专利名称：含有重组人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白的药物制剂及其制备的制作方法人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，是ー种来源于单核细胞和纤维组织母细胞的长链多肽糖蛋白，可诱导造血干细胞的增值和分化，促进血液中的中性粒细胞数増加；另外还具有刺激成熟中性粒细胞从骨髓中释放出并激活中性粒细胞的功能。但是，天然或重组的G-CSF由于分子量较小，极易被肾小球过滤，在人体 内的循环半衰期很短，只有2-4小时，每个化疗周期需要每天注射1-2次，持续注射5-7天(Welte K等，Proc Nat Acad Sci USA，82 :1526-1530，1985 ;Frampton JE 等，Drugs，48 :731-760，1994)。延长G-CSF制剂体内半衰期可以减少给药次数。人血清白蛋白(HSA)是血液循环中的ー个非常重要的天然蛋白，在体液循环中可存在20天以上。研究表明将治疗性蛋白基因与人血清白蛋白基因融合所表达的融合蛋白可明显降低体内药物的清除速率，延长生物半衰期。据此，本发明通过基因工程方法将人白蛋白与G-CSF融合表达获得的rHSA/G-CSF，提高G-CSF在体内的半衰期(Wendy Halpern等，PharmRes，19 :1720-1729，2002);该融合蛋白结构中，人血清白蛋白位于N端，C末端可以直接与人粒细胞集落刺激因子的N端相连，也可以通过柔性的连接肽序列使两个蛋白相连。本发明所涉及的rHSA/G-CSF的制备方法有许多文献报道(Pharm Res. 19 1720-1729. 2002 ；Pichia Expression Kit A Manual of Methods for Expressionof RecombinantProteins in Pichia pastoris ；Catalog NO :K1710_01，InvitrogenCorporation. ;G_CSF融合蛋白突变体及其制备与应用(中国专利申请号200910199337. 9)等)，通过将人血清白蛋白的基因与人粒细胞集落刺激因子基因融合在一起，选择合适重组表达方法即可获得相应的融合蛋白。融合后形成的重组人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白克服了传统的人粒细胞集落刺激因子治疗过程中多次给药的缺点；并具有以下几个优点1)延长人粒细胞集落刺激因子在体内的存留时间；2)起最大的治疗作用、减小传统人粒细胞集落刺激因子的潜在副作用或毒性、还可提高疗效。但是，作为蛋白药物，rHSA/G-CSF其稳定性还是无法与常规化学药物相比，其活性在长期贮存时还是会受到多种环境因素的影响。例如对温度和氧高度敏感。由于这些因素的作用，可能发生多种物理或化学变化，例如变性，降解，聚合或氧化等从而影响药物均一性和活性，最終影响药物疗效，并带来副作用。因此，研究出ー种能稳定保存rHSA/G-CSF蛋白，并适合于实际临床使用的药物制剂是极其有意义的。但是，到目前为止，尚未有这方面的研究报道。本发明涉及的就是此方面内容。
本发明的目的就是提供ー种稳定性良好的含重组人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白(以下简称rHSA/G-CSF)的药物制剂。本发明为了提高含有rHSA/G-CSF药剂的稳定性，选择了冻干制品为制剂形式，并进行了深入的研究。从合适的辅料(如糖类，氨基酸及其衍生物、表面活性剂等)和无机盐类中挑选至少ー种加入制剂中，并选择合适的PH，可以有效达到这个目的。在rHSA/G-CSF药剂稳定性研究过程中，选取了外观观察，SDS-PAGE, SEC-HPLC高效液相色谱分析，生物活性检测等作为考察指标，来观察rHSA/G-CSF药剂的变化情況。这些方法均可从《中国药典，2005年版》获得。