液样品。所述患者样品可以是新鲜的或冷冻的，且可以用肝素、柠檬酸盐或 EDTA处理。生物样品还可以包括组织切片，例如为了组织学目的制作的冷冻切片。术语“癌症”包括、但不限于实体瘤，例如胰腺癌、乳腺癌、呼吸道癌、脑癌、生殖器癌、消化道癌、泌尿道癌、眼癌、肝癌、皮肤癌、头颈部癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌和它们的远端转移。该术语也包括肉瘤、淋巴瘤、白血病、和浆细胞骨髓瘤。呼吸道肿瘤包括、但不限于小细胞肺癌、非小细胞肺癌以及支气管腺瘤和胸膜肺母细胞瘤。乳腺肿瘤包括、但不限于浸润性导管癌、浸润性小叶癌、原位管癌和小叶原位癌。脑肿瘤包括、但不限于脑干和下丘脑神经胶质瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、 髓母细胞瘤、室管膜瘤以及神经外胚层肿瘤和松果体肿瘤。男性生殖器肿瘤包括、但不限于前列腺癌和睾丸癌。女性生殖器肿瘤包括、但不限于子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌、阴道癌和外阴癌以及子宫肉瘤。消化道肿瘤包括、但不限于肛门癌、结肠癌、结肠直肠癌、食道癌、胆囊癌、胃癌、胰腺癌、直肠癌、小肠癌和唾液腺癌。泌尿道肿瘤包括、但不限于膀胱癌、阴茎癌、肾癌、肾盂癌、输尿管癌和尿道癌。眼癌包括、但不限于眼内黑素瘤和视网膜母细胞瘤。肝肿瘤包括、但不限于肝细胞癌(有或无纤维板层变异的肝细胞癌)、胆管上皮癌(肝内胆管癌)和混合型肝细胞胆管上皮癌。皮肤癌包括、但不限于鳞状细胞癌、卡波西肉瘤、恶性黑素瘤、默克尔细胞皮肤癌和非黑素瘤皮肤癌。头颈部癌包括、但不限于喉/ 下咽/鼻咽/ 口咽癌，以及唇癌和口腔癌。淋巴瘤包括、但不限于AIDS相关的淋巴瘤、非霍金奇淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍金奇病和中枢神经系统淋巴瘤。肉瘤包括、但不限于软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、淋巴肉瘤和横纹肌肉瘤。白血病包括、但不限于急性髓细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病和多毛细胞白血病。在本发明中使用的术语“表位”是指抗体通过抗原结合位点结合的抗原(例如间皮素蛋白)上的任意抗原决定簇。决定簇或抗原决定簇通常由分子(诸如氨基酸或糖侧链) 的化学活性表面簇组成，且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。术语“特异性地免疫反应性的”表示抗体和具有被抗体的抗原结合位点所识别的表位的蛋白、化合物或抗原之间的结合反应。该结合反应决定了具有识别的表位的蛋白、 抗原或表位在蛋白的异质群体和其它生物学中的存在。在免疫测定的背景下，特异性地免疫反应性的抗体可以结合具有识别的表位的蛋白，且如果结合，则以比样品中存在的缺少该表位的其它蛋白更低的可检测程度进行结合。在体内背景下，“特异性地免疫反应性的” 可以表示动物形成针对疫苗或抗原的免疫应答的条件，例如针对抗原的体液应答(在免疫反应条件下抗体的生成，所述抗体针对呈递到其的疫苗、蛋白、化合物或抗原)或细胞-介导的应答(在本文中也称作“细胞免疫应答”，即由T淋巴细胞介导的、针对呈递到其的疫苗、蛋白、化合物或抗原的应答)。本文使用的术语“免疫反应性的条件”用于免疫测定或体外反应的背景中，其中提供或调节反应的物理条件，包括例如温度、盐浓度、PH、试剂和它们的浓度、和抗原和与所述抗原特异性地免疫反应性的相应抗体的浓度，以允许相应抗体结合抗原。免疫反应性的条件取决于抗体结合反应的形式，且通常是在免疫测定方案中使用的那些。关于免疫测定形式和条件的描述，参见Harlow和Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York。本文使用的术语 “患者”或“受试者”包括哺乳动物(例如，人和动物)。本文使用的术语特定抗体与间皮素的‘不变结合’表示它的结合间皮素的能力， 所述间皮素在广范围的表达间皮素的癌细胞系上，所述癌细胞系表达不同形式的间皮素。不变结合可以由下述事实造成，但是不限于此抗体或其抗原结合抗体片段或其变体识别间皮素的表位，所述表位未被与间皮素相互作用的另一种胞外抗原(诸如癌抗原125 (CA12Q)掩蔽。对于不变结合抗体，通过FACS滴定测得在2种不同癌细胞系上的EC50值可能相差不超过10倍、或优选5倍、和最优选1至3倍。本文使用的术语“免疫缀合物”表示这样的缀合物分子其包含与细胞毒性剂(例如，美坦辛类或其衍生物)结合(优选地经由合适的连接基团或其前体)的至少一种抗体或其抗原结合片段。本发明的免疫缀合物
本发明涉及通过提供抗-间皮素免疫缀合物来抑制间皮素-阳性的癌细胞生长和肿瘤性疾病的进展的方法。提供的免疫缀合物的抗体部分是对间皮素前体多肽的40 kDa C-端结构域(SEQ ID NO 36)特异性地免疫反应性的，该C-端结构域在本文中称作‘间皮素’。在本发明的一个方面，所述抗体、结合抗原的抗体片段、以及本发明的抗体和片段的变体已经描述在PCT/EP2008/009756中，且包含轻链可变区和重链可变区。在本发明中预见到的抗体或结合抗原的抗体片段的变体是，其中维持了抗体或结合抗原的抗体片段对间皮素的结合活性的分子。本发明也涉及免疫缀合物，所述免疫缀合物由不同于在PCT/EP2008/009756中已经描述的那些、且已经连接到化学治疗剂(例如美坦辛类或其衍生物)上的抗-间皮素抗体、结合抗原的抗体片段、以及本发明的抗体和片段的变体组成。可以用于本发明中的美坦辛类是本领域众所周知的，且可以根据已知的方法从天然来源分离，或根据已知的方法合成地制备。合适的美坦辛类的实例包括美登醇和美登醇类似物。合适的美登醇类似物的实例包括具有修饰的芳族环的那些和具有在其它位置的修饰的那些。具有修饰的芳族环的合适的美登醇类似物的具体实例包括
