专利名称：基于人血清白蛋白的用于光动力疗法的纳米粒子载体系统的制作方法基于人血清白蛋白的用于光动力疗法的纳米粒子载体系统发明人克劳斯·兰格尔；马蒂亚斯·瓦克尔；比特·罗德；安格莱特·普鲁斯；沃科尔·阿尔布莱奇特；苏珊娜·格拉菲；阿诺·维厄；哈根·冯布里森；卡林·洛和西尔维婭·瓦格内。受让人拜莱泰克制药市场有限公司I.根据35 USC 119(e)条的优先权本申请要求由Klaus Langer等在2009年12月11日提交的序号为61/285，902的美国临时申请的权益和优先权，所述申请题为“基于人血清白蛋白的用于光动力疗法(PDT)的纳米粒子载体系统(NANOPARTICLE CARRIER SYSTEMS BASED ON HUMAN SERUM ALBUMINFOR PHOTODYNAMIC THERAPY (PDT))”，其通过参考结合于此。 2.发明领域本发明涉及疏水性光敏剂的药物制剂。具体来说，本发明涉及含有疏水性光敏剂的纳米粒子制剂、它们的制备方法、和它们利用静脉内施用在用于破坏不想要的细胞或组织的光动力疗法、更特别是光动力肿瘤疗法中的应用。3.发明公开状态光动力疗法(PDT)是目前正在开发用于各种医疗应用的最有前途的新技术之一，其特别是用于破坏肿瘤的公认疗法。光动力疗法利用光和光敏剂(染料)来达到它预期的医疗效果。大量天然存在和合成的染料已被评估为用于光动力疗法的潜在光敏剂。研究得最广泛的光敏剂类别也许是四吡咯大环化合物。其中，特别测试了卟啉和二氢卟酚的PDT功效。卟啉是具有连接吡咯形成特征性的四吡咯环结构的一碳原子桥的大环化合物。有许多不同类的卟啉衍生物，包括那些含有二氢吡咯单元的卟啉衍生物。二氢卟酚和菌绿素是分别含有一个二氢吡咯单元或两个二氢吡咯单元的卟啉衍生物。二氢卟酚在电磁波谱的红光区和近红外区域具有吸收谱。由于波长较长的光能更深地穿透入组织中，因此，如果采用PDT用于肿瘤治疗时，有可能处理更扩大和更深的肿瘤。二氢卟酚可源自于天然来源或源自于全合成。通过将叶绿素或细菌叶绿素衍生化获得来自天然化合物的二氢卟酚。通过全合成制备二氢卟酚和菌绿素的方法通常使用卟啉，然后转化成二氢卟酚或菌绿素系统。例如可以通过用原位产生的二亚胺还原或通过二羟基化来执行该转化步骤，分别产生二氢或二羟基取代的二氢卟酚或菌绿素。Raymond Bonnett等在他们的专利No. EP 00337601 BI中公开了通过还原相应的卟啉制备光敏剂的方法。公开了替莫卟吩(化学名称(间四羟基苯基-二氢卟酚))一一种二氢卟酚的全合成。在欧洲，替莫卟吩(Foscan )被成功地用作头颈癌PDT治疗的光敏齐Li。类似地，David Dolphin等的专利申请WO 09613504 Al和Jill Maclpine等的专利申请WO 00061584 Al教导了制备具有改良的性质的新型光敏剂的还原方法。卟啉可以被直接用作PDT的光敏剂，或者作为通过让吡咯和醛接受缩合反应合成二氢卟酚的前体。在本领域中，用于该缩合的适当方法早就是已知的。由于光敏剂(PS)的固有特点，PDT用于治疗各类疾病的应用受到限制。所述光敏剂的固有特点包括它们的高成本、在宿主有机体中的长时间滞留、显著的皮肤光毒性、在生理溶液中的低溶解度、以及较低的靶向有效性，所述在生理溶液中的低溶解度降低了它们血管内施用的有用性，由此导致血栓栓塞意外。这些缺点，特别是现有技术中PS的缺点，已导致施用非常高剂量的光敏剂，这大大增加了光敏剂在正常组织中蓄积的可能性，并伴随着影响正常部位的风险。减少成本和降低背景毒性的工作已在进行之中，但与本发明的开发无关。