专利名称：白蛋白-淀粉样肽缀合物及其用途的制作方法淀粉样疾病或淀粉样变性包括许多具有各种外在症状的疾病。这些疾病的共同点是存在蛋白质原纤维异常细胞外沉积，蛋白质原纤维也称为“淀粉样原纤维”，“淀粉样蛋白沉积”或“淀粉样蛋白斑”，其直径通常约IO-IOOnm并且局部集中于特定的器官或组织区。这种斑块主要由自然生成的可溶性蛋白或肽组成。这些不溶性的沉积主要是由直径约 10-15nm的原纤维横向聚集而成。尽管他们的发生多样化，但是所有的淀粉样蛋白沉积都有着共同的形态学特征，用特定的染料染色(例如硫磺素T、刚果红)，染色后在偏振光下出现特有的红绿双折射。淀粉样相关疾病的特征在于存在于沉积中的蛋白质类型。例如，神经退行性疾病如羊瘙痒病、牛海绵状脑炎、克雅氏病等等，其特征在于中枢神经系统中的朊蛋白(称为 AScr或ft~P-27)抗蛋白酶的形成出现和聚集。同样地，另一种神经退行性疾病阿尔茨海默氏病，其特征在于由淀粉样蛋白斑块和神经原原纤维缠结的沉积。在这种情况下，斑块和血管淀粉样蛋白由原纤维状淀粉样β蛋白沉积而成。其他疾病，如成人发病型糖尿病(11型糖尿病)的特征在于淀粉样蛋白在胰腺中的局部积累。每个淀粉样蛋白都有能力折叠成折叠并且形成不溶性原纤维，其在细胞内或细胞外沉积。虽然氨基酸序列不同，但每个淀粉样蛋白具有形成原纤维并与其他元素(如蛋白聚糖、淀粉样蛋白P以及补体成分)结合的相同的属性。此外，每个淀粉样蛋白都有氨基酸序列，其尽管不同，但可催化β-折叠细胞的形成。例如，淀粉样β原纤维与阿尔茨海默氏症患者的神经细胞死亡和小胶质细胞增生相关。在体外测试时，已经证明β淀粉样肽能够引发小胶质细胞(脑巨噬细胞)的激活过程，这可以解释在阿尔茨海默氏症患者的大脑中发现存在小胶质细胞增生和脑部炎症。在II型糖尿病患者中发现的另一种类型的淀粉样变性中，淀粉源蛋白IAPP已经显示在体外诱导β胰岛细胞毒性。因此，在II型糖尿病患者的胰腺中出现的IAPP原纤维可能导致了 β胰岛细胞(朗格汉斯)的缺少和器官功能障碍。最突出的淀粉样疾病之一是阿尔茨海默氏症，其是一种进行性神经退行性疾病， 该疾病影响西方世界人口总数的约0.5% 1%。阿尔茨海默氏症的特征是在大脑中的大量淀粉样蛋白斑沉积。这种沉积被认为是引起疾病的病理，大多数防止阿尔茨海默氏症的方法其目的都是减少，消除或阻止淀粉样蛋白斑块的形成。淀粉样蛋白斑的主要成分是淀粉样β肽(Αβ)，一个40-42个氨基酸的蛋白质，通过淀粉样前体蛋白(APP)剪切产生。专利申请US20070172496公开了这样的缀合物，其含有A β (33-42)肽，由单克隆抗体和白蛋白识别的肽以及所谓的配体呈递的聚合物oLPA，该单克隆抗体和白蛋白用来在 ELISA检测中捕获抗原，以便确定样品中抗-Αβ抗体的存在，所述样品来自已经接种了复合物的患者，这种复合物由不同的来自Αβ (1-42)肽的多肽组成。因此，在本领域中，需要额外的免疫源性组合物来减少淀粉样蛋白沉积的数量，该免疫原性组合物能够诱导有效的和持续的血浆中的淀粉样蛋白的水平下降。发明简述第一方面，本发明涉及一种用于药物的包含源自Αβ的C端区域(1-42)的肽和白蛋白的缀合物。另一方面，本发明涉及一种用于药物的组合物，所述组合物包含包括源自 Αβ (1-42)的C端区域的肽和白蛋白以及佐剂组成的缀合物。另一方面，本发明涉及包括至少一种源自Αβ (1-42)的C端区域的免疫原性肽和白蛋白的缀合物或涉及一种组合物，其包含至少一种源自Αβ (1-4幻(端区域的免疫原性肽、白蛋白的和佐剂，用于治疗或预防与淀粉样蛋白沉积有关的疾病。图1是Αβ肽(底部的箭头)的免疫注射时间表，在线下标示出了免疫接种的次数，采血(顶部的箭头)，以周(w)为单位来标示出了每个样品采集相应的时间点，CFS样品的采集是在第0周和第13周(双箭头)。(A)表和(B)表分别是A β (Χ-42)肽和A β (Χ-40) 肽免疫注射时间表。在(A)表里，左图框代表所有的动物都遵循的时间表，右边的图框代表仅影响C组和D组的额外干预措施。图2 (A-C)。血浆抗A β抗体滴度的演变。Α)血浆样品的抗A β抗体滴度，表达为等值的ng/μ 1的单克隆抗体6Ε10。B)血浆样品的抗A β抗体滴度，通过他们的EC50来表示。D)血浆样品的抗Αβ抗体滴度，通过最大的血浆稀释度的倒数来表示，其中吸光度比空白孔的平均吸光度高出三倍。在横轴上表示不同的时间点(以周为单位)。每条线代表图例中的一只动物。各组动物接受的制剂都是合成肽-蓝载体加水化凝胶HPA(A)合成肽-蓝载体加Abisco-300 (B)；合成肽-BSA加水化凝胶HPA (C)和合成肽-BSA加Abisco-300 (D)。 