(1)C-19-脱氯(美国专利号4，256，746)(通过安丝菌素P2的LAH还原制备)；
(2)C-20-羟基(或C-20-脱甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利号4，361，650和 4，307，016)(使用链霉菌属或放线菌属进行脱甲基化，或使用LAH进行脱氯，进行制备)； 禾口
(3)C-20-脱甲氧基、C-20-酰氧基(-0C0R)、+/-脱氯(美国专利号4，四4，757)(通过使用酰氯进行酰化来制备)。具有其它位置的修饰的合适的美登醇类似物的具体实例包括
(1)C-9-SH (美国专利号4，424，219)(通过美登醇与H2S或P2S5的反应来制备)；
(2)C-14-烷氧基甲基(脱甲氧基/CH20R)(美国专利号4，331，598)；
(3)C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH20H或CH20Ac)(美国专利号4，450，254)(从诺卡氏菌属制备)；
(4)C-15-羟基/酰氧基(美国专利号4，364，866)(通过链霉菌属对美登醇的转化来制备)；
(5)C-15-甲氧基(美国专利号 4，313，946 和 4，315，929)(从 Trewia nudiflora 分离)；
(6)C-18-N-脱甲基(美国专利号4，362，663和4，322，348)(通过链霉菌属对美登醇的脱甲基化来制备)；和
(7)4，5-脱氧(美国专利号4，371，53 (通过美登醇的三氯化钛/LAH还原来制备)。在美国专利号5，208，020、5，416，064和7，276，497中，充分地公开了可用于本发明中的含有硫醇的美坦辛类的合成。具有在C-3位置、C-14位置、C-15位置或C_20位置处的硫醇部分的美坦辛类都预期是有用的。C-3位置是优选的，且美登醇的C-3位置是特别优选的。也优选的是，含有N-甲基-丙氨酸的C-3硫醇部分美坦辛类，和含有N-甲基-半胱氨酸的C-3硫醇部分美坦辛类，以及各自的类似物。优选的美坦辛类是在美国专利5，208，020,5, 416，064、 6，333. 410,6, 441，163,6, 716，821、RE39, 151 和 7，276，497 中所述的那些，它们各自通过引用整体并入本文。在一个优选的实施方案中，酯化的美登醇选自N2’_脱乙酰基-N2，-(3-巯基-1-氧代丙基)-美坦辛(DM1, CAS登记号139504-50-0)、N2，-脱乙酰基-N2，- (4-巯基-1-氧代戊基)-美坦辛(DM3，CAS登记号796073-54-6)和N2，-脱乙酰基-N2，-(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)_美坦辛(DM4 CAS登记号796073-69-3)。贯穿本文件，提及下述的本发明的代表性的抗体“MF-J”、“M0R06640”、“MF_2^” 和“MF-T”。MF-J代表具有与SEQ ID NO: 28 (DNA)/SEQ ID NO: 20 (蛋白)相对应的重链可变区和与SEQ ID NO: 32 (DNA)/SEQ ID NO: 24 (蛋白)相对应的轻链可变区的抗体。 MOR 06640代表具有与SEQ ID N0: 29 (DNA)/SEQ ID NO: 21 (蛋白)相对应的重链可变区和与SEQ ID NO: 33 (DNA)/SEQ ID NO: 25 (蛋白)相对应的轻链可变区的抗体。MF-226 代表具有与SEQ ID NO: 30 (DNA)/SEQ ID NO: 22 (蛋白)相对应的重链可变区和与SEQ ID NO: 34 (DNA) /SEQ ID NO: 26 (蛋白)相对应的轻链可变区的抗体。MF-T代表具有与 SEQ ID NO: 31 (DNA)/SEQ ID NO: 23 (蛋白)相对应的重链可变区和与SEQ ID NO: 35 (DNA)/SEQ ID NO: 27 (蛋白)相对应的轻链可变区的抗体。本发明不限于在这里用作实施例的这些抗体。其它有用的抗体公开在例如PCT/EP2008/009756中。在一个方面，本发明提供了免疫缀合物，所述免疫缀合物在有癌抗原125 (CA 125/MUC 16)存在下对间皮素是特异性地免疫反应性的，因此有效地靶向表达间皮素和 CA125的癌细胞，例如0VCAR-3细胞。在其它方面，本发明提供了免疫缀合物，所述免疫缀合物对抗体MOR 06640或 MF-T的表位的一个或更多个氨基酸是特异性地免疫反应性的。在某些方面，所述免疫缀合物对抗体MOR 06640或MF-T的表位的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个氨基酸是特异性地免疫反应性的。在某些方面，本发明的免疫缀合物对抗体MOR 06640所识别的表位的一个或更多个氨基酸是特异性地免疫反应性的。在替代方面，本发明的抗体对抗体MF-T所识别的表位的一个或更多个氨基酸是特异性地免疫反应性的。在另一个方面，本发明提供了免疫缀合物，所述免疫缀合物具有这样的抗原-结合区其对间皮素的一个或更多个区域是特异性地免疫反应性的或具有高亲和力，所述间皮素的氨基酸序列如SEQ ID N0: 36所示。如果亲和力测量结果是至少100 nM (Fab片段的单价亲和力)，则称作免疫缀合物对于抗原具有“高亲和力”。本发明的免疫缀合物优选地可以是对间皮素特异性地免疫反应性的，具有小于约100 nM、更优选地小于约60 nM、和甚至更优选地小于约30 nM的亲和力。进一步优选的是，以小于约10 nM和更优选地小于约3 nM的亲和力结合间皮素的抗体。例如，本发明的抗体对间皮素的亲和力可以是约9.1 nM或0. 9 nM (IgGl形式的单价亲和力)。使用方法