针对改善在生理溶液中的溶解度、皮肤光毒性效应、在宿主有机体中的滞留的工作，以及针对靶向有效性程度较低的工作，在这些领域中，本发明对于PDT治疗各种肿瘤形成、增生、和相关疾病的应用提供了新的和不明显的改善。 成功应用于光动力肿瘤疗法的大多数物质是亲脂性物质，由于所述物质固有的在水中的低溶解度，它们需要以适当的方式进行配制。因此，非常需要基于四吡咯的光敏剂的新制剂，以提高它们在体内的摄取和它们的生物利用度。集中研究了纳米粒子作为亲脂性药物载体(N. P. Preatorius, T. K. Mandal,癌症治疗中的工程纳米粒子(Engineered Nanoparticles in Cancer Therapy), Recent Patentson Drug Delivery & Formulation, 2007,1, 37-51 ；M. N. V. Ravi Kumar,癌症治疗中的工程纳米粒子(Engineered Nanoparticles in Cancer Therapy), J. Pharm. Pharmaceut.Sci.，2000，3，234-258)。欧洲和美国监管当局已批准了抗癌药物紫杉醇基于人血清白蛋白(HSA)的纳米粒子制剂。在PCT公布No. WO 01/21 174 Al中，Anand Burman等公开了紫杉醇抗癌药物及其衍生物和类似物包埋在共聚物胶粒的纳米粒子中的药物制剂的制备方法。通过聚合方法形成所述纳米粒子；但是，大多数基于聚合反应的方法需要使用大量的有机溶剂或不安全的稳定剂如可导致毒副作用的表面活性剂。在现有技术中，纳米粒子被用于包裹/包埋/吸附用于生物医学应用的大分子、其它治疗剂和诊断剂。大多数纳米粒子由聚合物材料制备，并且为了它们的制备，使用了大量有机溶剂和有毒的表面活性剂，而这些需要被完全去除以避免在患者中任何可能的副作用。一些纳米粒子组合物遇到的问题之一是结晶性药物粒子组分的溶解和随后的重结晶。纳米粒子活性剂制剂中的晶体生长和粒子聚集是高度不希望的。在纳米微粒活性剂组合物中存在大晶体可引起不希望的副作用，特别是当制剂为注射剂型时。由粒子聚集和重结晶形成的较大的粒子还可以妨碍血流，导致肺栓塞和死亡。纳米粒子通常是在IOnm至IOOOnm的大小范围内的固体胶态粒子，并用在一些药物递送系统中。纳米粒子由大分子材料组成，活性成分被溶解、包埋、或包裹在所述大分子材料中，和/或活性成分被吸附或附着在所述大分子材料上。已研究了许多不同种类的纳米粒子材料，例如量子点、基于二氧化硅的纳米粒子、光子晶体、脂质体、基于天然和合成来源的不同聚合物的纳米粒子、和基于金属的纳米粒子。纳米粒子在形状和组成两方面是多样化的。作为光敏剂的载体系统，最吸引人的是由生物相容性材料组成的纳米粒子。这种载体系统可以显著改善光动力疗法的治疗方案。具有这种已知的高生物相容性的载体系统是例如人血清白蛋白(HSA)。HSA材料已被成功配制为纳米粒子(参见K. Langer等,在Int.J.Pharm. ，2007，347，109-117 中)。作为水不溶性药理活性剂载体的基于蛋白质的纳米粒子在本领域中已知有一些实例。在美国专利No. US 5，916，596中，Desai等公开了用于以包被有蛋白质的悬浮粒子的形式递送疏水性抗癌药物紫杉醇的组合物和方法。所述专利公开了直径小于200nm大小的基于蛋白质的纳米粒子用于药物递送，并且这些纳米粒子是无菌过滤的。尺寸更小的纳米粒子在储存期间具有更高的聚集。这项现有技术描述了包被有蛋白质的悬浮的药物粒子，所述蛋白质起到稳定剂的作用，但这项专利与本发明无关。用于胃肠外施用的纳米粒子制剂在临床实践中的应用要求能确保根据药典规范所述的制剂的无菌性。