较短的连续线条对应于的非应答动物(A和B组)，其中在第十三周停止治疗。C组动物由折线和相应的个别符号表示。D组由虚线和相应的个别符号表示。图3(A_B)。血浆Αβ肽浓度的演变。Α)代表在不同时间点的血浆A β (1-42)肽浓度的演变。B)代表在不同时间点的血浆Αβ (1-40)肽浓度的演变。横轴Y轴交叉于 3. 125pg/ml。为了使图示清晰，低于3. 125的值已表示为_5pg/ml。在横轴上表示着不同的时间点(以周为单位)。每条线代表图例中的一只动物。4组(A、B、C和D)动物接受不同的疫苗制剂。较短的连续线条对应的非应答动物(组A和B)在第十三周停止处理。C组动物由折线和相应的个别符号表示。D组由虚线和相应的个别符号表示。图4。各实验组的血浆抗体滴度与免疫前的状态肽浓度的变化比率的演变。横轴代表时间点(以周为单位)。折线代表不同时间点Αβ (1-42)肽血浆浓度与在免疫前的状态下(第0周)的比率的演变。虚线代表不同时间点Αβ (1-40)肽血浆浓度的与在免疫前的状态下(第0周)的比率的演变。连续线表示不同时间点血浆抗Αβ的抗体滴度与在免疫前的状态(第0周)的比率的演变。对于每一个比率来说，纵轴的值代表组中的三只动物的总和。为了使图示清晰，血浆抗Αβ抗体滴度比率的值已经除以了 20。图5。血浆抗Αβ (33-40)抗体滴度的演变。Α)血浆样品的抗A β抗体滴定度表达为等值的ng/μ 1的抗Ai340(SAR 22)抗体。B)血浆样品的抗Αβ抗体滴度用他们的 EC50来表示。在横轴上表示着不同的时间点(以周为单位)。每条线代表图例中的一只动物(Α1-Α3用黑色表示，Β1-Β3用白色表示)。两组(组A和B)接受不同的疫苗制剂。图6是一个图表，示出了与对照组相比，在接种疫苗的两组中，可溶性或不溶性形式的肽浓度。Vacc. 1 对应于 A β (X-42)+BSA+Th2-型佐剂，Vacc. 2 对应于 A β (X-42) +BSA+ 混合的Thl/Th2型佐剂。栏(1)对应于Αβ (1-40)可溶性形式；(2)对应于Αβ (1-42)可溶性形式；(3)对应于A β (1-40)不溶性形式；(4)对应于A β (1-42)不溶性形式。图7是一个图表，示出了与对照组相比，接种疫苗组的可溶性形式的肽浓度。(A) 对应于可溶性A β (1-40)肽；(B)对应于可溶性A β (1-42)肽。而(1)标示小脑样本；(2) 额侧；(3)内鼻和(4)颞脑区。发明详述本发明的缀合物在医学中的用途本发明的作者发现，令人惊讶的是，施用一种包含源自淀粉样β蛋白(1-42) [A(1-42)]C端区域的肽和白蛋白的缀合物，导致存在所述肽的抗体并降低了蛋白 Aβ (1-40)和Αβ (1-42)的血清水平，Aβ (1-40)和Αβ (1-42)是阿尔茨海默氏病的淀粉样蛋白斑的主要成分。这些结果打开了一个新的治疗窗，来治疗、预防和/或缓解与淀粉样蛋白沉积相关的疾病。因此，一方面，本发明涉及一种用于药物的源自Αβ (1-42) C端区域的免疫原性肽和白蛋白的缀合物。来自Ag (1-42)C端区域的免疫原性肽此处使用的术语“免疫原性肽”指的是一种包括等位基因特异性的基序、表位或其他序列的肽，这样该多肽或片段将结合MHC分子并诱导细胞毒性T淋巴细胞(“CTL”)反应，和/或B细胞反应(例如，抗体的产生)，和/或辅助性T淋巴细胞反应，和/或迟发型超敏反应(DTH)，对抗免疫原性肽源自的抗原，S卩β淀粉样蛋白肽。在本发明的实施例中示出了确定一个给定的肽是否具有免疫原性的合适的方法。这些方法都是基于在动物体施用所述肽后，所述免疫原性肽能够产生抗淀粉样β蛋白抗体的能力而言的。此处使用的术语“淀粉样β肽”与Αβ、淀粉样β蛋白、“Αβ ”、“βΑΡ”、“Αβ肽” 交替使用的，是指一个肽家族，其是在阿尔茨海默氏病(AD)、唐氏综合症、荷兰型(HCHWAD) 遗传性淀粉样变性脑出血患者大脑中发现的老年斑和血管淀粉样蛋白沉积(淀粉样血管病)的主要化学成分。不论以何种形式，淀粉样β肽是淀粉样β蛋白前体蛋白(APP)的一个片段，其包括一可变数目的氨基酸，典型地39-43个氨基酸。此处使用的“Α β (1-42)” 指的是一个42个氨基酸的肽，对应于APP的672至713位氨基酸，其由β分泌酶和、分泌酶连续蛋白水解裂解淀粉样前体蛋白产生。淀粉样β肽通常表示为"A β (x-y)“，其中χ代表淀粉样β肽的氨基末端的氨基酸数量而y代表羧基末端的氨基酸数量。例如Αβ (1-40)是一种淀粉样β肽，其氨基末端从氨基酸1开始，羧基末端终止于氨基酸40，其序列定为序列号1。