专利名称：靶向性免疫缀合物的制作方法对个别细胞或特定细胞类型的选择性破坏在许多临床背景中经常是期望的。例如，癌症疗法的主要目的是特异性破坏肿瘤细胞，而让健康细胞和组织保持完整且不受损伤。细胞中的许多信号转导途径与细胞存活和/或死亡相关联。因而，可以使用对涉及细胞存活或死亡的途径的因子的直接投递来促成细胞的维持或破坏。细胞因子是参与免疫系统调节的细胞信号传导分子。在癌症疗法中使用时，细胞因子可以充当免疫调控剂，其具有抗肿瘤效果，并且其可以提高一些类型的肿瘤的免疫原性。然而，快速的血液清除和肿瘤特异性的缺乏需要高剂量细胞因子的系统性施用以达到在肿瘤部位足以激活免疫应答或具有抗肿瘤效果的细胞因子浓度。这些高水平的系统性细胞因子可以导致严重的毒性和不利的反应。一种将信号转导途径的因子，诸如细胞因子投递至体内的特定部位(例如，肿瘤或肿瘤微环境)的方式是将该因子与对该部位特异性的免疫球蛋白缀合。早期策略针对将信号转导途径的因子，诸如细胞因子投递至体内的特定部位，包括与各种细胞因子，包括淋巴毒素、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白介素-2(IL_2)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)缀合的免疫球蛋白重链。免疫球蛋白重链或是与细胞因子化学缀合或是免疫球蛋白-细胞因子缀合物以融合蛋白表达。见Nakamura K.和Kubo，A. Cancer Supplement80 2650-2655(1997) ;Jun, L.等，Chin. Med. J. 113 :151-153(2000)；及 BeckerJ. C.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :7826-7831 (1996)。研究人员观察到，它们不仅能够将细胞因子靶向至体内的特定部位，它们还能够利用如下的实情，即单克隆抗体比大多数其它蛋白质具有更长的血清半衰期。由于与高剂量的某些未缀合细胞因子，即IL-2有关的系统毒性， 免疫球蛋白-细胞因子融合蛋白在较低剂量使肿瘤部位的免疫刺激活性最大化，而使系统副作用保持最小的能力让研究人员相信，免疫球蛋白-细胞因子免疫缀合物是最佳的治疗剂。然而，免疫球蛋白作为投递剂的临床效用中的主要限制之一是其不充分的摄取和肿瘤中的较差分布，这部分是由于免疫球蛋白分子较大所致。见Xiang，J.等，Immunol. Cell Biol. 72 :275-285 (1994)。另外，已经提示了，免疫球蛋白-细胞因子免疫缀合物可以激活补体，并与Fc受体相互作用。已经不利地看待此固有的免疫球蛋白特征，因为治疗性免疫缀合物可以靶向表达Fc受体的细胞，而不是优选的携带抗原的细胞。一种克服这些问题的方法是使用经工程化改造的免疫球蛋白片段。许多研究已经详述了免疫球蛋白片段-细胞因子免疫缀合物的特征。见&wage，P.等，Br. J. Cancer 67 :304-310(1993) ；Harvill, Ε. Τ.和 Morrison S. L.，Immunotechno1. 1 :95-105(1995)； 及Yang J.等，Mol. Immunol. 32 :873-881 (1995)。一般地，存在着两种常见的免疫球蛋14白片段-细胞因子融合蛋白构建体，即哺乳动物细胞中表达的F(ab’ )2-细胞因子和大肠杆菌(Escherichia coli)中表达的 scFv-细胞因子。见 Xiang，J. Hum. Antibodies 9 23-36(1999)。免疫球蛋白亲本分子的肿瘤结合反应性和细胞因子的功能性活性两者在大多数这些类型的免疫缀合物中得到维持。新近的临床前研究已经显示了，这些融合蛋白能够将细胞因子在体内靶向表达肿瘤相关抗原的肿瘤，并抑制免疫能力动物模型中的原发性和转移性肿瘤两者。免疫球蛋白片段-细胞因子免疫缀合物的例子包括如PCT公开文本 W02001/062298A2中所列的scFv-IL_2免疫缀合物；如美国专利No. 5，650, 150中所列的免疫球蛋白重链片段-GM-CSF免疫缀合物；如PCT公开文本W02006/119897A2中所列的免疫缀合物，其中scFv-IL-12第一亚基与IL-12第二亚基-scFv仅共享二硫键，和如PCT公开文本TO 99/29732A2中所描述的免疫缀合物，其中Ig重链片段-IL-12第一亚单位与Ig重链片段-IL-12第二亚单位仅共享二硫键。虽然与第一代免疫球蛋白-细胞因子缀合物相比， 这些第二代免疫缀合物具有一些改善的特性，但是开发更多且甚至更安全的特异性治疗剂对于针对肿瘤细胞的更大效率和这些产品的副作用(例如，毒性、对非肿瘤细胞的破坏等) 的数目和严重性降低是期望的。另外，期望鉴定在维持可接受的治疗活性水平的情况下进一步稳定免疫缀合物的方式。本发明提供了相对于已知的免疫缀合物，展现出改善的功效、高的作用特异性、降低的毒性和血液中改善的稳定性的免疫缀合物。发明概述本发明的一方面涉及与已知的免疫缀合物相比，展现出改善的功效、高的作用特异性、降低的毒性和血液中改善的稳定性的免疫缀合物。可以使用本发明的免疫缀合物来将效应器模块选择性投递至体内的靶部位。在另一个实施方案中，免疫缀合物将细胞因子投递至靶部位，其中所述细胞因子可以施加局部生物学效应，诸如局部炎性应答、刺激T细胞生长和活化和/或活化B和/或NK细胞。本发明的一方面涉及免疫缀合物，其包含至少第一效应器模块和至少第一和第二抗原结合模块，其独立选自下组FV和Fab，其中第一效应器模块与第一抗原结合模块共享氨基或羧基端肽键，而第二抗原结合模块与i)所述第一效应器模块或ii)所述第一抗原结合模块共享氨基或羧基端肽键本发明的另一方面是免疫缀合物，其至少包含在其氨基端氨基酸处与一个或多个 scFv分子连接的第一单链效应器模块，且其中所述第一单链效应器模块在其羧基端氨基酸处与一个或多个scFv分子连接。本发明的另一方面是免疫缀合物，其包含至少第一单链效应器模块和第一和第二抗原结合模块，其中第一和第二抗原结合模块之每个包含在其羧基端氨基酸处与包含免疫球蛋白恒定域的恒定区连接的scFv分子，所述免疫球蛋白恒定域独立选自下组IgG CHI、 IgG Ck和IgE CH4，且其中第一抗原结合模块在其恒定区羧基端氨基酸处与效应器模块之一的氨基端氨基酸连接，且其中第一和第二抗原结合模块经由至少一个二硫键共价连接。本发明的另一方面是免疫缀合物，其包含至少第一单链效应器模块和第一和第二抗原结合模块，其中第一和第二抗原结合模块之每个包含在其羧基端氨基酸处与IgGl CH3 域连接的scFv分子，且其中第一抗原结合模块在其羧基端氨基酸处与效应器模块之一的氨基端氨基酸连接，且其中第一和第二抗原结合模块经由至少一个二硫键共价连接。本发明的另一方面涉及免疫缀合物，其包含第一和第二单链效应器模块和第一和第二抗原结合模块，其中每个抗原结合模块包含在其重或轻链羧基端氨基酸处与IgGl CH3 域连接的Fab分子，且其中每个IgGl CH3域在其羧基端氨基酸处与效应器模块之一的氨基端氨基酸连接，且其中第一和第二抗原结合模块经由至少一个二硫键共价连接。在一个实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列SEQ ID N0:95。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列SEQ ID N0:104。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列SEQ ID NO :105o在另一个实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列SEQ ID NO :106。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列SEQ ID N0:107。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列SEQ ID N0:96。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含多肽序列SEQ IDNO :96和选自下组的多肽序列SEQ ID NO :95和104-107。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含具有与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99% 相同的序列的多肽:SEQ ID NO :95、96和104-107。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与SEQ ID NO :108至少约80%、85%、 90%、95(%、96(%、97(%、98(%、或99(%相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO :108编码的多肽序列。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与 SEQ ID NO :117 至少约 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、 或99%相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO :117编码的多肽序列。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与SEQ ID NO 118至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO 118 编码的多肽序列。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与SEQ ID NO :119至少约80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO :119编码的多肽序列。