术语“治疗”包括任意过程、动作、施用、治疗等，其中给包括人类在内的受试者(或患者)提供医学辅助，其目的是直接地或间接地改善受试者的状况，或减慢受试者的状况或病症的进展，或改善在治疗下的疾病或病症的至少一种症状。术语“联合治疗”或“共同治疗”是指，施用两种或更多种治疗剂来治疗疾病、状况和/或病症。这样的施用包括以基本上同时的方式共同施用两种或更多种治疗剂，诸如在具有固定比例的活性成分的单个胶囊中，或在每种抑制剂多个单独的胶囊中。另外，这样的施用包括以先后方式使用每类治疗剂。2种或更多种先后地共同施用的治疗剂的施用次序没有限制。短语“治疗有效量”是指达到下述目的所施用的每种药剂的量改善疾病、状况和/或病症严重性和/或其症状，同时避免与施用的治疗性处理有关的不利副作用或使其最小化。术语“药学上可接受的”是指，适用于药学产品中的主题项目。预期本发明的免疫缀合物作为治疗剂是有价值的。因此，本发明的一个实施方案包括治疗患者(包括哺乳动物)的不同状况的方法，所述方法包括给所述患者施用组合物，所述组合物含有一定量的本发明的免疫缀合物，其可以有效地治疗目标状况。本发明的免疫缀合物可以用于治疗或预防与间皮素蛋白有关的疾病和/或行为。这些疾病和/或行为包括例如癌症，例如胰腺癌、卵巢癌、胃癌、食管癌、宫颈癌、结肠癌、肝癌、呼吸道癌和肺癌。本发明也涉及改善病症的症状的方法，在所述病症中，间皮素升高或以其它方式异常表达。这些病症包括、但不限于胰腺癌、卵巢癌、胃癌、食管癌、宫颈癌、 结肠癌、肝癌、呼吸道癌和肺癌(参见，例如，(Liao，Cancer Res. 57:2827-2831, 1997; Turner, Hum. Pathol. 28:740-744，1997; Liao,等人，Am. J. Pathol. 145:598-609， 1994; Saarnio,等人，Am. J. Pathol. 153:279-285，1998; Vermylen,等人，Eur. Respir. J. 14:806-811, 1999)。在本发明一个实施方案中，给具有病症的患者施用治疗上有效剂量的本发明的免疫缀合物，在所述病症中，间皮素升高。本发明的免疫缀合物可以单独地施用，或与一种或更多种额外的治疗剂组合地施用。联合治疗包括施用含有本发明免疫缀合物和一种或更多种额外治疗剂的单一药物剂量制剂，以及施用在它自己的单独的药物剂量制剂中的本发明的免疫缀合物和每种额外治疗剂。例如，本发明的免疫缀合物和治疗剂可以在单个口服剂量组合物中一起施用给患者， 或每种药剂可以在单独的口服剂量制剂中施用。在使用单独的剂量制剂的情况下，本发明的免疫缀合物和一种或更多种额外的治疗剂可以基本上同时(例如，并存地)施用，或在分别错开的时间(例如，先后地)施用。药剂的施用次序没有限制。例如，在一个方面，预见到将本发明的抗-间皮素免疫缀合物与一种或更多种抗癌剂一起共同施用(以增强抗-间皮素免疫缀合物或抗癌剂或二者的作用)，用于治疗间皮素相关病症，例如，癌症。这样的联合治疗也可以用于预防癌症、预防癌症复发、预防癌症传播或转移、或减轻或改善与癌症有关的症状。一种或更多种抗癌剂可以包括本领域任意已知的和合适的化合物，例如，化疗剂 (chemoagent)、其它免疫治疗剂、癌症疫苗、抗血管生成剂、细胞因子、激素疗法、基因疗法、 和放射疗法。化疗剂(或“抗癌剂”或“抗肿瘤剂”或“癌症治疗剂”)表示辅助治疗癌症的任意分子或化合物。本发明所预见到的化疗剂的实例包括但不限于胞嘧啶阿糖胞苷、紫杉烷类(例如，紫杉醇、多西他赛)、抗微管蛋白剂(例如紫杉醇、多西他赛、埃博霉素B、或其类似物)、大环内酯类(例如，根霉素)、顺钼、卡钼、多柔比星、替尼泊苷(tenoposide)、 米托蒽醌(mitozantron)、discodermolide、软珊瑚醇(eleutherobine)、2_ 氯脱氧腺苷、烷化剂(例如环磷酰胺、氮芥、塞替派(thioepa)、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、洛莫司汀0XNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素
C、以及顺式二氯二胺钼(II)(DDP)——顺钼、硫替派)、抗生素(例如更生霉素(从前的放线菌素)、博来霉素、光辉霉素、安曲霉素)、抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、flaV0pirid0l、5-氟尿嘧啶、氟达拉滨、吉西他滨、达卡巴嗪、替莫唑胺)、门冬酰胺酶、卡介菌、白喉毒素、六甲基三聚氰胺、羟基脲、LYS0DREN. RTM.、核苷类似物、植物生物碱(例如，泰素、紫杉醇、喜树碱、托泊替康、伊立替康(CAMPT0SAR、CPT-11)、长春新碱、 长春花生物碱例如长春碱)、鬼白毒素(包括衍生物例如表鬼白毒素、VP-16 (依托泊苷)、 VM-26 (替尼泊苷))、细胞松弛素B、秋水仙碱、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、 丙卡巴胼、氮芥、蒽环类抗生素(例如柔红霉素(以前的道诺霉素)、多柔比星、多柔比星脂质体)、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracindione)、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素