在本发明中，“源自Αβ (1-42) C端区域的肽”意味着具有2至40个氨基酸残基的多肽，包含部分或全部的A β (1-42)的C端区域。该术语还包括与A β (1-42) C端区域基本上相似的区域(如结构变异)的肽。术语“基本上相似”指的是两个肽序列，最优比对时，具有至少50%的序列同源性， 优选至少有60 %的序列同源性，更优选至少有70 %的序列同源性，更优选至少有80 %的序列同源性，更优选至少有90%的序列同源性，更优选至少有95%或更多的序列同源性(例如，99%的序列同源性)。优选地，残基的位置，其不同，通过保守的氨基酸替代而不同。保守的氨基酸替代是指具有相似侧链的残基的互换性。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；脂肪族羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；含酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和侧链含硫的氨基酸是半胱氨酸和蛋氨酸。不相同的残基位置也可能是由肽类似物组成，包括非天然氨基酸或该氨基酸的衍生物。肽类似物通常与天然发生的肽通常靠保守替代，在一个、两个或几个位置不同。一些类似物还包括在一个，两个或几个位置的非天然氨基酸或修饰的N端或C端氨基酸。非天然氨基酸的例子包括但不限于D氨基酸、α, α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸、4-羟基脯氨酸、y-羧基谷氨酸盐、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε _Ν_乙酰基赖氨酸、0-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、ω-N-甲基精氨酸以及异天冬氨酸。在本发明的缀合物的特殊的实施例中，源自Αβ (1-42)的C端区域的肽选自 Aβ (35-42)(序列号:2)，Αβ (33-42)(序列号:3)y Αβ (33-40)(序列号4)。此处使用的“Α β (35-42) ”涉及与A β (1-42)最后的8个氨基酸相对应的8个氨基酸。此处使用的“Α β (33-42) ”涉及与A β (1-42)最后的10个氨基酸相对应的10个氨基酸。此处使用的“Α β (33-40) ”涉及与A β (1-42)从33至40的氨基酸相对应的8个氨基酸。源自Αβ (1-4幻(端区域的肽包括肽接头组，可由固相或液相多肽化学标准方法合成。固相技术概要可在 Mewart 和 Young(1963) Solid Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co. (San Francisco), and Meienhofer(1973)Hormonal Proteins and Peptides, Academic Press (New York)中找至 lj。经典溶液合成可以参考 Schroder and Lupke, The Peptides, Vol. 1, Academic Press(New York)。—般来说，这些方法包括给不断增长的肽链连续添加一个或多个氨基酸或适当的保护氨基酸。通常情况下，第一个氨基酸的氨基或是羧基会被适当的保护基所保护。保护氨基酸则无论是连接到一个惰性固体支持或是利用在溶液中按顺序加入下一个氨基酸中， 在适合形成酰胺连接的条件下使互补(氨基或羧基)基团得到适当的保护。然后保护基会从这个新添加的氨基酸残基中移除，并添加下一个氨基酸(适当的保护)等。在所需的氨基酸已经以正确的顺序连接后，任何剩余的保护基(任何固体支持)都被按顺序移除或同时给予最终的肽。通过简单的修饰这个一般程序，可以给生长链一次添加一个以上的氨基酸。例如，通过耦合(在非外消旋手性中心的条件下)被保护的三肽与经过适当保护的二肽形成后，脱保护后形成五肽。在优选的实施方案中，半胱氨酸残基被添加到所述免疫原性肽氨基N端，以便促进利用能够与半胱氨酸的巯基反应的双功能试剂使所述肽与载体分子6華禹合。白蛋白如上所述，本发明的一方面涉及一种用于药物的缀合物，其由含有源自Αβ (1-42) 的C端区域的肽和白蛋白组成。此处使用的“白蛋白”是指血浆中最丰富的蛋白质，根据物种的起源不同，其单体形式，具有大约65至67千道尔顿的分子量。术语“白蛋白”可与“血清白蛋白”交替使用， 并不旨在限定与本发明的修饰的肽形成缀合物的白蛋白的来源。