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与SEQ ID NO :120至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98%、或99%相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO :120编码的多肽序列。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与 SEQ ID NO :109 至少约 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO 109编码的多肽序列。在一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列SEQ ID N0:13或SEQ IDN0:15至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的重链可变区。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列SEQ ID NO :9或SEQ ID NO :11至少约80%、85%、90%、 95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的轻链可变区序列。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列 SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO :15 至少约 80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%、99%、或100%相同的重链可变区序列和与序列SEQ ID NO :9或SEQ ID NO 11 至少约80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^ 100%相同的轻链可变区序列。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与SEQ ID NO 14或SEQ ID NO 16至少约 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列编码的重链可变区序16列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID N0:14或SEQ ID NO: 16编码的重链可变区序列。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与SEQ ID N0:10或SEQ ID NO 12至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列编码的轻链可变区序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 12编码的轻链可变区序列。在一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列SEQ ID而99至少约80%、85%、 90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列 SEQ ID NO :100 或 SEQ ID NO :215 至少约 80%、85%、90%、95%、96%、 97^^98^^99%.或100%相同的多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列 SEQ ID NO :101 或SEQ ID NO :235至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%相同的多肽序列。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列SEQID NO :100至少约 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%相同的多肽序列和与序列 SEQ ID NO :101至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的多肽序列。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列SEQ ID NO :215至少约80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%、99%、或100%相同的多肽序列和与序列SEQ ID NO :2；35至少约80%、 85%,90%,95%,96%,97%,98%,99% ^ 100%相同的多肽序列。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与SEQ ID NO :112至少约80%、85%、 90%、95(%、96(%、97(%、98(%、或99(%相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO :112编码的多肽序列。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与SEQ ID NO :113或SEQ ID NO :216至少约80%、85%、90%、95%、 96^^97^^98%,或99%相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO :113或SEQ ID NO :216编码的多肽序列。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与SEQ ID NO :114或SEQ ID NO :236至少约80%、85%、 90%、95(%、96(%、97(%、98(%、或99(%相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO :114或SEQ ID NO :236编码的多肽序列。在一个实施方案中，免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80 ^^85%,90%、 95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 相同的重链可变区序列SEQ ID NO -J, SEQ ID NO: 179，SEQ ID NO: 183，SEQ ID NO: 187，SEQ IDNO : 191，SEQ ID NO: 195，SEQ ID NO: 199，SEQ ID NO :203和SEQ ID NO :207。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约 80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%,^； 100%相同的轻链可变区序列=SEQ ID NO 3,SEQ ID N0:5，SEQ ID NO 177,SEQ ID NO 181,SEQ ID NO 185,SEQ ID NO 189, SEQ ID NO :193, SEQ ID NO 197, SEQ ID NO :201 禾口 SEQ ID NO :205。在又一个实施方案中， 免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、 或 100%相同的重链可变区序列=SEQ ID NO -J, SEQ ID NO :179, SEQ ID NO :183，SEQ ID NO :187, SEQ ID NO :191，SEQ ID NO :195，SEQ ID NO :199，SEQ ID NO :203 和 SEQ ID NO 207和与选自下组的序列至少约80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^ 100%相同的轻链可变区序列:SEQ ID NO 3,SEQ ID N0:5，SEQ ID NO =177,SEQ ID NO =181,SEQ ID NO :185, SEQ ID NO :189, SEQ ID NO :193, SEQ ID NO :197, SEQ ID NO :201 和 SEQ ID NO 205。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与选自下组的序列至少约80^^85%, 90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列编码的重链可变区序列SEQ ID NO 8, SEQ ID NO :180，SEQ ID NO :184，SEQ ID NO :188，SEQ ID NO :192，SEQ ID NO :196， SEQ ID NO :200, SEQ ID NO :204和SEQ ID NO :208。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由与选自下组的多核苷酸序列编码的重链可变区序列SEQ ID NO 8, SEQ ID NO :180，SEQ ID NO :184,SEQ ID NO 188,SEQ ID NO 192,SEQ ID NO 196,SEQ ID NO 200,SEQ ID NO: 204和SEQ ID N0:208。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与选自下组的序列至少约 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列编码的轻链可变区序列SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :6，SEQ ID NO :178，SEQ ID NO :182，SEQ ID NO :186，SEQ ID NO :190, SEQ ID NO :194, SEQ ID NO 198，SEQ ID NO :202 和 SEQ ID NO :206。