本发明提供了ー种含rHSA/G-CSF蛋白的药物制剂，为冻干制 剂，每支制剂中包括下列组分rHSA/G-CSF 蛋白l_30mg药学上可接受的水溶性赋形剂IO-SOmg药学上可接受的保护剂5_30mgpH 值调节剂5-50 μ mo I冻干制剂在临用前用I. Oml注射用水溶解。 在rHSA/G-CSF蛋白的药物制剂中添加合适的赋形剂和保护剂，可以显著改善制品的稳定性，同时也可使制剂处于合适的渗透压，方便使用。所述的药学上可接受的赋形剂可选自甘露醇、甘氨酸、PEG、海藻糖、山梨醇、蔗糖、木糖醇、乳糖、葡萄糖和果糖等，可以单独添加，也可以联合使用。优选的为甘露醇，优选的用量为10-80mg/支。所述的药学上可接受的保护剂是可选自氨基酸、糖、金属螯合剂、表面活性剂、白蛋白等。优选的为氨基酸，氨基酸类保护剂可选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、色氨酸、赖氨酸、羟赖氨酸、组氨酸、精氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等以及它们的衍生物。优选的为精氨酸。所述保护剂的使用量是本领域常规的用量，优选的用量为5-30mg/支。所述pH调节剂可以是至少ー种药学上可接受用于调节pH值的常规或已知物质。可以是碱性化合物或缓冲系统。所述的药学上可接受的碱性化学物可以是通常在药学上可接受的用于调节溶液PH值的碱性化合物，如氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸三钠、磷酸三钾等。所述的缓冲系统可以是常用或已知的在药学上可接受的用于调节溶液PH值的缓冲系统，优选的为磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、巴比妥盐、三羟甲基氨基甲烷、硼酸盐、琥珀酸盐等，更优选的为磷酸盐缓冲系统。所述缓冲体系溶液的PH范围优选为6. 0-7. 0，最优的为6. 5。优选的，本发明的含rHSA/G-CSF蛋白的药物制剂，其每支冻干制剂中包括下列组分rHSA/G-CSF 蛋白l-30mg,最优选为 5mg甘露醇10_80mg,最优选30mg 精氨酸5_30mg,最优选IOmg磷酸盐5-50 μ mol,最优选 10 μ mol临用前用I. Oml注射用水溶解。所述精氨酸为L-盐酸精氨酸。进ー步的，前述各冻干制剂用I. Oml注射用水溶解后的渗透压为250-400m0sm，pH为6. 0-7.0，最优的pH为6. 5。 发明所述rHSA/G-CSF蛋白中，人血清白蛋白位于N端，C末端可以直接与人粒细胞集落刺激因子的N端相连，也可以通过柔性的连接肽序列使两个蛋白相连，rHSA/G-CSF蛋白及其制备方法均为现有技术。在本发明药物组合的基础上改变其中组分的含量或加入其它物质，但对提高rHSA/G-CSF稳定性没有显著改变，仍被视为本发明的一部分。本发明的含rHSA/G-CSF蛋白的药物制剂可经过下列方法制备获得I)按配比将rHSA/G-CSF蛋白、药学上可接受的水溶性赋形剂、药学上可接受的保护剂及pH值调节剂与注射用水混匀并调节pH值至6. 0-7. O ；2)冻干制得冻干制剂。所述步骤2)具体为将步骤I配制好的药液除菌过滤分装于适宜大小的西林瓶中待冻干机板层温度预先冷冻到-10°C以下，待冻干西林瓶样品放入冻干箱，在-35°C以下保温2小吋，开始抽真空，真空度低于SOPa后，升板层温度到-15°C，維持真空度小于80Pa，当可见水线消失后开始升温，最后升制品温度到30°C并保持3 5小吋。所述冻干机板层温度预先冷冻到-10°C以下，使待冻干制品进冻干箱后温度迅速降低，形成细小的无定型状态，易于水分的去除和减少对活性大分子结构的破坏。所述升板层温度到_15°C，維持真空度小于80Pa，可确保冻干制品外观饱满，颗粒细腻，同时缩短冻干周期，減少生产能耗。本发明的含rHSA/G-CSF蛋白的药物制剂溶解于注射用水后适用于皮下或静脉等途径给药，通过注射适合剂量的此药物制剂可治疗中性粒细胞減少症。 本发明考察了赋形剂、稳定剂、pH、制备エ艺等因素对rHSA/G-CSF蛋白制品稳定性的影响，筛选出了一个能保证制品在保存与运输过程中性质稳定，便于临床使用而又可以被人体所接受的制剂处方和エ艺。