因此，此处使用的术语“白蛋白”可以是指从天然来源如血液或浆膜中纯化的白蛋白，也可以是指化学合成或重组产生的白蛋白。在不同的实施方案中，白蛋白变体或天然的白蛋白衍生物能够用于形成本发明的缀合物。在一些实施方案中，白蛋白是哺乳动物白蛋白，或其变体或衍生物。可用的哺乳动物白蛋白的例子包括但不限于人、牛、绵羊、山羊、兔、猫、犬、猪、灵长类动物或是啮齿动物白蛋白。在优选的实施方案中，哺乳动物白蛋白是人白蛋白。在一个实施方案中，人白蛋白是从血液或浆膜纯化而来的。例如，白蛋白可以从个人或实验动物的血清或血浆样品纯化而来，更多使用的是牛白蛋白，但它也可以从来自其他动物(鸡、猪、兔等)的血清中提取，这种提取可以使用任何标准方法，如通过Cohn方法 (Cohn EJ 等，J Am Chem Soc 1946 ；68 :459-75)或 Kistler 和 Nitschmann 方法(Kistler P和Nitschmann HS.，Vox Sang 1962 ；7 :414-24)的冷乙醇分溜或通过层析纯化(Bergloff JH.等 In :Curling JM, ed. Separation of Plasma Proteins. Uppsala :Pharmacia,1983 ； 51-8)或冷乙醇分离和层析纯化的组合。白蛋白也可从蛋清(卵清蛋白)中提取。一类不同的白蛋白，贮藏白蛋白，可以从一些植物的种子(如大豆)中提取。在另一实施方案中，白蛋白是重组白蛋白。在特别的实施方案中，白蛋白是重组人体白蛋白(以下简称“rHA”)。在不同的实施方案中，rHA可以在哺乳动物或非哺乳动物的有机体中产生。在一个实施方案中，rHA在非哺乳动物的有机体中产生。可用于产生rHA 的非哺乳动物的生物体的例子包括但不限于，酵母、细菌、植物、真菌和昆虫。在一个实施方案中，rHA产生于整个植物或整个真菌。在另一实施方案中，rHA产生于培养的植物细胞， 培养的真菌细胞，或培养的昆虫细胞。在另一实施方案中，rHA产生于非人类的哺乳动物或非人类的哺乳动物细胞。可使用非人类哺乳动物用于生产rHA的例子，包括但不限于下列中的任何一个牛科、犬科、猪科、啮齿目、兔形目以及灵长目动物(人类除外)。在特别的实施方案中，rHA生产中使用的非人类的哺乳动物选自由牛、狗、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、 家兔、黑猩猩和大猩猩组成的组。在另一实施方案中，rHA生产使用的非人类的哺乳动物细胞包括但不限于牛、犬、猪、绵羊、山羊、啮齿动物、兔或者非人类灵长类动物细胞。与人体血液或浆液纯化的白蛋白相比，利用非人类生物产生的rHA在生产过程中没有人源性产品。 使用这种控制的生产方法，产品更纯，结构异源性更少。以往的研究表明，可溶性rHA与从血液或浆液纯化而来的人白蛋白之间，其生化特性、放射性标记效率和在体外和体内的生物学行为方面都没有显著的差异。见Dodsworth等，1996，Biotechnol. Appl. Biochem. 24 171-176。在特别的实施方案中，白蛋白是商品名RECOMBUMIN(R)(诺维信公司，英国诺丁汉)指定的rHA。RECOMBUMIN(R)是重组人体白蛋白，采用重组酵母技术在体外生产，其中基因修饰的酵母(酿酒酵母)分泌可溶性rHA，而后收获，纯化并配制，作为生物制药辅料或医疗器械的涂层而使用。
可选地，形成了本发明的缀合物的白蛋白、白蛋白的变体或衍生物可以是商业来源的，例如，像RECOMBUMIN(R)(诺维信公司，英国诺丁汉)；PLASBUMIN人体白蛋白(R) (Talecris生物疗法，北卡罗来纳州研究三角园)；ALBAGEN(R)(新世纪制药，汉茨维尔， AL)；人体白蛋白(皮质-生化，圣莱安德罗，加利福尼亚州)，人血清白蛋白，ZLB Behring 公司(普鲁士国王，宾夕法尼亚州)，或ALBREC(R) (Mistubishi制药公司，日本)。在本发明中，“白蛋白”是指任何具有水溶性的蛋白质，其中度溶于浓盐溶液，并经历热凝聚(蛋白质变性)。其具有约65，000的分子量，由不同数量的氨基酸组成，这些氨基酸为609个氨基酸(在大多数物种中，包括人白蛋白)到615个氨基酸(例如鸡白蛋白)。 它们都含有35个半胱氨酸残基，其可用于与免疫原性肽通过二硫键形成缀合物。根据本发明，适合用于获得缀合物的白蛋白包括但不限于人白蛋白(序列号力)或其成熟的部分 (序列号5的25至609位的氨基酸)与牛白蛋白(序列号6)或其成熟的部分(序列号 6的25至607位的氨基酸)。在本发明中使用的白蛋白还包括白蛋白的结构性变体，其来自保守的氨基酸替代，如在上文解释的从A β (1-42) C端区域衍生的肽。