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由选自下组的多核苷酸序列编码的轻链可变区序列SEQ ID NO 4,SEQ ID N0:6，SEQ ID NO :178,SEQ ID NO :182,SEQ ID NO :186,SEQ ID NO :190,SEQ ID NO :194, SEQ ID NO :198, SEQ ID NO :202 和 SEQ ID NO :206。在一个实施方案中，免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80% ,85^^90%、 95%、96%、97%、98%、99%、或 100%相同的多月太序列SEQ ID NO :239、SEQ ID NO :241 禾口 SEQ ID N0:243。在另一个实施方案中，所述缀合物包含与选自下组的序列至少约80 %、 85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%相同的多肽序列SEQ ID NO :245、SEQ ID NO :247和SEQ ID NO :249。在又一个实施方案中，所述免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约 80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^ 100%相同的多肽序列=SEQ ID NO :239, SEQ ID NO :241 禾口 SEQ ID NO :243，和与选自下组的序列至少约 80%、85%、90%、 95%、96%、97%、98%、99%、或 100%相同的多月太序列SEQ ID NO :245、SEQ ID NO :247 禾口 SEQ ID NO :249 ο在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与选自下组的序列至少约80^^85%, 90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列编码的多肽序列SEQ ID N0: 240,SEQ ID NO :242和SEQ ID NO J44。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由选自下组的多核苷酸序列编码的多肽序列SEQ ID NO :240,SEQ ID NO :242和SEQ ID NO :244。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列编码的多肽序列SEQ ID NO 246, SEQ ID NO :248 和SEQ ID N0:250。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由选自下组的多核苷酸序列编码的多Jft序列SEQ ID NO :246, SEQ ID NO :248 和 SEQ ID NO :250。在一个实施方案中，免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80 ^^85%,90%、 95%、96%、97%、98%、99%、或 100%相同的重链可变区序列SEQ ID NO :21，SEQ ID N0: 25，SEQ ID NO :27，SEQ ID NO :31，SEQ ID NO :35，SEQ ID NO :39，SEQ ID NO :43，SEQ ID NO 47, SEQ ID NO :51，SEQ ID NO :69，SEQ ID NO :73，SEQ ID NO -Jl, SEQ ID NO :81，SEQ ID NO 85, SEQ ID NO :89，SEQ ID NO :93，SEQ ID NO :123，SEQ ID NO :127，SEQ ID NO 131，SEQ ID NO :135，SEQ ID NO :139，SEQ ID NO :143，SEQ ID NO :147，SEQ ID NO :151， SEQ ID NO :155, SEQ ID NO :159，SEQ ID NO :163，SEQ ID NO :167，SEQ ID NO :171 和 SEQ ID N0:175。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80^^85%,90%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%相同的轻链可变区序列SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO :23，SEQ ID NO :29，SEQ ID NO :33，SEQ ID NO :37，SEQ ID NO :41，SEQ ID NO 45, SEQ ID NO :49，SEQ ID NO :67，SEQ ID NO :71，SEQ ID NO :75，SEQ ID NO :79， SEQ ID NO 83,SEQ ID NO 87,SEQ ID N0:91，SEQ ID NO 121,SEQ ID NO 125,SEQ ID NO: 129，SEQ ID NO :133，SEQ ID NO :137，SEQ ID NO :141，SEQ ID NO :145，SEQ ID NO :149， SEQ ID NO :153, SEQ ID NO :157，SEQ ID NO :161，SEQ ID NO :165，SEQ ID NO :169 和 SEQ ID N0:173。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80^^85%, 90%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%相同的重链可变区序列SEQ ID N0:21，SEQ ID NO 25, SEQ ID NO :27，SEQ ID NO :31，SEQ ID NO :35，SEQ ID NO :39，SEQ ID NO :43，SEQ ID NO 47, SEQ ID NO :51，SEQ ID NO :69，SEQ ID NO :73，SEQ ID NO -Jl, SEQ ID NO :81， SEQ ID NO 85,SEQ ID NO 89,SEQ ID NO 93,SEQ ID NO 123,SEQ ID NO 127,SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO 135, SEQ ID NO 139, SEQ ID NO 143, SEQ ID NO 147, SEQ ID NO 151, SEQ ID NO :155, SEQ ID NO :159, SEQ ID NO :163, SEQ ID NO :167, SEQ ID NO :171 禾口 SEQ ID NO :175，与选自下组的序列至少约 80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^ 100% 相同的轻链可变区序列:SEQ ID NO :17, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO :37，SEQ ID NO :41，SEQ ID NO :45，SEQ ID NO :49，SEQ ID NO :67， SEQ ID NO 71, SEQ ID NO :75，SEQ ID NO :79，SEQ ID NO :83，SEQ ID NO :87，SEQ ID NO 91，SEQ ID NO 121, SEQ ID NO 125, SEQ ID NO 129, SEQ ID NO 133, SEQ ID NO 137, SEQ ID NO :141,SEQ ID NO 145,SEQ ID NO 149,SEQ ID NO 153,SEQ ID NO 157,SEQ ID NO: 161，SEQ ID NO :165，SEQ ID NO :169 和 SEQ ID NO :173。 在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与选自下组的序列至少约80^^85%, 90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列编码的重链可变区序列SEQ ID NO 22, SEQ ID NO :26，SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :32，SEQ ID NO :36，SEQ ID NO :40，SEQ ID NO 44, SEQ ID NO :48，SEQ ID NO :52，SEQ ID NO :70，SEQ ID NO :74，SEQ ID NO :78， SEQ ID NO 82,SEQ ID NO 86,SEQ ID NO 90,SEQ ID NO 94,SEQ ID NO 124,SEQ ID NO: 128，SEQ ID NO :132，SEQ ID NO :136，SEQ ID NO :140，SEQ ID NO :144，SEQ ID NO :148， SEQ ID NO :152, SEQ ID NO 156, SEQ ID NO 160, SEQ ID NO 164, SEQ ID NO 168, SEQ ID NO :172和SEQ ID N0:176。