D、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、抗有丝分裂剂、相思豆毒蛋白、蓖麻蛋白Α、假单胞菌外毒素、神经生长因子、血小板衍生的生长因子、组织纤溶酶原活化剂、阿地白介素、allutamine、阿那曲唑、比卡鲁胺、biaomycin、白消安、卡培他滨、卡钼、苯丁酸氮芥 (chlorabusil)、克拉屈滨、cylarabine> daclinomyciru 雌莫司夕丁、氣尿 Ρ (floxuridhe) > 吉西他滨、gosereine、伊达比星、异环磷酰胺(itosfamide)、醋酸亮丙瑞林(lauprolide acetate)、左旋咪唑、洛莫司汀(lomusline)、氮芥、magestrol、乙酸盐、巯基嘌呤、美司钠、 mitolanc、培门冬酶(pegaspergase)、喷司他丁 (pentoslatin)、光辉霉素(picamycin)、利妥昔单抗(riuxlmab)、campath-1、链佐星(straplozocin)、硫鸟嘌呤、维甲酸、长春瑞滨或者它们的任何片段、家族成员或衍生物，包括其药学上可接受的盐。本发明也预见到包含一种或更多种化疗剂(例如FLAG、CHOP)的组合物。FLAG包括氟达拉滨、胞嘧啶阿糖胞苷 (Ara-C)和G-CSF。CHOP包括环磷酰胺、长春新碱、多柔比星和泼尼松。所述化疗剂可以是抗血管生成剂，例如，血管生成抑制因子、贝伐单抗 (Avastin )、索拉非尼 (Nexavar )、baculostatin、canstatin、乳腺丝氨酸蛋白酶抑制物 (maspin)、抗-VEGF抗体或肽、抗-胎盘生长因子抗体或肽、抗-Flk- 1抗体、抗-Fit- 1抗体或肽、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原活化剂抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素12、IP-10、Gro-i3、凝血酶敏感蛋白、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白-相关的蛋白、 羧基酰氨三唑、CMW1、马立马司他、聚硫酸戊聚糖、血管生成素2、干扰素-α、除莠霉素Α、 PNU145156EU6K催乳素片段、利诺胺、沙利度胺、己酮可可碱、染料木黄酮、ΤΝΡ-470、内皮他丁、紫杉醇、accutin、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM- 1470、血小板因子4或米诺环
ο在一个方面，所述化疗剂是剂量范围为100-1000 mg/m2/周期的吉西他滨。在一个实施方案中，所述化疗剂是剂量范围为200-4000 mg/m2/周期的达卡巴嗪。在另一个方面， 所述剂量范围是700-1000 mg/m2/周期。在另一个方面，所述化疗剂是剂量范围为25-50 mg/m2/周期的氟达拉滨。在另一个方面，所述化疗剂是剂量范围为200-2000 mg/m2/周期的胞嘧啶阿糖胞苷(Ara-C)。在另一个方面，所述化疗剂是剂量范围为1. 5-7. 5 mg/kg/周期的多西他赛。在另一个方面，所述化疗剂是剂量范围为5-15 mg/kg/周期的紫杉醇。在另一个方面，所述化疗剂是剂量范围为5-20 mg/kg/周期的顺钼。在其它方面，所述化疗剂是剂量范围为5-20 mg/kg/周期的5-氟尿嘧啶。在另一个方面，所述化疗剂是剂量范围为 2-8 mg/kg/周期的多柔比星。在其它方面，所述化疗剂是剂量范围为40-160 mg/kg/周期的表鬼臼毒素。在另一个方面，所述化疗剂是剂量范围为50-200 mg/kg/周期的环磷酰胺。 在另一个方面，所述化疗剂是剂量范围为50-150 mg/m2/周期的伊立替康。在其它方面，所述化疗剂是剂量范围为3. 7-18. 5 mg/m2/周期的长春碱。在另一个方面，所述化疗剂是剂量范围为0. 7-2 mg/m2/周期的长春新碱。在一个方面，所述化疗剂是剂量范围为3. 3-1000 mg/m /周期的甲氨蝶呤。在另一个方面，本发明的抗-间皮素免疫缀合物与一种或更多种免疫治疗剂组合施用，所述免疫治疗剂诸如抗体或免疫调节剂，包括、但不限于赫赛汀 、Retuxan , OvaRex> Panorex> BEC2>IMC-C225、Vitaxin、Campath I/H、Smart MI95、LymphoCide、Smart I D 10和0ncolym、rituxan、利妥昔单抗、吉姆单抗或曲妥单抗。本发明也预见到，本发明的抗-间皮素免疫缀合物与一种或更多种抗血管生成剂一起施用，所述抗血管生成剂包括、但不限于血管生成抑制因子、沙利度胺、kringle 5、内皮他丁、krpin (丝氨酸蛋白酶抑制剂)抗凝血酶、纤连蛋白的四kDa N-端蛋白水解片段和40 kDa C-端蛋白水解片段、催乳素的16 kDa蛋白水解片段、血小板因子-4的7. 8 kDa蛋白水解片段、与血小板因子-4的片段相对应的β-氨基酸肽(Maione等，1990， Cancer Res. 51: 2077)、与胶原I片段相对应的14-氨基酸肽(Tolma等，1993，J. Cell Biol. 122: 497)、与凝血酶敏感蛋白I片段相对应的19氨基酸肽(Tolsma等，1993，J. Cell Biol. 122: 497)、与 SPARC 片段相对应的 20 氨基酸肽(Sage 等，1995，J. Cell. Biochem. 57: 13 )，或者其任何片段、家族成员或衍生物，包括其药学上可接受的盐。还已经描述了抑制血管生成并且与层粘连蛋白、纤连蛋白、原胶原和EGF的片段相对应的其它肽(综述参见 Cao，1998，Prog. Mol. Subcell. Biol. 20: 161)。