在某些实施方案中，本发明的缀合物包括白蛋白的分子变体，例如在WO 2005/058958中所描述的，将其全部内容并入本文中作为参考。重组人血清白蛋白的变体已经可以从新世纪制药(亚拉巴马州汉茨维尔)买到，其名称为Albagen 。根据本发明， 用于形成缀合物的白蛋白，可以采用本领域已知的方法或材料获得。例如白蛋白是可以从商业途径获取到的，例如，诺维信公司(戴维斯，CA;来自酿酒酵母属中的重组人白蛋白)； Cortex-Biochem(加州圣莱昂纳多，Calif 血清白蛋白)，Talecris生物治疗公司(北卡罗莱纳州研究三角园；血清白蛋白)。ZLB Behring公司(普鲁士国王，PA)，或新世纪制药伊勒，阿拉巴马州来自赤壁酵母属(Pichia pastupsilonris)的重组人白蛋白)。白蛋白变体包括人类群体中白蛋白多态性的天然变体。通过各种条件下的电泳分析已经确定了人血清白蛋白的超过30个明显不同的遗传变体。参见例如狗itkamp等，Ann. Hum. Genet. , 36 (4) :381-92(1973) ；Weitkamp, Isr. J. Med. ScL,9(9) :1238-48(1973) ；Fine 等，Biomedicine，25 (8) :291-4(1976) ；Fine 等，Rev. Fr. Transfus. immunohematoL, 25 (2) 149-63. (1982) ；Rochu 等，Rev. Fr. Transfus. Immunohemato 1. 31 (5) :725-33(1988) ；Arai 等，Proc. Natl. Acad. Sd. U. S. A 86(2) :434-8 (1989)，它们的全部内容并入本文作为参考。 在具体的实施方案中，本发明提供与白蛋白的分子变体形成的缀合物。在一些实施方案中，本发明的缀合物包括与白蛋白具有实质性同源性的白蛋白衍生物。例如，缀合物可能由与白蛋白的氨基酸序列的同源性至少达到75%、至少为80%、至少有85 %、比较典型的至少90 %，最典型的至少95 %的白蛋白同源物形成。在某些是实施方案中，白蛋白的同源物包括游离的半胱氨酸。在一些实施方案中，本发明的缀合物包括白蛋白的结构衍生物。白蛋白的结构衍生物可包括具有白蛋白型活性的蛋白质或多肽。例如，白蛋白功能片段。在一些实施方案中，衍生物是白蛋白的抗原决定簇，即，可以通过抗白蛋白抗体识别的多肽的部分。在一些实施方案中，重组白蛋白可以是具有较高的血浆半衰期的任何蛋白质，该蛋白可以通过修饰编码人血清白蛋白的基因而获得。修饰的例子如，但不限于，重组白蛋白可以含有插入或缺失，白蛋白的痕量金属结合区，从而结合痕量金属元素，例如如美国专利号6，787，636 描述的镍和/或铜的减少或清除，其内容整体并入本文作为参考。减少与白蛋白结合的痕量金属，可以有利于减少在用白蛋白组合物处理的受试者的痕量金属过敏反应的可能性。在某些实施方案中，白蛋白衍生物包括任何通过体外修饰白蛋白获得的具有高血浆半衰期的大分子。在一些实施方案中，白蛋白由脂肪酸修饰。在一些实施方案中，白蛋白由金属离子修饰。在一些实施方案中，白蛋白由对白蛋白具有高亲和力的小分子修饰。在一些实施方案中，白蛋白通过糖类修饰，包括但不限于葡萄糖、乳糖、甘露糖和半乳糖。白蛋白的结构衍生物可以采用任何本领域技术人员已知的方法生产，包括但不限于，寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描以及聚合酶链式反应(PCR)突变。定
( Cotter, Biochem J 2371-7(1986), Zoller and Smith, Methods Enzymol 巧4329-50(1987))，盒式诱变，限制选择诱变(Wells et alphal，Gene 34 315-323(1985)) 或其他已知的技术，可以在克隆的白蛋白编码DNA上进行，产生白蛋白变体DNA或序列， 其编码白蛋白的结构衍生物(Ausubel et al phal, Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York(目前的版本)，Sambrook 等，Molecular Cloning, A Laboratory Manual,3d ed, Cold Spping Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(2001)，其内容整体并入本文作为参考。