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由选自下组的多核苷酸序列编码的重链可变区序列:SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO :32， SEQ ID NO 36, SEQ ID NO :40，SEQ ID NO :44，SEQ ID NO :48，SEQ ID NO :52，SEQ ID NO 70，SEQ ID NO :74，SEQ ID NO :78，SEQ ID NO :82，SEQ ID NO :86，SEQ ID NO :90，SEQ ID NO 94, SEQ ID NO 124, SEQ ID NO 128, SEQ ID NO 132, SEQ ID NO 136, SEQ ID NO :140， SEQ ID NO :144, SEQ ID NO 148, SEQ ID NO 152, SEQ ID NO 156, SEQ ID NO 160, SEQ ID NO :164, SEQ ID NO 168, SEQ ID NO :172 和 SEQ ID N0:176。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列编码的轻链可变区序列:SEQ ID NO :18, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO :34，SEQ ID NO :38，SEQ ID NO :42，SEQ ID NO :46，SEQ ID NO :50， SEQ ID NO 68, SEQ ID NO -J2, SEQ ID NO :76，SEQ ID NO :80，SEQ ID NO :84，SEQ ID NO 88，SEQ ID NO :92，SEQ ID NO :122，SEQ ID NO :126，SEQ ID NO :130，SEQ ID NO :134，SEQID NO :138,SEQ ID NO 142,SEQ ID NO 146,SEQ ID NO 150,SEQ ID NO 154,SEQ ID NO: 158，SEQ ID NO: 162，SEQ ID NO: 166，SEQ ID NO :170 禾口 SEQ ID NO: 174。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由选自下组的多核苷酸序列编码的轻链可变区序列SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO :24，SEQ ID NO :30，SEQ ID NO :34，SEQ ID NO :38，SEQ ID NO 42，SEQ ID NO :46，SEQ ID NO :50，SEQ ID NO :68，SEQ ID NO -J2, SEQ ID NO :76，SEQ ID NO 80,SEQ ID NO 84,SEQ ID NO 88,SEQ ID NO 92,SEQ ID NO 122,SEQ ID NO 126,SEQ ID NO :130,SEQ ID NO 134,SEQ ID NO 138,SEQ ID NO 142,SEQ ID NO 146,SEQ ID N0: 150，SEQ ID NO :154, SEQ ID NO :158, SEQ ID NO :162, SEQ ID NO :166, SEQ ID NO :170 和 SEQ ID NO :174ο在一个实施方案中，免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80 ^^85%,90%、 95%、96%、97%、98%、99%、或 100%相同的多月太序列SEQ ID NO :209，SEQ ID NO :211， SEQ ID NO :213, SEQ ID N0:217，SEQ ID N0:219，SEQ ID NO :221, SEQ ID NO :223, SEQ ID NO :225和SEQ ID NO :227。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约 80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^ 100%相同的多肽序列=SEQ ID NO 229，SEQ ID NO :231、SEQ ID NO :233 和 SEQ ID NO :237。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100% 相同的多肽序歹 Ij :SEQ ID N0:211、SEQ ID NO :219 禾口 SEQ ID NO :221，和与序列 SEQ ID NO: 231 至少约 80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%,^； 100%相同的多肽序列。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含与选自下组的序列至少约80^^85%,90^^95%,96%、 97%、98%、99%、或 100%相同的多肽序列SEQ ID NO :209、SEQ ID NO :223、SEQ ID N0: 225和 SEQ ID NO :227，和与序列 SEQ ID NO :2 至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98 %、99 %、或100 %相同的多肽序列。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列SEQ ID NO :213 至少约 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%相同的多肽序列，和与序列 SEQ ID NO :233 至少约 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%相同的多肽序列。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列SEQ ID NO :217至少约80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%相同的多肽序列，和与序列 SEQ ID N0: 237 至少约 80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^ 100%相同的多肽序列。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与选自下组的序列至少约80^^85%, 90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列编码的多肽序列SEQ ID N0: 210，SEQ ID NO :212，SEQ ID NO :214，SEQ ID NO :218，SEQ ID NO :220，SEQ ID NO :222， SEQ ID NO :224, SEQ ID NO :2 和SEQ ID NO :2观。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由选自下组的多核苷酸序列编码的多肽序列SEQ ID NO :210, SEQ ID NO :212，SEQ ID NO :214, SEQ ID NO :218，SEQ ID NO :220，SEQ ID NO :222，SEQ ID NO :224，SEQID NO :226 和SEQ ID NO :228。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与选自下组的序列至少约80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列编码的多肽序列=SEQ ID NO :230, SEQ ID NO :232、SEQ ID NO:2;34 和 SEQ ID NO :238。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由选自下组的多核苷酸序列编码的多肽序列SEQ ID NO :230,SEQ ID NO :232、 SEQ ID NO 234 和 SEQ ID NO :238。在一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列SEQ ID NO :257或SEQ ID NO :261至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的重链可变区序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列SEQ ID NO 259或SEQ ID NO :271至少约80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的轻链可变区序列。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列SEQ ID NO :257或SEQ ID NO :261至少约80%、85%、90%、 95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的重链可变区序列，和与序列SEQ ID NO :259或 SEQ ID 而271至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的轻链可变区序列。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与序列SEQ ID NO :258或SEQ ID NO :262 至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列编码的重链可变区序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO :258或SEQ ID NO :262编码的重链可变区序列。