已经证实，阻滞与 RGD 蛋白(即具有肽基序Arg-Gly-Asp)结合的某些整联蛋白的单克隆抗体和环五肽具有抗血管形成活性(Brooks等，1994，Science 264: 569; Hammes等，1996，Nature Medicine 2: 5 )。此外，拮抗剂对尿激酶纤溶酶原活化剂受体的抑制，会抑制血管生成、肿瘤生长和转移(Min等，1996，Cancer Res. 56: 2428-33; Crowley等，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5021)。本发明也预见到这样的抗血管生成剂的使用。在另一个方面，与辐射疗法相组合地施用本发明的抗-间皮素免疫缀合物。本发明的抗-间皮素免疫缀合物也可以与一种或更多种细胞因子组合地施用，所述细胞因子包括、但不限于淋巴因子、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子-样细胞因子、淋巴毒素-α、淋巴毒素-β、干扰素-β、巨噬细胞炎性蛋白、粒细胞单核细胞集落刺激因子、白介素(包括但不限于白介素-1、白介素-2、白介素-6、白介素-12、白介素-15、白介素-18)、 0X40、CD27、CD30、CD40或CD137配体、Fas-Pas配体、4-IBBL、内皮单核细胞活化蛋白、或者它们的任何片段、家族成员或衍生物，包括其药学上可接受的盐。本发明的抗-间皮素免疫缀合物也可以与癌症疫苗组合地施用，癌症疫苗的实例包括但不限于自体的细胞或组织、非自体的细胞或组织、癌胚抗原、甲胎蛋白、人绒毛膜促性腺激素、BCG活疫苗、黑素细胞谱系蛋白(例如gapW0、MART-l/MelanA、TRP-I (gp75)、 酪氨酸酶、广泛分享的肿瘤相关的抗原包括肿瘤特异性的抗原(例如BAGE、GAGE-U GAGE-2、MAGE-U MAGE-3、N-乙酰葡糖胺基转移酶_V、pl5)、肿瘤相关的突变抗原(β -连环蛋白、MUM-I、⑶Κ4)、非黑素瘤抗原(例如HER-2/neu (乳腺癌和卵巢癌)、人5乳头瘤病毒-E6、E7 (宫颈癌)、MUC-I (乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌)。关于由T-细胞识别的人肿瘤抗原，通常参见Robbins 和 Kawakami, 1996，Curr. Opin. Immunol. 8: 6沘。癌症疫苗可以是或不是纯化的制品。在另一个实施方案中，本发明的抗-间皮素免疫缀合物与激素治疗组合地使用。激素治疗性处理包括激素激动剂、激素拮抗剂(例如氟他胺、他莫昔芬、醋酸亮丙瑞林 (LUPRON)、LH-RH拮抗剂)、激素生物合成和加工的抑制剂、以及留类(例如地塞米松、类维生素A、倍他米松、皮质醇、可的松、泼尼松、脱氢睾酮、糖皮质激素、盐皮质激素、雌激素、睾酮、孕酮)、抗孕激素(例如，米非司酮、奥那司酮)，和抗雄激素(例如，醋酸环丙孕酮)。本发明的抗-间皮素免疫缀合物可以与抗-MDR (多药抗药性)表型药剂组合地使用，例如共同施用。许多人癌症固有地表达或自发地发展同时对几类抗癌药的抗性，尽管每种药物类别具有不同的结构和作用机理。该现象(其可以在培养的哺乳动物细胞中模仿) 通常称作多药抗药性(“MDR”)或多药抗药性表型。MDR表型代表人患者中的癌症的成功化疗治疗的重大障碍。恶性肿瘤对多种化学治疗剂的抗药性是治疗失败的一个主要原因(Wittes等人，Cancer Treat. Rep. 70:105 (1986) ； Bradley, G.等人，Biochim. Biophys. Acta 948:87 (1988) ； Griswald, D. P.等人，CancerTreat. Rep. 65(S2) :51 (1981)； Osteen, R. Τ.(编)，Cancer Manual, (1990))。最初对细胞毒性剂敏感的肿瘤经常复发，或变得可耐受多种化学治疗药物(Riordan等人，Wiarmacol. Ther. 28:51 (1985)； Gottesman 等人，Trends Pharmacol. Sci. 9:54 (1988) ； Moscow 等人，J. Natl. Cancer Inst. 80:14 (1988) ； Croop, J. Μ.等人，J. Clin. Invest. 81:1303 (1988))。 从肿瘤得到并在有选择性的细胞毒性药物存在下培养的细胞或组织，可以产生对该类中的其它药物以及其它类药物(包括，但不限于、蒽环类抗生素、长春花生物碱和表鬼白毒素)的交叉抗药性(Riordan 等人，Pharmacol. Ther. 28:51 (1985) ； Gottesman 等人，J. Biol. Chem. 263:12163 (1988))。因而，获得的对单一药物的抗药性会同时产生对结构上和功能上不相关的不同药物集合的抗药性。这样的抗药性可以成为实体形式肿瘤和液体形式肿瘤(例如血液癌症或基于淋巴的癌症)的问题。哺乳动物细胞中多药抗药性的一个主要机理涉及170 kDa质膜糖蛋白泵系统的表达增加(Juranka 等人，FASEB J 3:2583 (1989) ； Bradley, G.等人，Biochem. Biophys. Acta 948:87 (1988))。已经从培养的人细胞克隆出编码该泵系统(有时称作多药转运蛋白)的基因，且通常称作mdrl。该基因在几类正常组织中表达，但是尚未鉴别出这些组织中为mdrl基因产物而运输的生理底物。MDIU产物是ABC运载体蛋白超家族(一组具有能量-依赖性的输出功能的蛋白)的一个成员。