此外，对于临床应用来说，希望可以将制剂冷冻干燥并在以后在水 性介质中复溶。由于纳米粒子基质材料的不稳定性以及光敏剂的不稳定性，包含HSA的纳米粒子光敏剂制剂的无菌性是富有挑战的。常规的灭菌方法(高压蒸汽灭菌、使用环氧乙烧、Y射线照射)与本发明的光敏剂制剂不相容(参见K. A. Athanasiou等，Biomaterials,1996，17，93-102 ；C. Volland 等，J. Contr. Rel.，1994，31，293-305)。Eric Allemann等在他们的专利申请WO 03097096 Al中公开了使用含有聚酯聚合物的可桥联纳米粒子进行胃肠外或局部递送光敏剂的组合物和方法。所述专利申请还公开了这种纳米粒子的制备和应用。使用过滤方法将所述纳米粒子灭菌。然而，该方法有它的缺点，并且通常与作为本发明主题的纳米粒子不相容。用于无菌过滤的孔径通常不大于O. 22μπι(彡220nm)，而本发明的纳米粒子基本上集中在100和500nm之间的总体大小范围内。因此，无菌过滤有它的缺点，并且通常与作为本发明主题的纳米粒子不相容。特别是，在本发明的二氢卟酚或菌绿素型(即携带一个或两个二氢吡咯单元的四吡咯)光敏剂的情况下，开发无菌纳米粒子制剂和适合于冷冻干燥的纳米粒子制剂是很困难的，因为这种系统对纳米粒子制备经常使用的操作条件所引起的氧化和光化学改性特别敏感(Y. Hongying 等,Dyes Pigm, 1999,43,109-117 ;C. Hadjur 等，J. Photochem.Photobiol. B Biology, 1998, 45,170-178 ；R. Bonnett 等，J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2,1999，325-328)。这些分别具有一个或两个二氢吡咯单元的二氢卟酚或菌绿素型光敏剂在它们的化学和物理行为上与它们相应的卩卜啉显著不同(R. Bonnett等，J. Chem. Soc. PerkinTras. 2,1999, 325-328 ；R. Bonnett 等，J.Porphyrins Phthalocyanines,2001,5,652-661)。关于被用作光敏剂载体的基于HSA的纳米粒子的已知现有技术未解决与基于HSA的纳米粒子的无菌性和冷冻干燥相关的问题，并且所研究的光敏剂由于它们的化学结构更稳定，在这方面是不太成问题的。由于疏水性光敏剂固有的在水中的低溶解度，需要使用适当的载体对其进行配制。因此，非常需要基于四吡咯的光敏剂的新制剂来增加它们在体内的摄取和它们的生物利用度。由于光敏剂(PS)的固有特点，PDT用于治疗各类疾病的应用已受到限制。所述光敏剂的固有特点包括它们的高成本、在宿主有机体中的长时间滞留、显著的皮肤光毒性、在生理溶液中的低溶解度、以及较低的靶向有效性，所述在生理溶液中的低溶解度降低了它们用于血管内施用的有用性，由此导致血栓栓塞意外。本发明通过提供由天然材料制成的药物相容性纳米粒子作为药物递送系统并用于胃肠外施用而消除了在疏水性光敏剂制剂中观察到的上述问题。本发明还提供了提高敏感的疏水性PS的生物利用度、稳定性、和溶解度的方法。发明的目的和概要本发明的目的是解决用于光动力疗法的疏水性光敏剂的适当的纳米粒子制剂的问题，所述制剂满足了在临床实践中用于胃肠外施用的必需条件。本发明的另一个目的是提供用于光动力疗法的疏水性光敏剂基于生物相容性HSA材料的纳米粒子药物制剂。