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与序列SEQ ID NO :260 或 SEQ ID NO :272 至少约 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或 99%相同的多核苷酸序列编码的轻链可变区序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO 260或SEQ ID NO :272编码的轻链可变区序列。在一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列SEQ ID NO :251或SEQ ID NO :255至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列SEQ ID NO :253或SEQ ID NO :265至少约80%、85%、 90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的多肽序列。在又一个实施方案中，免疫缀合物包含与序列 SEQ ID NO :251 或 SEQ ID NO :255 至少约 80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%、99%、或100%相同的多肽序列，和与序列SEQ ID NO :253或SEQ ID NO :265至少约 80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^ 100%相同的多肽序列。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与序列SEQ ID NO :252或SEQ ID NO :256 至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO :252或SEQ ID NO :256编码的多肽序列。在一个实施方案中，免疫缀合物包含由与SEQ ID NO :2 或SEQ ID NO :266至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列编码的多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO :2 或 SEQ ID NO :266编码的多肽序列。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含至少一个效应器模块，其中所述效应器模块是细胞因子。在一个具体的实施方案中，效应器模块是选自下组的细胞因子白介素-2(IL-2)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-a (INF-a)、白介素-12(IL_12)、白介素-8(IL-8)、巨噬细胞炎性蛋白_1 a (MIP-1 a )、巨噬细胞炎性蛋白-1β (ΜΙΡ-1 β)和转化生长因子-β (TGF-β)。在另一个实施方案中，至少一个抗原结合模块对下列一种抗原决定簇是特异性的纤连蛋白的额外域B(EDB)、生腱蛋白的Al域 (TNC-A1)、生腱蛋白的A2域(TNC-A》、成纤维细胞激活蛋白(FAP)；和黑素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)。在另一个实施方案中，本发明的免疫缀合物以比对照效应器模块的解离常数大至少约 1、1· 5、2、2· 5、3、3· 5、4、4· 5、5、5· 5、6、6· 5、7、7· 5、8、8. 5、9、9· 5 或 10 倍的解离常数(Kd)结合效应器模块受体。在另一个实施方案中，免疫缀合物在施用期结束时在体内将肿瘤体积增加抑制至少约 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 或更多。在另一个实施方案中，相对于对照效应器模块或“双抗体(diabody)”免疫缀合物(immimoconjugate)分子中的效应器模块，在对有此需要的哺乳动物施用时免疫缀合物将患有恶性肿瘤的哺乳动物的存活延长至少约10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、 80%、90%。本发明的另一方面涉及编码本发明的免疫缀合物或其片段的分离的多核苷酸。本发明的另一方面涉及包含含有本发明的多核苷酸序列的表达盒的表达载体。本发明的另一方面涉及表达本发明的免疫缀合物或其片段的宿主细胞。本发明的另一方面涉及用于生成本发明的免疫缀合物或其片段的方法，其中该方法包括在适合于其表达的条件下培养用表达载体转化的宿主细胞，所述表达载体编码本发明的免疫缀合物或片段。本发明的另一方面涉及用于促进活化的T淋巴细胞细胞中的增殖和分化的方法， 包括使活化的T淋巴细胞细胞与有效量的本发明的免疫缀合物接触。本发明的另一方面涉及用于促进活化的B淋巴细胞细胞中的增殖和分化的方法， 包括使活化的B淋巴细胞细胞与有效量的本发明的免疫缀合物接触。本发明的另一方面涉及用于促进天然杀伤(NK)细胞中的增殖和分化的方法，包括使NK细胞与有效量的本发明的免疫缀合物接触。本发明的另一方面涉及用于促进粒细胞、单核细胞或树突细胞中的增殖和分化的方法，包括使粒细胞、单核细胞或树突细胞与有效量的本发明的免疫缀合物接触。本发明的另一方面涉及用于促进细胞毒性T淋巴细胞(CTL)分化的方法，包括使 T淋巴细胞细胞与有效量的本发明的免疫缀合物接触。本发明的另一方面涉及用于抑制病毒复制的方法，包括使病毒感染的细胞与有效量的本发明的免疫缀合物接触。本发明的另一方面涉及用于上调主要组织相容性复合体I (MHC I)表达的方法，包括使靶细胞与有效量的本发明的免疫缀合物接触。本发明的另一方面涉及用于诱导细胞死亡的方法，包括对靶细胞施用有效量的本发明的免疫缀合物。本发明的另一方面涉及用于诱导靶细胞中的趋化性的方法，包括对靶细胞施用有效量的本发明的免疫缀合物。本发明的另一方面涉及用于治疗个体中的疾病的方法，包括对个体施用治疗有效量的包含本发明的免疫缀合物和药用载体的组合物的步骤。附图简述图1 各种免疫缀合物融合形式的示意图。图1中的所有构建体包含两个抗体scFv 片段(在抗原结合模块(antigen binding moiety)中)和一个或两个与其连接的细胞因子分子(作为效应器模块(effector moiety))。小图A至E显示了抗原结合模块和效应器模块的不同连接和化学计量学。小图A)描绘了“双抗体(diabody) ”-IL_2融合物。“双抗体”自两个相同的多肽链非共价装配。小图B显示了一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含在其羧基端处与细胞因子融合的Fab分子的重链，所述细胞因子继而在其羧基端处与第二 Fab重链融合。共表达轻链与重链Fab-细胞因子-重链Fab多肽以形成免疫缀合物。或22者，可以将两条轻链与细胞因子融合，并共表达重链。在小图C中，彼此直接融合两个Fab 重链。细胞因子与第二抗原结合模块重链共享氨基端肽键。小图B和C的两个分子形式可以改变为使得用scFv片段替换Fab链，如小图D和E中所显示的。图2 包含两个抗原结合模块和至少一个或多个效应器模块的其它免疫缀合物的示意图。小图A显示了经由其羧基端与IgG CH3域融合的Fab分子。为了实现共价抗原结合模块同二聚化，可以在IgG CH3域的羧基端处引入人工二硫键(在小图A内右侧的免疫缀合物)。可以用IgE CH4域替换小图A中所显示的IgGl CH3域。用小图B中的scFv片段替换小图A中的Fab模块。对于小图C的免疫缀合物，将天然的IgG铰链在Fab分子的 C端融合。因为铰链的羧基端区可以对IgG铰链区C端融合的恒定域装配强加一些几何学约束，所以可以在铰链的羧基端区与IgG CH3域的氨基端间引入人工接头。也可以在scFv 片段与免疫球蛋白恒定域间引入铰链区，如小图D中所显示的。在小图A至D中，使用IgGl CH3或IgE CH4域来使构建体同二聚化。小图E描绘了一种免疫缀合物，其中经由CHI/Ck 异二聚化相互作用来实现二聚化。小图D的免疫缀合物可以具有每个免疫缀合物一个或两个细胞因子。图3呈现了用对肿瘤基质基质特异性的两种不同白介素-2免疫缀合物分子形式的功效实验的结果。将F9畸胎瘤皮下注射入U9SvEv小鼠中，并使用测径器来测量肿瘤大小。在两个不同浓度比较“双抗体”-IL-2分子与Fab-白介素-2-Fab(Fab-IL2-Fab)免疫缀合物，其中浓度反映相似数目的免疫缀合物分子。在图3中，Fab-IL2-Fab免疫缀合物标记为“Fab-L19”，未偶联的白介素-2对照标记为“Unconj rIL_2”，“双抗体”-IL-2分子标记为“双抗体”。使用针对纤连蛋白的额外域B (EDB)的L19抗体来生成双抗体和Fab-L19免疫缀合物两者中的抗原结合模块。在图示中标示了每只小鼠注射的免疫缀合物量(Wyg 计)。图4呈现了用对肿瘤基质基质特异性的两种不同白介素-2免疫缀合物分子形式的存活实验的结果。将人胃肿瘤细胞系LS174T脾内注射入SCID-米色小鼠中。在图4 中，Fab-IL2-Fab免疫缀合物标记为“Fab_L19”，未缀合的白介素_2对照标记为“Unconj rIL-2”，“双抗体” -IL-2分子标记为“双抗体”。使用抗-EDB抗体L19来生成双抗体和 Fab-LlQ免疫缀合物两者中的抗原结合模块。在图示中标示了每只小鼠注射的免疫缀合物量(以μ g计)，并且反映免疫缀合物分子的相同数目。图5显示了 100X和400X放大率的人子宫组织的免疫组织化学图像。通过实施例 3中所描述的方法生成的2B10可变区结合人生腱蛋白(tenascin)的A2域(TNC-A2)。融合Fab片段中的2B10可变区与FLAG片段(SHD2B10-FLAG)。制备健康的和癌性的人子宫组织样品以进行免疫组织化学染色。随后，将样品与SHD2B10-FLAG Fab片段一起温育。然后，将样品清洗，并与对FLAG表位特异性的荧光抗体一起温育。与健康组织样品相比，癌性组织样品展现出更高的TNC-A2表达水平。