mdrl基因的蛋白产物(通常称作P-糖蛋白(“P-170”、“P-gp”))是一种170 kDa跨-质膜蛋白，其构成前述的能量-依赖性的流出泵。细胞表面上P-gp的表达足以使细胞耐受多种细胞毒性的药物，包括许多抗癌剂。 P-gp-介导的MDR似乎是不同类型的肿瘤中的肿瘤抗药性的重要临床组分，且mdrl基因表达与不同类型的癌症对化学疗法的抗性有关。mdrl基因的核苷酸序列(Gros，P.等人， Cell 47:371 (1986) ； Chen, C.等人，Cell 47:381 (1986))表明，它编码与P-糖蛋白类似或相同的多肽，且它们是与细菌转运蛋白类似的高度保守的膜蛋白类别的成员，并参与正常的生理运输过程。mdrl基因的序列分析表明，Pgp由分布在2个同源的03%同一性) 一半之间的1280个氨基酸组成。该分子的每一半具有6个疏水跨膜结构域，且各自具有在大细胞质环内的一个ATP结合位点。仅约8%的分子是细胞外的，且碳水化合物部分(大约 30 kDa)结合在该区域中的部位上。因而，应当理解，具有“多药抗药性”或“多药抗性的”表型的哺乳动物细胞的特征在于，从细胞内环境隔离、输出或排除多种细胞毒性物质(例如，化学治疗药)的能力。 细胞可以获得该表型，作为通过暴露于单一化学治疗药(选择毒素)所施加的选择压力的结果。或者，细胞可以在毒素暴露之前表现出该表型，因为细胞毒性物质的输出可能涉及与细胞分泌产物、代谢物等的正常输出共有的机理。多药抗药性与简单地获得对选择毒素的抗药性的差别在于，细胞获得输出该细胞以前没有暴露的额外细胞毒素(其它化学治疗药)的能力。例如，Mirski等人(1987)，47 Cancer Res. 2594-2598描述了多药抗性的细胞群体的分离，其中在有作为选择毒素的阿霉素(多柔比星)存在下，培养从从人小细胞肺癌衍生出的H69细胞系。发现存活的细胞会耐受下述药物的细胞毒性效应蒽环类抗生素类似物(例如，道诺霉素、表柔比星、美诺立尔和米托蒽醌)、阿西维辛、依托泊苷、 短杆菌肽D、秋水仙碱和长春花-衍生的生物碱(长春新碱和长春碱)以及阿霉素。可以应用类似的选择培养技术，以制备额外的多药抗性的细胞群体。因此，本发明的药物组合物可以另外包括起抑制MDR表型和/或与MDR表型有关的状况的作用的化合物。这样的化合物可以包括本领域的任意已知的MDR抑制剂化合物，例如，对MDR组分特异性的抗体 (例如抗-MDR运载体抗体)或MDR转运蛋白的小分子抑制剂，具体地包括他莫昔芬、维拉帕米和环孢霉素A，它们是已知会逆转或抑制多药抗药性的药剂(Lavie等人J. Biol. Chem. 271: 19530-10536, 1996，通过引用并入本文)。这样的化合物可以参见美国专利号5，773，280,6, 225，325和5，403，574，它们各自通过引用并入本文。这样的MDR抑制剂化合物可以与本发明的抗-间皮素免疫缀合物共同施用，用于不同目的，所述目的包括在检测到MDR表型以后，逆转MDR表型，以辅助或增强化疗治疗。MDR抑制剂，例如他莫昔芬、维拉帕米或环孢霉素A，可以与本发明的化合物联合使用，以辅助检测MDR表型。根据该方面， MDR抑制剂可以增强本发明化合物在MDR癌细胞中的摄入和积累，因为在有MDR抑制剂存在下，会减少MDR运输系统的运输或“泵出”成像化合物(相对于底物结构域)的能力。在另一个实施方案中，本发明的抗-间皮素免疫缀合物与基因治疗方案联合使用，用于治疗癌症。使用分泌白介素-2的重组细胞的基因治疗可以与本发明的免疫缀合物组合地施用，以预防或治疗癌症，尤其是乳腺癌(参见，例如，Deshmuld1等人，2001，J. Neurosurg. 94:287)。为了评估特定免疫缀合物在治疗上可用于治疗癌症的能力，作为一个实例，可以在小鼠异种移植物肿瘤模型中在体内测试免疫缀合物。治疗模型的实施例详述在实施例1 和2中。使用在实施例3中所述的抗体依赖性的细胞-介导的细胞毒性试验，也可以测试抗体活性。药物组合物和剂量
本文所述的免疫缀合物可以提供在包含药学上可接受的载体的药物组合物中。药学上可接受的载体可以是无热原的。所述组合物可以单独施用，或与至少一种其它药剂(诸如稳定化化合物)组合地施用，其可以在任意无菌的、生物相容的药用载体(包括，但不限于、盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水)中施用。可以采用多种水性载体，包括，但不限于盐水、甘氨酸等。这些溶液是无菌的，且通常不含有微粒物质。通过常规的、众所周知的灭菌技术(例如， 过滤)，可以灭菌这些溶液。通常，短语“药学上可接受的载体”是本领域公知的，且包括药学上可接受的物质、组合物或媒介物，其适合将本发明的化合物施用给哺乳动物。所述载体包括在将主题药剂从身体的一个器官或部分携带或运输到身体的另一个器官或部分所涉及的液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包囊材料。每种载体必须是“可接受的”，其含义是，与制剂的其它成分相容，且对患者无害。可以用作药学上可接受的载体的物质的一些实例包括 糖类，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和它的衍生物， 诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉末化的黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡类；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，诸如丙二醇；多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；等渗盐