本发明的又一个目的是提供四吡咯型疏水性光敏剂、即二氢卟酚和菌绿素基于人血清白蛋白(HSA)和稳定剂的纳米粒子制剂，所述稳定剂优选为戊二醛、甲醛、或热处理。本发明的再一个目的是能够将无菌的基于HSA的纳米粒子冷冻干燥并在需要时在水性介质中复溶。本发明的又一个目的是提供基于HSA的纳米粒子光敏剂制剂在TOT中的应用方法。简单地说，本发明提供了储存稳定的组合物和用于光动力疗法的基于药物的纳米微粒制剂的生产方法，所述制剂包含疏水性光敏剂、人血清白蛋白(HSA)、和稳定剂。这些纳米粒子制剂提供了用于胃肠外施用的治疗有效量的光敏剂(PS)。具体来说，可以使用四吡咯衍生物作为光敏剂，通过这种纳米粒子制剂增强所述四吡咯衍生物的功效和安全性。还提供了在无菌条件下制备基于HSA的纳米粒子的方法。在本发明的一个优选实施方式中，将疏水性PS替莫卟吩配制为用于胃肠外施用的纳米粒子。所述制剂可用于治疗增生性和肿瘤性病症、炎性问题、并且更特别是靶向肿瘤细胞。结合附图阅读以下说明，本发明的上述和其它主题、特点、和优点将变得显而易见。附图和表的说明 表I :荷载5，10, 15，20，-四(间羟基苯基)-卟啉(mTHPP)的HSA纳米粒子的物理化学特性(平均值土S.D. ；n=6)表II :在乙醇中的mTHPP以及在水溶液中存在O. 75%和2. 0%可溶性HSA的条件下荷载mTHPP的HSA纳米粒子形式的荧光寿命表III :在乙醇中的孟加拉红(Rose Bengal)以及在水溶液中存在O. 75%和2. 0%可溶性HSA的条件下荷载mTHPP的HSA纳米粒子形式的单线态氧产生和三重态参数表IV :荷载5，10，15，20,-0 (间羟基苯基)-二氢卟酚(mTHPC)的HSA纳米粒子的物理化学特性(平均值土S.D. ；n=3)图I 与 5，10，15，20，-四(间羟基苯基)-卟啉(mTHPP) (O，平均值土S.D. ；n=6)和5，10，15，20，-四(间羟基苯基)_ 二氢卟酚(mTHPC) (·，平均值土S.D. ;n=6)孵育的HSA纳米粒子依赖于溶解的HSA浓度(O. 75%-2. 0%)的载药量。图2具有mTHPP (ο)和mTHPC ( ·)的HSA纳米粒子在存在I. 5%可溶性HSA的条件下依赖于在5和10之间范围内的pH值的载药量(平均值土S.D. ;n=3)。图3在存在I. 5%溶解的HSA的条件下在34. 4% (V/V)乙醇中制备的用于药物吸附过程的荷载了 mTHPP的HSA纳米粒子的透射电镜图像。图4A-D具有光敏剂5，10，15，20，-四(3_羟基苯基)-卟啉(mTHPP)的基于HSA的纳米粒子的细胞摄取分析图5A-D具有光敏剂5，10，15，20，-四(3_羟基苯基)-二氢卟酚(mTHPC)的基于HSA的纳米粒子的细胞摄取分析。图6A-D 5个不同样品在孵育不同时间后对Jurkat细胞的暗毒性和光毒性效应。图7 Jurkat细胞在孵育不同时间后对3μ M mTHPC和不同的荷载mTHPC的HSA纳米粒子的细胞内摄取。
本发明所使用的二氢卟酚和菌绿素具有以下优选结构


本发明提供了储存稳定的组合物和用于光动力疗法的基于药物的纳米粒子制剂的生产方法，所述制剂包含疏水性光敏剂、人血清白蛋白(HSA)、和稳定剂。这些纳米粒子制剂提供了用于胃肠外施用的治疗有效量的光敏剂(PS)。具体来说，可以使用四吡咯衍生物作为光敏剂，通过这种纳米粒子制剂增强所述四吡咯衍生物的功效和安全性。本发明还提供了在无菌条件下制备基于HSA的纳米粒子的方法。在本发明的一个优选实施方式中，将疏水性PS替莫卟吩配制为用于胃肠外施用的纳米粒子。所述制剂可用于治疗增生性和肿瘤性病症、炎性问题、和更特别是靶向肿瘤细胞。