图6显示了按％免疫荧光表面积计的各种人组织样品中的TNC-A2表达水平。将来自健康个体和癌症患者的各种人组织样品与SHD2B10-FLAG Fab片段一起温育，如图5中所描述的。图7显示了按％免疫荧光表面积计的各种人组织样品中的成纤维细胞激活蛋白 (FAP)表达水平。将来自健康个体和癌症患者的各种人组织样品与针对FAP的商业抗体(Abeam) 一起温育。图上的每个柱形的顶部部分代表FAP的肿瘤表达，而图上的每个柱形的底部部分代表正常的FAP表达。图8呈现了显示已知的IgG抗体L19对EDB的亲和力的BIAC0RE数据。图9呈现了显示对EDB特异性的Fab-IL-2-Fab免疫缀合物的亲和力的BIAC0RE 数据。免疫缀合物中的Fab片段自L19抗体衍生。图10呈现了显示对EDB特异性的“双抗体”-IL2融合蛋白的亲和力的BIAC0RE数据。双抗体scFv片段自L19抗体衍生。“双抗体”-IL2融合蛋白包含位于scFv片段与IL-2 分子间的8个氨基酸的接头。图11呈现了显示对EDB特异性的“双抗体”-IL2融合蛋白的亲和力的BIAC0RE数据。双抗体scFv片段自L19抗体衍生。“双抗体”-IL2融合蛋白包含位于scFv片段与IL-2 分子间的12个氨基酸的接头。图12呈现了显示已知的IgG抗体F16对固定化的生腱蛋白域Al (TNC-Al)的亲和力的BIAC0RE数据。图12还呈现了显示F16抗体的Fab片段对TNC-Al的亲和力的BIAC0RE 数据。图中标示了对F16IgG和Fab分子计算的解离常数(Kd)。图13呈现了显示IL-2对固定化的IL-2受体的亲和力的BIAC0RE数据。通过将相应的链与人IgGlFc部分的“突出-入-穴”变体融合来实现IL-2R的β和γ链的异二聚化，如记载于 Merchant，A.M.等，Nat. Biotech. 16 :677-681 (1998)的。图中标示了自 BIAC0RE数据计算的Kd值。图14呈现了显示“双抗体”-IL-2融合蛋白对TNC-Al和IL_2受体的亲和力的 BIAC0RE数据。抗体中的scFv分子自F16抗体衍生。图中标示了自BIAC0RE数据计算的Kd值。图15呈现了显示Fab-IL-2-Fab免疫缀合物对TNC-Al和IL_2受体的亲和力的 BIAC0RE数据。免疫缀合物中的Fab分子自F16抗体衍生。图中标示了自BIAC0RE数据计算的Kd值。图16呈现了显示scFv-IL-2-scFv免疫缀合物对TNC-A1和IL-2受体的亲和力的 BIAC0RE数据。免疫缀合物中的scFv分子自F16抗体衍生。图中标示了自BIAC0RE数据计算的Kd值。图17是自图12-16中呈现的BIAC0RE研究获得的Kd值的汇总表。图18呈现了比较靶向纤连蛋白的EDB域的“双抗体”-IL-2分子与靶向生腱蛋白 C A2域的Fab-白介素-2-Fab免疫缀合物(标记为“Fab_SH2B10”，其包含分别为SEQ ID NO 3和7的重和轻链可变区)的功效实验的结果。在图18中，未缀合的白介素-2对照标记为“Unconj rIL-2”，“双抗体” -IL-2分子标记为“L19双抗体”。使用抗EDB抗体L19来生成双抗体免疫缀合物中的抗原结合模块。将畸胎瘤细胞系F9皮下注射入1 系的有免疫能力小鼠中。图示中标示了每只小鼠注射的免疫缀合物量(以Pg计)。在第6天开始处理，并总共实施5次注射，直至实验的第11天。图19显示了与未缀合的人IL-2相比，抗FAP、或抗生腱蛋白C、Fab-IL2-Fab免疫缀合物(使用3F2、3D9、4B3 (抗-FAP)、2F11和2B10构建体(抗生腱蛋白C)的Vh和Vl序列生成)对NK-92细胞增殖的诱导。在温育两天后使用CellTiter Glo系统来测量细胞增殖。图20呈现了测量与未缀合的细胞因子，或在分开的分子中含有IL-12的p35和 P40域的免疫缀合物相比，各种含有白介素12的免疫缀合物对IFN- γ生成的诱导的ELISA 测定法的结果。小图A显示了经纤连蛋白包被的板上的结果。小图B显示了溶液中的结果。图21显示了对亲和力成熟的抗FAP Fab片段的基于表面等离振子共振(SPR)的动力学分析。对结合人(hu)FAP(A)和鼠(mu)FAP(B)的克隆19G1，对结合hu FAP(C)、mu FAP(D)的克隆20G8及对结合hu FAP(E)和mu FAP(F)的克隆4B9呈现了加工的动力学数据集。平滑线代表数据对1 1相互作用模型的全局拟合。图22显示了对亲和力成熟的抗FAP Fab片段的基于SPR的动力学分析。对结合 hu FAP(A)和mu FAP(B)的克隆5B8，对结合hu FAP (C) ,mu FAP(D)的克隆5F1及对结合hu FAP(E)和mu FAP(F)的克隆14B3呈现了加工的动力学数据集。平滑线代表数据对1 1 相互作用模型的全局拟合。图23显示了对亲和力成熟的抗FAP Fab片段的基于SI5R的动力学分析。对结合 hu FAP(A)和 mu FAP(B)的克隆 16F1，对结合 hu FAP(C)、mu FAP(D)的克隆 16F8 及对结合hu FAP(E)和mu FAP(F)的克隆03C9呈现了加工的动力学数据集。平滑线代表数据对 11相互作用模型的全局拟合。图M显示了对亲和力成熟的抗FAP Fab片段的基于SI5R的动力学分析。对结合 hu FAP(A)和 mu FAP(B)的克隆 02D7，对结合 hu FAP(C)、mu FAP (D), cyno FAP(E)的克隆 28H1及对结合hu FAP(F)、mu FAP(G)和猕猴(cyno) FAP (H)的克隆22A3呈现了加工的动力学数据集。平滑线代表数据对1 1相互作用模型的全局拟合。图25显示了对亲和力成熟的抗FAP Fab片段的基于SPR的动力学分析。对结合 hu FAP(A)、mu FAP(B)、cyno FAP(C)的克隆 ^Bll,及对结合 FAP (D)、mu FAP(E)和 cyno FAP(F)的克隆23C10呈现了加工的动力学数据集。平滑线代表数据对1 1相互作用模型的全局拟合。图沈显示了对亲和力成熟的结合人(hu) TNC A2的抗TNC A2Fab片段的基于SI3R 的动力学分析。对克隆2B10_C3B6(A)、克隆2B10_6A12(B)、克隆2B10_C3A6(C)、克隆2B10_ 07D8(D)、克隆2B10_01F7(E)和克隆2B10_6H10 (F)呈现了加工的动力学数据集。平滑线代表数据对11相互作用模型的全局拟合。图27给出了为了纯化基于3F2的Fab-IL2-Fab而实施的三个纯化步骤的概述。图观显示了来自基于3F2的Fab-IL2-Fab的纯化的结果(A和B)和来自基于 4G8 的 Fab-IL2-Fab 的纯化的结果(C 禾口 D)。(A,C) 4-12% Bis-Tris 和 3-8% Tris 乙酸盐 SDS-PAGE及纯化规程期间的级分和终产物。(B，D)三个应用的纯化步骤后的分析用大小排阻层析。图四显示了来自2B10 Fab-IL2-Fab免疫缀合物的纯化的结果。(A)4_12% Bis-Tris SDS-PAGE及纯化规程期间的级分和终产物。B)三个应用的纯化步骤后的分析用大小排阻层析。图30显示了基于抗纤连蛋白EDB L19的Fab-IL2-Fab的稳定性评估。将 L19Fab-IL2-Fab以浓度6. 3mg/ml在20mM盐酸组氨酸、140mM NaCl，pH6. 0中配制，并于室温及于4°C贮存4周。每周通过UV分光术对样品分析(A)浓度(在离心以使潜在的沉淀物质沉淀后)并通过分析用大小排阻层析来测定(B)聚集物含量。
图31显示了对针对人、鼠和猕猴(cyno)FAP和人IL-2受体- β / Y (IL2R bg)的 FAP靶向性3F2 Fab-IL2-Fab免疫缀合物的基于SPR的动力学分析，如通过表面等离振子共振测定的。平滑线代表数据对1 1相互作用模型的全局拟合。图32显示了对针对人、鼠和猕猴(cyno) FAP的FAP靶向性4G8Fab_IL2_Fab免疫缀合物的基于SI^R的动力学分析，如通过表面等离振子共振测定的。平滑线代表数据对1 1 相互作用模型的全局拟合。图33显示了对针对人和鼠IL-2受体β / Y和α链的FAP靶向性4G8Fab_IL2_Fab 构建体的基于SPR的动力学分析，如通过表面等离振子共振测定的。平滑线代表数据对两态反应模型的全局拟合。图34显示了对针对人、鼠和猕猴(cyno)FAP和人IL-2受体- β / Y (IL2R bg)的 FAP靶向性3D9 Fab-IL2-Fab构建体的基于SPR的动力学分析，如通过表面等离振子共振测定的。平滑线代表数据对1 1相互作用模型的全局拟合。图35显示了对针对人、鼠和猕猴(cyno)嵌合TNC A2融合蛋白和人IL-2受体-β / Y (IL2R bg)的TNC A2靶向性2B10Fab_IL2_Fab构建体的基于SPR的动力学分析，如通过表面等离振子共振测定的。平滑线代表数据对1 1相互作用模型的全局拟合。图36显示了与IL-2(Pr0leukin)和识别纤连蛋白-EDB的L19双抗体相比，识别 TNC A2(2B10)或FAP(3F2和4G8)的靶向性IL-2Fab_IL2_Fab免疫缀合物在诱导NK92细胞增殖中的功效。相对于IL-2分子的数目对χ-轴进行标准化，因为双抗体具有两个IL-2 效应器模块，而Fab-IL2-Fab构建体仅含有一个IL-2效应器模块。在温育2天后使用 CellTiter Glo系统来测量细胞增殖。图37显示了在溶液中，与识别不同的效应器细胞群体上的FAP的FAP靶向性基于 4G8 的 IL-2 Fab-IL2-Fab 免疫缀合物(FAP-targeted 4G8_based IL-2Fab_IL2_Fab immunoconjugate) 一起温育后，由于IL-2介导的IL-2受体信号传导所致的STAT5磷酸化诱导，所述不同的效应器细胞群体来自人PBMC，包括(A)⑶56+NK细胞、(B)⑶4+⑶25TD127+ 辅助T细胞、(C)⑶3+，⑶8+细胞毒性T细胞和⑶⑶4+CD25+F0XP3+调节T细胞(Tregs)。图38显示了在免疫缀合物存在于溶液中或者经由微量滴定板上包被的FAP或TNC A2 固定化时，与 IL-2 相比识另Ij TNC A1(2F11)、TNC A2(2B10)或 FAP (3F2、4B3 禾口 3D9)的靶向性IL-2Fab-IL2-Fab免疫缀合物在诱导IFN-γ释放和ΝΚ92细胞增殖中的功效。