16水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；和其它无毒的、适合用于药物制剂中的物质。润湿齐U、乳化剂和润滑剂(诸如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁)以及着色剂、脱膜剂、包衣剂、甜味齐U、矫味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂，也可以存在于本发明的免疫缀合物组合物中。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括水溶性的抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；油-溶性的抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和金属螯合齐U，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。所述组合物可以含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，诸如ρΗ调节剂和缓冲剂等。本发明的免疫缀合物在这样的药物制剂中的浓度可以广泛地变化，且可以根据选择的具体给药模式，主要基于流体体积、粘度等进行选择。如果需要的话，可以在药物组合物中包含超过一类抗体或免疫缀合物(例如，对于间皮素结合而言具有不同Ka的抗体)。所述组合物可以单独地或与其它药剂、药物或激素组合地施用给患者。除了活性成分以外，这些药物组合物可以含有合适的药学上可接受的载体，包括便于将活性化合物加工成可以在药学上使用的制品的赋形剂和辅料。本发明的药物组合物可以通过任意数目的途径来施用，所述途径包括，但不限于口服、静脉内的、肌肉内的、动脉内的、骨髓内的、 鞘内的、心室内的、透皮的、皮下的、腹膜内的、鼻内的、肠胃外的、局部的、舌下的或直肠的方式。本发明的组合物另外包括合适的免疫载体，例如，蛋白、多肽或肽诸如白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺球蛋白和其衍生物、特别是牛血清白蛋白(BSA)和钥孔戚血蓝素(KLH)、多糖、碳水化合物、聚合物和固相。其它蛋白衍生的或非蛋白衍生的物质是本领域技术人员已知的。在涉及疫苗(例如与本发明的抗体在一起的癌症疫苗)的方面，可以在有或没有佐剂存在下，施用本发明的组合物。可以在没有佐剂存在下进行施用，以便避免任何佐剂诱导的毒性。本发明所属领域的普通技术人员(例如专注于癌症的医生)会明白和理解如何确定是否使用佐剂，且可以取决于受试者的医疗史、家族数据、毒性数据、变态反应-有关的实验结果等。在使用佐剂的实施方案中，有利地，佐剂会促进保护性抗体(诸如保护性IgG抗体)的形式。本发明预见到本领域普通技术人员已知的任意合适的佐剂，并容易地适用于本发明。适用于给动物接种疫苗的佐剂可以包括、但不限于氢氧化铝、皂苷和它的纯化组分 Quit Α、完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。已经证实，硫酸葡聚糖是针对葡萄球菌细胞表面抗原的IgG2抗体的有效刺激物，且也适合作为佐剂。技术人员会明白，有些佐剂对于兽医应用而言可以是更优选的，而其它佐剂对于用于人类而言是优选的，且在将化合物施用给人类之前，技术人员应当考虑佐剂毒性。通过本领域众所周知的任意方法(参见，例如，Remington’ s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. , Easton, Pa., 20th edition, 2000)，可以制备适用于肠胃外的、皮下的、静脉内的、肌肉内的给药等的制剂、合适的药用载体以及配制和给药的技术。用于本发明化合物的口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、 悬浮液、糖浆剂和酏剂。除了活性成分以外，液体剂型可以含有本领域常用的惰性稀释剂， 例如，水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(具体地，棉籽油、花生油、玉米油、胚油(germ oil)、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯、及其混合物。本文使用的短语“肠胃外给药”和“肠胃外地施用的”是指除了肠给药和局部给药以外的给药模式，通常通过注射，包括但不限于静脉内的、肌肉内的、动脉内的、鞘内的、 囊内的、眶内的、心内的、真皮内的、腹膜内的、经气管的、皮下的、表皮下的、关节内的、囊下的、蛛网膜下的、椎管内的和胸骨内的注射和输注。治疗上有效剂量的确定，是在本领域技术人员的能力范围内。治疗上有效剂量表示，与在没有治疗上有效剂量存在下观察到的效能相比，可以用于有效地治疗疾病(例如， 癌症)的免疫缀合物的量。在动物模型(例如，大鼠、小鼠、兔、狗或猪)中可以初步估计治疗上有效剂量。所述动物模型也可以用于确定适当的浓度范围和给药途径。然后可以使用这样的信息来确定在人类中有用的给药剂量和途径。通过细胞培养物或实验动物中的标准药学规程，可以确定免疫缀合物的治疗效果和毒性(例如，ED50——在50%群体中治疗上有效的剂量，和 LD50——使50%群体致死的剂量)。毒性效果与治疗效果的剂量比是治疗指数，它可以表达为LD50/ED50之比。从动物研究得到的数据可以用于制定用于人类的剂量范围。在这样的组合物中含有的剂量可以是在包括ED50、且几乎不具有或不具有毒性的循环浓度范围内。 根据采用的剂型、患者的敏感度和给药途径，剂量在该范围内变化。