在某些实施方案中，白蛋白衍生物包括任何在体外用血浆半衰期高于天然白蛋白修饰的白蛋白大分子。在一些实施方案中，白蛋白被一个或多个脂肪酸修饰。在一些实施方案中，白蛋白被一个或多个金属离子修饰。在一些实施方案中，白蛋白被一个或多个对白蛋白具有高亲和力的小分子修饰。在一些实施方案中，白蛋白被一个或多个糖类修饰，包括但不限于葡萄糖、乳糖、甘露糖、半乳糖。人血清白蛋白的制备，无论是从血清中获得的或重组产生的，都可以包括非巯基白蛋白(即“封闭”白蛋白)和巯基白蛋白(即“不封闭”白蛋白)的异源混合物。人白蛋白多肽含有35个半胱氨酸残基，其中34个形成17个稳定的二硫键。虽然巯基白蛋白的34 位的半胱氨酸残基包括游离的SH基团，在非巯基白蛋白中相同的残基包括与例如半胱氨酸或谷胱甘肽的混合二硫键，或经历了由金属离子或其他佐剂的氧化，从而使巯基反应活性降低或不反应。典型的是，巯基白蛋白富集的实现是使重组白蛋白与任何具有将氧化白蛋白Cys34转化为还原白蛋白Cys34能力的因子，如二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙酸(TGA)或 β-巯基乙醇(BME)等接触。在本发明的某些实施方案中，重组白蛋白在缀合物反应前可以去糖基化。人们相信，白蛋白的去糖基化，尤其是酵母产生的重组白蛋白，可以产生形成相关缀合物耐受性和稳定性更优的白蛋白。一般来说，白蛋白的去糖基化可以采用本领域技术人员已知的能够还原非酶催化的糖蛋白的任何技术，在任何条件下进行，如Miksik等人(J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl.，1997，699 =311-345)所述。可选地，白蛋白可采用酶催化的方法去糖基化。例如，去糖基化可以通过使用糖类内切酶H或不同糖类内切酶的混合物进行。在另一实施方案中，重组白蛋白可以进一步加工，使缀合物具有更好的特异性，即减少非Cys34缀合物形成的可能性。举例来说，重组白蛋白可以接触化学阻断残基的试剂， 在该残基处，已知人血清白蛋白形成共价佐剂。本领域已知的任何能够阻断除了 Cys34之外的白蛋白的反应点的试剂都可以使用。在一些是实施方案中，试剂阻断了赖氨酸残基。 白蛋白含有可变数目的赖氨酸残基(例如，人白蛋白是60而牛白蛋白是61)，其中25-30 个赖氨酸残基位于白蛋白表面，并可形成缀合物。因此，在一些实施方案中，本领域技术人员已知的阻断白蛋白的任何赖氨酸残基的试剂，也具有形成共价佐剂的潜力，如白蛋白的 Lys71、Lysl99、Lys351、Lys525、Lys541。连接区域源自Αβ (1-42)的C末端区域的肽和白蛋白可直接连接，或可选地，可以通过一个或多个连接基团连接(以下也称为介入分子或间隔部分)。在本发明特殊的实施方案的缀合物中，如果至少一个免疫原性肽和白蛋白通过连接区M连接，那么所述连接区M包含连接到其上的不超过一个免疫原性肽。在本发明的另一特殊实施方案的缀合物中，连接βΜ连接至少一个免疫原性肽和白蛋白，所述连接区域包括半胱氨酸，更优选地该半胱氨酸位于免疫原性肽的N末端。在某些实施方案中，连接基团是生物相容性的聚合物，例如，肽或含有聚合物的烷基或烷氧基。在具体的实施方案中，连接基团具有一个不稳定化学键的肽，该化学键可通过酶剪切或者在特定的化学条件下(例如，在酸性条件下)剪切。在一个实施方案中，修饰的肽包括一个活性基团通过一个或多个连接基团共价结合到该肽上。在某些实施方案中，连接基团包含一个或多个活性基团，典型地一个连接基团。在某些实施方案中，连接基团有1 到100个原子。正如本文所述，连接基团的长度通过连接基团连接的基团之间最短的链的原子数量表示。在某些是实施方案中，连接基团有1到100个原子、1到80个原子、1到60 个原子、1到50个原子、1到40个原子、1到30个原子、1到20个原子、10到20个原子或是5到15个原子。凡是出现超过一个连接基团的，该连接基团可以是相同或不同的连接基团。连接基团可以通过本领域技术人员已知的任何方法或技术连接到源自Αβ (1-42)的C 端区域的肽。在美国专利号6849714中描述了示范的方法或技术，将其内容整体并入本文作为参考。连接基团可以包括一个或多个烷基如甲基、乙基、丙基、丁基等基团，烷氧基、烯基、炔基或被烷基取代的氨基、环烷基、多环芳烃基、芳基、聚芳基、取代的芳基、杂环基和取代的杂环基。在某些实施方案中，连接基团可以选自包括氨基和羧基的连接基团，该连接基团包括但不限于ΑΕΑ,ΑΕΕΑ和OA。在某些实施方案中，连接基团可以是1到100个原子长度的 AEA聚合物。