图39呈现了用对肿瘤基质特异性的两种不同IL-2免疫缀合物分子形式的存活实验的结果。将人结肠肿瘤细胞系LS174T脾内注射入SCID小鼠中。TNCA2靶向性2Β10 Fab-IL2-Fab免疫缀合物标记为“SH2B10”，未缀合的IL-2对照标记为“Proleukin”，纤连蛋白EDB靶向性双抗体-IL-2分子标记为“双抗体”。在图示中标示了每只小鼠注射的免疫缀合物量(以μ g计)，并且反映了免疫缀合物分子的相同数目。图40呈现了用对肿瘤基质特异性的两种不同IL-2免疫缀合物分子形式的存活实验的结果。将人肾细胞系ACHN肾内注射入SCID小鼠中。FAP靶向性3F2或4G8Fab-IL2-Fab 免疫缀合物标记为“FAP-3F2”和“FAP-4G8”，未缀合的IL-2对照标记为“Proleukin”，纤连蛋白EDB靶向性双抗体-IL-2分子标记为“双抗体”。在图示中标示了每只小鼠注射的免疫缀合物量(以μ g计)，并且反映免疫缀合物分子的相同数目。图41呈现了用对肿瘤基质特异性的两种不同IL-2免疫缀合物分子形式的存活实验的结果。将人NSCLC细胞系A549i. ν注射入SCID小鼠中。TNC A2靶向性2B10 Fab-IL2-Fab免疫缀合物标记为“2B10”，纤连蛋白EDB靶向性双抗体-IL-2分子标记为“双抗体”。在图示中标示了每只小鼠注射的免疫缀合物量(以μ g计)，并且反映了免疫缀合物分子的相同数目。图42呈现了㈧具有L19(纤连蛋白胞外域-B结合剂)作为Fab的 Fab-GM-CSF-Fab免疫缀合物的纯化规程的概述，和(B)纯化的Fab-GM-CSF-Fab免疫缀合物的SDS-PAGE (还原性、非还原性)。图43呈现了比较GM-CSF与具有L19 (纤连蛋白胞外域-B结合剂)作为Fab的纯化的Fab-GM-CSF-Fab免疫缀合物对TF-T细胞的影响的GM-CSF依赖性增殖测定法的结果。图44呈现了(A)具有4G8 (FAP结合剂)作为Fab的Fab-IL12-Fab免疫缀合物的纯化规程的概述，和(B)纯化的Fab-IL12-Fab免疫缀合物的SDS-PAGE(还原性、非还原性)。图45呈现了测试IL-12诱导的IFN- γ释放，比较IL-12和具有4G8 (FAP结合剂) 作为Fab的纯化的Fab-IL12-Fab免疫缀合物的效果，使用自健康供体的新鲜人血液分离的 PBMC的测定法的结果。图46呈现了㈧具有L19(纤连蛋白胞外域-B结合剂)作为Fab的 Fab-IFNa 2-Fab免疫缀合物的纯化规程的概述，和(B)纯化的Fab-IFN a 2_Fab免疫缀合物的SDS-PAGE (还原性、非还原性)。图47呈现了测试IFN- α诱导的对(A) Jurkat T细胞和(B) A549肿瘤细胞的增殖抑制比较IFN-α (Roferon A, Roche)和具有L19 (纤连蛋白胞外域-B结合剂)作为Fab的纯化的Fab-IFNa 2-Fab免疫缀合物的效果的测定法的结果。图48显示了(A)来自纯化MCSP靶向性基于MHLG的Fab_IL2_Fab的洗脱概况和 (B)来自通过 SDS-PAGE (NuPAGE Novex Bis-Tris 迷你凝胶，hvitrogen，MOPS 运行缓冲液， 还原性和非还原性)对相同Fab-IL2-Fab的分析表征的结果。图49显示了(A)来自纯化MCSP靶向性基于MHLGl的Fab_IL2_Fab的洗脱概况和 (B)来自通过 SDS-PAGE (NuPAGE Novex Bis-Tris 迷你凝胶，hvitrogen，MOPS 运行缓冲液， 还原性和非还原性)对相同Fab-IL2-Fab的分析表征的结果。图50呈现了测试IL-2诱导的IFN- γ释放，比较具有4G8 (FAP结合剂)作为Fab 的纯化的Fab-IL2-Fab免疫缀合物与具有MHLG KV9 (MCSP结合剂)作为Fab的纯化的 Fab-IL2-Fab免疫缀合物的效果，使用IL-2饥饿的NK92细胞的测定法的结果。图51呈现了测试IL-2诱导的IFN- γ释放，比较具有4G8 (FAP结合剂)作为Fab 的纯化的Fab-IL2-Fab免疫缀合物与具有MHLGl KV9 (MCSP结合剂)作为Fab的纯化的 Fab-IL12-Fab免疫缀合物的效果，使用IL-2饥饿的NK92细胞的测定法的结果。图52显示了 MCSP靴向性MHLGl KV9 Fab_IL2_Fab免疫缀合物对Colo38细胞的结合，如通过流式细胞术测定的。显示了单独的二抗或仅细胞作为阴性对照。图 53 呈现了(A)具有 2B10 (TNC A2 结合剂)作为 Fab 的 2B10 Fab_IL2_Fab 免疫缀合物的纯化规程的概述，和(B)纯化的2B10 Fab-IL2-Fab免疫缀合物的SDS-PAGE (还原性，非还原性)。发明详述
定义除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语一般与本领域普通技术人员的通常理解具有相同的意义。一般地，本文中所使用的命名和下文所描述的细胞培养、 分子遗传学、核酸化学和杂交中的实验室规程是本领域中公知且通常采用的。标准技术和规程一般依照遍及本文件提供的本领域常规方法和各种一般参考文献(一般见Sambrook 等 Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 第 2 版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，N. Y.，通过提及而将其收入本文)实施。如本文中所使用的，术语“免疫缀合物”指包含至少一个效应器模块和至少一个抗原结合模块的多肽分子。在一个实施方案中，免疫缀合物包含至少一个单链效应器模块和至少两个抗原结合模块。抗原结合分子可以通过多种相互作用并以多种构象与效应器模块连接，如本文中所描述的。如本文中所使用的，术语“效应器模块”指例如经由信号转导或其它细胞途径影响细胞活性的多肽，例如蛋白质或糖蛋白。因而，本发明的效应器模块可以与受体介导的信号传导关联，所述受体介导的信号传导自细胞膜外部转送信号以调控携带一种或多种效应器模块受体的细胞中的应答。在一个实施方案中，效应器模块可以引发携带一种或多种效应器模块受体的细胞中的细胞毒性应答。在另一个实施方案中，效应器模块可以引发携带一种或多种效应器模块受体的细胞中的增殖应答。在另一个实施方案中，效应器模块可以引发携带效应器模块受体的细胞中的分化。在另一个实施方案中，效应器模块可以改变携带效应器模块受体的细胞中的内源细胞蛋白质的表达(即，上调或下调)。效应器模块的非限制性例子包括细胞因子、生长因子、激素、酶、底物和辅因子。效应器模块可以以多种结构与抗原结合模块结合以形成免疫缀合物。如本文中所使用的，术语“细胞因子”指介导和/或调节生物学或细胞功能或过程(例如，免疫、炎症和造血)的分子。如本文中所使用的，术语“细胞因子”包括“淋巴因子”、“趋化因子”、“单核因子”和“白介素”。有用的细胞因子的例子包括但不限于GM-CSF、 IL-I α、IL-I β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN- α、IFN- β、 IFN- γ、MIP-I α、MIP-I β、TGF- β、TNF- α 禾口 TNF- β。如本文中所使用的，术语“单链”指包含通过肽键线性连接的氨基酸单体的分子。 在一个实施方案中，效应器模块是单链效应器模块。单链效应器模块的非限制性例子包括细胞因子、生长因子、激素、酶、底物和辅因子。在效应器模块是细胞因子并且感兴趣的细胞因子在自然界中通常以多聚体找到时，多聚体细胞因子的每个亚基由效应器模块的单链序贯编码。因而，有用的单链效应器模块的非限制性例子包括GM-CSF、IL-Ia、IL-I β、 IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β,IFN-y,MIP-I α、 MIP-I β、TGF- β、TNF- α 禾口 TNF- β。如本文中所使用的，术语“对照效应器模块”指未缀合的效应器模块。例如，在比较本发明的IL-2免疫缀合物与对照效应器模块时，对照效应器模块是游离的、未缀合的 IL-2。同样地，例如在比较本发明的IL-12免疫缀合物与对照效应器模块时，对照效应器模块是游离的、未缀合的IL_12(例如以异二聚体蛋白质存在，其中ρ40和ρ35亚基仅共享二硫键))。如本文中所使用的，术语“效应器模块受体”指能够特异性结合效应器模块的多肽分子。例如，在IL-2是效应器模块的情况中，结合IL-2(例如，包含IL-2的免疫缀合物) 的效应器模块受体是IL-2受体。相似地，例如在IL-12是免疫缀合物的效应器模块的情况中，效应器模块受体是IL-12受体。在效应器模块特异性结合超过一种受体的情况中，特异性结合效应器模块的所有受体是针对所述效应器模块的“效应器模块受体”。如本文中所使用的，术语“抗原结合模块”指特异性结合抗原决定簇的多肽分子。 在一个实施方案中，抗原结合模块能够将其附着的实体(例如，效应器模块或第二抗原结合模块)引导至靶部位，例如携带抗原决定簇的肿瘤细胞或肿瘤基质的特定类型。抗原结合模块包括抗体及其片段，如本文中进一步限定的。“特异性结合”意指结合对于抗原而言是选择性的，并且可以与不想要的或非特异性相互作用区别。在一个实施方案中，免疫缀合物包含至少一个，通常两个或更多个具有恒定区的抗原结合模块，如本文中进一步限定的且在本领域中已知的。有用的重链恒定区包括5种同种型之任一 α、δ、ε、Y、或μ。有用的轻链恒定区包括2种同种型之任一 κ和λ。如本文中所使用的，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”是同义的，并且指多肽大分子上与抗原结合模块结合，形成抗原结合模块-抗原复合物的位点(例如，氨基酸的连续区段或由不连续的氨基酸的不同区域构成的构象结构)。如本文中所使用的，术语“对照抗原结合模块”指在其会存在时没有其它抗原结合模块和效应器模块的抗原结合模块。