从业人员在考虑与需要治疗的患者有关的因素以后，可以确定确切的剂量。可以调节剂量和给药，以提供足够的免疫缀合物水平，或维持希望的效果。可以考虑的因素包括疾病状态的严重性、受试者的一般健康、受试者的年龄、体重和性别、饮食、给药时间和频率、药物组合、对治疗的反应敏感性和耐受性/应答。使用已经确立的技术，可以构建编码本发明的免疫缀合物的多核苷酸，并离体地或在体内导入细胞中，所述技术包括，但不限于转铁蛋白-聚阳离子-介导的DNA转移、使用裸露的或包囊的核酸的转染、脂质体-介导的细胞融合、DNA-包被的胶乳珠的细胞内运输、原生质体融合、病毒感染、电穿孔、“基因枪”和DEAE-或磷酸钙-介导的转染。免疫缀合物的毒簇组分的有效体内剂量是在约5 μ g至约500 μ g/kg患者体重的范围内。本发明的含有免疫缀合物的药物组合物的给药模式可以是任意合适的途径，其递送抗体给宿主。作为一个实例，本发明的药物组合物可以用于肠胃外给药(例如，皮下的、肌肉内的、静脉内的或鼻内的给药)。在本公开内容中引用的所有专利和专利申请都明确地通过引用并入本文。上面的公开内容一般地描述了本发明。通过参考下面的具体实施例，可以得到更完整的理解，所述实施例仅为了例证目的而提供，无意限制本发明的范围。
实施例实施例1:免疫缀合物在表达间皮素的人胰腺癌异种移植物小鼠模型中的效能为了分析抗-间皮素免疫缀合物是否能够减少肿瘤的间皮素依赖性方式的生长，用间
皮素稳定地转染了人胰腺癌细胞(MiaPaCa-幻，并用于建立皮下地生长的肿瘤小鼠模型。 在效能研究中，使用人结肠癌细胞系HD9建立间皮素阴性对照肿瘤。在补充了 10% (ν/ν) FCS,2. 5% (ν/ν)马血清、1.5 g/Ι碳酸氢钠、4. 5 g/Ι葡萄糖、4mM谷氨酰胺和0.4% (ν/ν)潮霉素的DMEM培养基中，MiaPaCa细胞维持贴壁培养。在含有1.5 mM谷氨酰胺、2. 2g/l碳酸氢钠和10% (v/v) FCS的McCoy氏^1培养基中培养Η ^9细胞。通过FACS证实MiaPaCa-2 细胞的间皮素表达和间皮素在HD9细胞中的缺失(未显示)。为了评估肿瘤细胞的体内生长，给雌性NMRI裸鼠的右侧腹皮下地接种3 χ IOf5MiaPaCaj细胞或1 χ 106Η ^9细胞， 所述细胞重新悬浮于50% Matrigel 和50%培养基中。已经在0. 01 mg/kg、0. 03 mg/kg、 0. 05 mg/kg和0.2 mg/kg的治疗剂量(与毒簇的量有关)，测试了作为抗-间皮素免疫缀合物的 MF-J-SPDB-DM4、MF-T-SPDB-DM4、MF226-SPDB-DM4 和 M0R6640-SPDB-DM4。通过下述方法，制备 MF-J-SPDB-DM4、MF-T-SPDB-DM4、MF226-SPDB-DM4 和 M0R6640-SPDB-DM4 用 4-[2_吡啶基二硫代]丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDB)修饰抗-间皮素抗体，以导入二硫代吡啶基。使用8 mg/mL的抗体(比SPDB (在KOH中的 20mM储备溶液)约6倍摩尔过量)，修饰抗体。使修饰的抗体与比硫代吡啶基1. 7倍摩尔过量的游离硫醇形式的美坦辛类反应。在有3% 二甲基乙酰胺(3% ν/ν)存在下，与2. 5 mg/ml的抗体在室温反应20小时。 使用脱盐kphadex G25柱，从未反应的药物和反应副产物中纯化缀合反应混合物。通过测量在252 11111和沘0 nm的吸光度，使用消光系数224000 M^cm"1 (对于抗体)和5180 M^cm"1 (对于0114在^Onm)，计算每个抗体的美坦辛类分子的数目。252 nm/280 nm吸光度比值是 0. 37 (对于抗体)和5. 05 (对于DM4)。在肿瘤细胞接种后第5天，在肿瘤建立以后开始治疗，继之以在肿瘤细胞接种后第8和12天进行另外2次治疗。用0.2 mg/kg的非靶向免疫缀合物(抗-溶菌酶-SPDB-DM4)或等体积的单独媒介物(10 mM组氨酸、130 mM甘氨酸、5% (w/v)蔗糖、pH 5.5)，治疗对照小鼠。通过静脉内给药，以100 μΙ/lOg体重的剂量体积，进行治疗。每组由6只动物组成。每天检查小鼠的健康状态。使用电子测径器，测量皮下肿瘤的长度和宽度，每周2次。通过下式计算肿瘤面积肿瘤面积[mm2]=长度[mm] χ宽度[mm]。记录在实验期间得到的所有数据。不同治疗剂量的抗间皮素免疫缀合物MF-T-SPDB-DM4对间皮素-转染的人胰腺癌细胞的抗肿瘤效能的一个实施例如图1所示。给雌性NMRI裸鼠的右侧腹接种3 χ IO6间皮素阳性的MiaPaCa-2人胰腺癌细胞(A)或1 χ IO6间皮素阴性的HD9人结肠癌细胞(B)，所述细胞重新悬浮于50% MatrigelT750%培养基中。在肿瘤细胞接种后 5、8 和 12 天，小鼠接受 0. 01,0. 03,0. 05,0. 2 mg/kg MF-T-SPDB-DM4 (所有浓度与毒簇的量有关)或单独的媒介物。每周测量肿瘤的长度和宽度2次，并通过宽度乘以长度，计算肿瘤面积。绘制每组和每个测量时间点的平均值和标准差。所有η = 6。星号指示 P-值 < 0.05。携带肿瘤的小鼠的治疗揭示，在0. 03 mg/kg,0. 05 mg/kg和0. 2 mg/kg的剂量测试的所有抗-间皮素免疫缀合物都能够抑制间皮素阳性的MiaPaCa-2肿瘤体内生长。剂量为 0. 05 mg/kg和0. 2 mg/kg的MF-T-SPDB-DM4完全根除了肿瘤，在132天的观察期结束之前， 肿瘤没有再生。0. 05 mg/kg的非靶向对照抗-溶菌酶-SPDB-DM4对间皮素阳性的MiaPaCa 肿瘤生长没有影响(表1)。与未治疗的和媒介