在某些是实施方案中，连接基团可以是1到100个原子长度的AEEA聚合物。 在某些实施方案中，连接基团可以是1到100个原子长度的OA聚合物。连接基团的说明性例子包括甘氨酸、赖氨酸、谷氨酸、异亮氨酸或精氨酸残基、AEA、AEEA或0A(例如，OA 二聚体(-0Α-0Α-)或OA三聚体(0Α-0Α-0Α-)的单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、 七聚体、八聚体、九聚体、十聚体、十一聚体、十二聚体，或其任何组合(例如，任何组合GIyn、 Ly&、0A、AEA 或 AEEA，其中 η = 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 或 12)。在一些实施方案中，连接基团有单一的赖氨酸。该单一的赖氨酸可以被修饰，直接或通过一个或多个连接基团连接到活性基团上。例如，K基团可以通过例如侧链的ε氨基连接到活性基团上，或一个或多个额外的连接基团。这种连接基团的例子，包括单一的赖氨酸，例如序列为(单体)aK(单体)b、K(单体)。和(单体)dK、其中a、b、c和d均为大于或等于一的整数，例如，一、二、三、 四、五、六、七、八、九、十、十一、十二或更多。在一些实施例中，a和b可能是相同的，而在其他的实施例中，a和b是不同的。例如，a可以是3而b可以是4，可以提供具有以下顺序的连接基团，(OA)nK(OA)n, (OA)nK(AEA)n, (G)nK(OA)n, (OA)nK(G)n,其中 η = 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。在活性基团位于两个TMI^s之间接头的情况下，两个TMI^s之间的总长度一般不会超过100个原子。连接基团的连接不认为是两个TMPS之间的接头的一部分。连接基团可以包括上述生物相容聚合物的任意组合。例如，多聚甘氨酸接头可与一个或多个具有任意结构的AEA、AEEA或OA单体相结合。在一个实施方案中，多聚甘氨酸接头在多聚甘氨酸接头中第一个或最后一个甘氨酸的残基N或C末端，连接到一个或多个 AEA、AEEA或OA的单体。可选地在多聚甘氨酸接头的甘氨酸残基之间插入一个或多个AEA、 AEEA或OA单体。在特殊的实施方案中，活性基团(例如MPA、GMBA、NHS、磺酸基_NHS、MBS 或GMBQ，通过一个或多个连接基团来连接肽，其中包括，例如，多聚甘氨酸接头、多聚甘氨酸-赖氨酸的接头、AEEA、AEA或0A，或其任意组合。在某些实施方案中，活性基团通过多个连接基团连接到肽，连接基团通常可独立地选自由包含多聚甘氨酸、多聚赖氨酸、AEA、AEEA 和OA组成的组中。在实施方案中，连接基团(例如单体聚合物单元)的数目可以为1 2、1 3、1 4、1 5、1 6、1 7、1 8、1 9、1 10、1 11、1 12。凡有超过一个连接基团的情况下，连接基团可以是相同或不同的连接基团。例如多聚甘氨酸、多聚赖氨酸、AEA、AEEA和/或OA的任何顺序的任意组合。在一个实施方案中，活性基团(通常是 MPA)通过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个多聚甘氨酸、多聚赖氨酸、AEA、AEEA或OA的连接基团依次排列连接到肽。在另一实施方案中，活性基团(通常MPA)通过1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11或12个多聚甘氨酸、多聚赖氨酸、AEA、AEEA或OA连接基团以分支的结构排列连接到肽。在另一实施方案中，连接基团是肽部分，其能够充当源自于Αβ (1_42)C末端区域的肽和白蛋白之间的铰链区，使得它们彼此独立移动，而且保持各自的立体形状。从这个意义上说，根据本发明的优选的非天然中间氨基酸序列将是铰链区，其特征在于具有允许此移动的结构性的延展性，或是非天然的弹性接头。该弹性接头可以是长度不超过20个氨基酸的弹性连接肽。在更优选的实施方案中，连接肽由2个氨基酸或更多选自包括甘氨酸，丝氨酸，丙氨酸和苏氨酸组成的组中的氨基酸。在本发明优选的实施方案中，所述弹性接头是多聚甘氨酸接头，但不限于多聚甘氨酸、多谷氨酸、多聚异亮氨酸、多聚精氨酸或包括两个或两个以上氨基酸的其他合适的连接基团。在一些例子中，氨基酸连接基团可以包括至少二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二个氨基酸残基，例如甘氨酸或赖氨酸残基。多聚甘氨酸接头可以包含以任意结构插入的一个或多个不同残基(如赖氨酸残基)，例如，在N 或C末端附近，或在甘氨酸残基延伸的中间。