例如，在比较本发明的Fab-IL2-Fab免疫缀合物与对照抗原结合模块时，对照抗原结合模块是游离的Fab，其中Fab-IL2-Fab免疫缀合物和游离的Fab分子都能特异性结合同一抗原决定簇。如本文中所使用的，使用就抗原结合模块、效应器模块等而言的术语“第一”和“第二”以在存在超过一个每种类型的模块时方便区别。使用这些术语并不意图赋予免疫缀合物的特定次序或取向，除非明确如此规定。在本领域内使用和/或接受的术语有两个或更多个定义的情况中，如本文中所使用的，术语的定义意图包括所有此类意义，除非明确相反地规定。一个具体的例子是使用术语“互补决定区”(“CDR”)来描述重和轻多肽两者的可变区内找到的非连续抗原结合位点。此特定的区域已经由Kabat等,U. S. D印t. of Health and Human Services,"Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) R ^ Chothia φ, J. Mol. Biol. 196 901-917(1987)(通过提及而将它们收入本文)描述，其中该定义包括在彼此比较时氨基酸残基的交叠或子集。然而，任一个定义指抗体或其变体的CDR的应用意图在该术语的范围内，如本文中定义并使用的。涵盖如由上文所引用的每篇参考文献定义的CDR的合适的氨基酸残基在下文在表I中列出作为比较。涵盖特定CDR的精确残基数目会随CDR的序列和大小而有所变化。鉴于抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基构成特定的CDR。表1:CDR 定义
1.一种免疫缀合物，其包含(a)至少第一单链效应器模块；和(b)第一和第二抗原结合模块，其独立选自下组Fv和Fab，其中所述第一效应器模块与所述第一抗原结合模块共享氨基或羧基端肽键；且其中所述第二抗原结合模块与i)所述第一效应器模块或ii)所述第一抗原结合模块共享氨基或羧基端肽键。
2.权利要求1的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物基本上由通过一个或多个接头序列连接的第一效应器模块和第一和第二抗原结合模块组成。
3.权利要求1或2的免疫缀合物，其中所述第一和第二抗原结合模块之每个是Fab分子。
4.权利要求3的免疫缀合物，其中所述第一Fab分子在其重或轻链羧基端氨基酸处与所述第二 Fab分子的重或轻链的氨基端氨基酸连接。
5.权利要求4的免疫缀合物，其中所述第二Fab分子在其重或轻链羧基端氨基酸处与所述效应器模块的氨基端氨基酸连接。
6.权利要求4的免疫缀合物，其中所述效应器模块在其羧基端氨基酸处与所述第一 Fab分子的氨基端氨基酸连接。
7.权利要求3的免疫缀合物，其中所述第一Fab分子在其重或轻链羧基端与所述效应器模块的氨基端氨基酸连接。
8.权利要求7的免疫缀合物，其中所述效应器模块在其羧基端氨基酸处与所述第二 Fab分子的重或轻链的末端氨基酸连接。
9.一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含在其氨基端氨基酸处与一个或多个scFv分子连接的第一单链效应器模块，且其中所述第一单链效应器模块在其羧基端氨基酸处与一个或多个scFv分子连接。
10.一种免疫缀合物，其包含a)至少第一单链效应器模块；和b)第一和第二抗原结合模块，其中每个所述抗原结合模块包含在其羧基端氨基酸处与包含免疫球蛋白恒定域的恒定区连接的scFv分子，所述免疫球蛋白恒定域独立选自下组 IgG CHl、IgG Ck 和 IgE CH4 ；其中所述第一抗原结合模块在其恒定区羧基端氨基酸处与所述第一效应器模块的氨基端氨基酸连接；且其中所述第一和第二抗原结合模块经由至少一个二硫键共价连接。
11.权利要求10的免疫缀合物，其中每个所述抗原结合模块包含在其羧基端氨基酸处与包含IgG CHl域的恒定区连接的scFv分子。
12.权利要求10的免疫缀合物，其中每个所述抗原结合模块包含在其羧基端氨基酸处与包含IgE CH4域的恒定区连接的scFv分子。
13.权利要求10的免疫缀合物，其中每个所述抗原结合模块包含在其羧基端氨基酸处与包含IgG Ck域的恒定区连接的scFv分子。
14.权利要求10的免疫缀合物，其中所述第一抗原结合模块包含在其羧基端氨基酸处与包含IgG CHl域的恒定区连接的scFv分子，且其中所述第二抗原结合模块包含在其羧基端氨基酸处与包含IgG Ck域的恒定区连接的scFv分子。
15.一种免疫缀合物，其包含a)至少第一单链效应器模块；和b)第一和第二抗原结合模块，其中每个所述抗原结合模块包含在其羧基端氨基酸处与 IgG CH3域连接的scFv分子；其中所述第一抗原结合模块在其羧基端氨基酸处与所述第一效应器模块的氨基端氨基酸连接；且其中所述第一和第二抗原结合模块经由至少一个二硫键共价连接。
16.权利要求10-15中任一项的免疫缀合物，其中所述第一抗原结合模块的恒定区经由至少一个二硫键与所述第二抗原结合模块的恒定区共价连接。
17.权利要求16的免疫缀合物，其中所述第一抗原结合模块的免疫球蛋白域经由二硫键与所述第二抗原结合模块的免疫球蛋白域共价连接。
18.权利要求16的免疫缀合物，其中至少一个二硫键位于所述第一和第二抗原结合模块的免疫球蛋白域的羧基端。
19.权利要求16的免疫缀合物，其中至少一个二硫键位于所述第一和第二抗原结合模块的免疫球蛋白域的氨基端。
20.权利要求19的免疫缀合物，其中至少两个二硫键位于所述第一和第二抗原结合模块的免疫球蛋白域的氨基端。
21.权利要求10的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物进一步包含第二效应器模块，且其中所述第二抗原结合模块在其恒定区羧基端氨基酸处与所述第二效应器模块的氨基端氨基酸连接。
22.一种免疫缀合物，其包含a)第一和第二单链效应器模块；和b)第一和第二抗原结合模块，其中每个所述抗原结合模块包含在其重或轻链羧基端氨基酸处与IgGl CH3域连接的Fab分子；其中每个所述IgGl CH3域在其羧基端氨基酸处与所述效应器模块之一的氨基端氨基酸连接；且其中所述第一和第二抗原结合模块经由至少一个二硫键共价连接。
23.权利要求22的免疫缀合物，其中所述IgGlCH3域通过单一二硫键连接。
24.权利要求22或权利要求23的免疫缀合物，其中至少一个二硫键位于所述第一和第二抗原结合模块的所述IgGl CH3域的羧基端。
25.权利要求22或权利要求23的免疫缀合物，其中至少一个二硫键位于所述第一和第二抗原结合模块的所述IgGl CH3域的氨基端。
26.权利要求25的免疫缀合物，其中至少两个二硫键位于所述第一和第二抗原结合模块的所述IgGl CH3域的氨基端。
27.权利要求116中任一项的免疫缀合物，其中蛋白水解切割位点位于所述抗原结合模块和所述效应器模块间。
28.权利要求116中任一项的免疫缀合物，其中所述第一和第二抗原结合模块的可变区对同一抗原是特异性的。
29.权利要求116中任一项的免疫缀合物，其中所述第一和第二抗原结合模块的可变区对不同抗原是特异性的。
30.权利要求观的免疫缀合物，其中所述第一和第二抗原结合模块对纤连蛋白的额外域B(EDB)是特异性的。
31.权利要求四的免疫缀合物，其中所述第一或所述第二抗原结合模块对纤连蛋白的额外域B(EDB)是特异性的。
32.权利要求30或权利要求31的免疫缀合物，其中对EDB特异性的所述一个或两个抗原结合模块与单克隆抗体L19竞争对EDB表位的结合。
33.权利要求30或权利要求32的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含多肽序列SEQ ID NO :95。
34.权利要求30或权利要求32的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由与SEQID NO 108具有至少80%同一性的多核苷酸序列编码的多肽序列。
35.权利要求34的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQID NO 108编码的多肽序列。
36.权利要求30或权利要求32的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含多肽序列SEQ ID NO :104ο
37.权利要求30或权利要求32的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由与SEQID NO 117具有至少80%同一性的多核苷酸序列编码的多肽序列。
38.权利要求37的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQID NO 117编码的多肽序列。
39.权利要求30或权利要求32的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含多肽序列SEQ ID NO :105。
40.权利要求30或权利要求32的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由与SEQID NO 118具有至少80%同一性的多核苷酸序列编码的多肽序列。
41.权利要求40的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQID NO 118编码的多肽序列。
42.权利要求30或权利要求32的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含多肽序列SEQ ID NO :106。
43.权利要求30或权利要求32的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由与SEQID NO 119具有至少80%同一性的多核苷酸序列编码的多肽序列。
44.权利要求43的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含由多核苷酸序列SEQID NO 119编码的多肽序列。
45.权利要求30或权利要求32的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含多肽序列