图I rHSA/G-CSF 于 ρΗ4· 5-8. O 37°C ニ周 SDS-PAGE 检测图
图 2rHSA/G-CSF 于 ρΗ4· 5-8.0 37°C 四周 SDS-PAGE 检测3rHSA/G-CSF 于 ρΗ6· 0-7. O 37°C ニ周 SDS-PAGE 检测4rHSA/G-CSF 于 ρΗ6· 0-7. O 37°C 四周 SDS-PAGE 检测图

达获得。本发明首先研究了 pH对rHSA/G-CSF稳定性的影响。为了考察不同pH条件下制剂的稳定性，按如下条件进行了不同pH对制剂稳定性的影响实验试验1，rHSA/G-CSF蛋白含量为5. Omg，各组中含有不同pH的一定浓度的醋酸盐或磷酸盐缓冲液，PH4. 5到pH8. O,间隔O. 5，共设8个点。于37°C加速考察四周，每隔两周取样分析，检测方法SDS-PAGE，10%分离胶，非还原。试验表明，蛋白在酸性(pH4. 5-pH5. 5)和偏碱性条件(pH7. 5_pH8. O)经4周时间会发生降解或结构改变，而在pH6. 0-pH7. O范围之间，相对较少，结果參见图I和图2。试验2,缩小筛选范围，选用磷酸缓冲液，设置pH如下①pH = 6. O ②pH =6. 2③pH = 6. 4④pH = 6. 5⑤pH = 6. 6⑥pH = 6. 8⑦pH = 7. O,取样和检测方法同试验I。试验表明，在pH6. 0-pH7. O范围内，蛋白降解情况差异不大，优选pH6. 5，结果參见图3和图4。实施例2辅料对稳定性的影响试验本发明筛选了ー些适合于人体应用的辅料如甘露醇、海藻糖、PEG4000、甘油、甘氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和组氨酸等赋形剂和保护剂，研究其对rHSA/G-CSF稳定性的影响。将辅料配制成高浓度的储液，与pH6. 5的磷酸缓冲液高浓度储液混合，然后加入含ρΗ6· 5的磷酸缓冲的高浓度rHSA/G-CSF蛋白溶液，再用lmol/L HCl或lmol/L NaOH调节PH值，以获得一定体积含lOmmol/L pH6. 5的磷酸缓冲液，蛋白浓度为5. 0mg/ml的样品溶液。样品溶液过滤除菌后分装于无菌西林瓶，装量为I. 0ml，半加塞，冻干。将冻干的制品进行外观检查，并用SEC-HPLC分析冻干过程蛋白聚体的形成。结果表明，甘露醇和甘氨酸单独作为赋形剂的制品外观饱满、颗粒细腻、水溶性都好，但经SEC-HPLC检测纯度，发现聚体含量明显增加，且甘氨酸做为辅料表面易结皮；海藻糖做为辅料冻干前后蛋白聚体含量増加不明显，且冻干品颗粒细腻、水溶性好，但外观稍有萎縮；PEG4000做为辅料蛋白的聚体含量増加不明显，但部分产品会结块开裂；组氨酸和精氨酸做为辅料冻干前后蛋白聚体含量増加也不明显，但成型性很差，冻干后制品萎縮；其它如蛋氨酸、苯丙氨酸为辅料的制剂水溶性差。根据上述結果，最終选择了海藻糖、甘露醇、精氨酸和组氨酸4种辅料进行进一歩筛选，并在25°C加速条件下连续观察16周，考察其外观、水溶性，纯度和蛋白活性(效价保存率)。表I.几种辅料不同组合制剂保存于25°C条件下检测结果


本发明公开了一种含有重组人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子融合蛋白的药物制剂及其制备。本发明的含rHSA/G-CSF蛋白的药物制剂，为冻干制剂，每支制剂中包括下列组分rHSA/G-CSF蛋白1-30mg；药学上可接受的水溶性赋形剂10-80mg；药学上可接受的保护剂5-30mg；pH值调节剂5-50μmol。本发明的含rHSA/G-CSF蛋白的药物制剂溶解于注射用水后适用于皮下或静脉等途径给药，通过注射适合剂量的此药物制剂可治疗中性粒细胞减少症。