在其他实施方案中，多聚甘氨酸接头以任意的结构与AEA、AEEA或OA的一个或多个单体相结合，在一个实施方案中，多聚甘氨酸接头，在多聚甘氨酸接头中第一个或最后一个甘氨酸的残基的N或C末端，连接到一个或多个AEA、 AEEA或OA的单体。可选地，在多聚甘氨酸接头的甘氨酸残基之间插入一个或多个单体的 AEA、AEEA或OA。例如，如果多聚甘氨酸作为接头，多聚甘氨酸可以包括单一的赖氨酸，以提供了一个能够与另一个接头或蛋白质反应的游离的ε氨基。这种包括氨基酸(例如，单一的赖氨酸)的多聚甘氨酸的例子，具有例如(G) aK (G)b、K (G)。、(G)dK的氨基酸序列。其中a、 b、c和d每个是大于或等于1的整数，例如一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二或更多。在一些实施例中，a和b可以是相同的，而在其他的实施例中a和b是不一样的。 例如，a可以是3而b可以是4。在一些实施例中，多聚甘氨酸接头内的单赖氨酸可以本身链接到其他基团，例如，一个连接基团、活性基团或活性基团的残基。例如，赖氨酸残基可以与一个或多个额外的接头连接，例如侧链的ε氨基。接头/间隔物序列可能的例子包括SGGTSGSTSGTGST(序列号7)， AGSSTGSSTGPGSTT(序列号8)或 GGSGGAP(序列号9)和 GGGKGGGG(序列号10)。这些序列被用于结合指定的螺旋到其他蛋白的结构域((Muller，K.M.，Arndt，K.M. and Alber,T.， Meth. Enzymology, 2000, 328 :261-281).。所述接头优选地包括氨基酸序列GGGVEGGG (序列号11)或由氨基酸序列GGGVEGGG(序列号11)组成。连接区域的作用是为源自Αβ (1-42)的C端区域的肽和白蛋白之间提供间隔。因此，这确保了源自Αβ (1-42)的C端的肽的二级结构不会受到白蛋白存在的影响，反之亦然。间隔物优选地具有肽性质。连接肽优选地包括至少2个氨基酸、至少3个氨基酸、至少 5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少30个氨基酸、至少 40个氨基酸、至少50个氨基酸、至少60个氨基酸、至少70个氨基酸、至少80个氨基酸、至少90个氨基酸或约100个氨基酸。此外，接头可以通过共价键结合到源自Αβ (1_42)C端区域的肽和白蛋白的两侧的组合物，优选地间隔物基本上是非免疫原性和/或不包括任何半胱氨酸残基。在类似的方式中，间隔物的三维结构优选地是线性的或实质上线性的。接头可以包括四连接素的53-56残基，其在四连接素中形成了 β折叠，残基57_59 在四连接素形成了转角(Nielsen, B. B.等，FEBS Lett. 412 =388-396,1997) 该片段的序列是GTKVHMK(序列号12)。此接头的优势是当它在天然四连接素中出现时，适合与三聚域与CRD域结合，因此总的来说，它适合连接三聚域到另一个域。此外，由此产生的结构不会有比没有接头的结构具有更多的免疫原性。另外，来自人纤连蛋白链3的子序列可被选择作为接头，相对应的是氨基酸1992 至 2102(SWISSPR0T 编号，登录号(entry) P02751)。子序列 PGTSGQQPSVGQQ (序列号13)对应的氨基酸数2037至2049优选地采用，其中，对应于氨基酸2038至2042的子序列片段 GTSGQ(序列号14)是更优选的。这种结构的优势在于，它不太容易被蛋白酶剪切，不具有非常高的免疫原性，因为纤维连接蛋白在血浆中高浓度存在。可选地，合适的肽接头可以以小鼠IgG3上游铰链区的10个氨基酸残基序列为基础。根据本发明，这种肽(PKPSTPPGSS，序列号1 已被用来产生螺旋(Pack P.和 Pluckthun,A.，1992，Biochemistry 31 :1579-1584) 二聚抗体，且可作为有用的间隔肽。更优选人IgG3上游铰链区的相应的序列。人IgG3序列预计不会在人类中产生免疫原性。在优选的实施方案中，连接肽选自由序列APAETKAEPMT的多肽(序列号16)和GAP序列的肽组成的组中。在特别的实施方案中，连接区不包括以下基团-N(CH2-)2、-NHCH <或-NHCH (CH2-) 2。在特别的实施方案中，本发明的缀合物不具有以下结构


本发明提供了包含白蛋白和源自β淀粉样蛋白肽C端区域的肽的缀合物，以及其在治疗具有淀粉样蛋白沉积特征的疾病尤其是在阿尔茨海默氏病的治疗上的用途。