专利名称：对虾抗白斑综合症病毒能力的等量、定量测试方法对奸白斑综合症病毒(White Spot Syndrome virus, WSSV)于1992年首次发现于台湾(Chou HY, Huang CY, Wang CH, et al. Pathogenicity of a baculovirus infectioncausing white spot syndrome in cultured penaeid shrimp in Taiwan. Diseases ofAquatic Organisms，1995，23 :165 173)，并迅速在世界范围的养殖对虾中发现该病毒(Inouye K，Miwa S，Oseko N，et al. Mass mortalities of culture Kuruma shrimp Penaeus japonicus in Japan in 1993. Fish Pathology. 1994,29 :149 158/ 黄健，于佳，宋晓玲，等.1994年浙江省对虾暴发性流行病病原及传播途径的初步调查.海洋水产研究，1995，16 (I) :91 98/Jory D. E. &Dixon H. M. Shrimp white spot virus in thehemisphere. Aquaculture Magazine 1999，25，83-91.)。在诸多病原当中，WSSV 是对虫下养殖过程中最为肆虐的病毒类疾病，具有传播快、流行面广、死亡率高、防治困难等特点，严重制约对虾养殖业的健康发展。每年由该病毒给对虾养殖业造成的经济损失高达几百亿元，严重威胁对虾养殖业的可持续发展。1995年，世界动物卫生组织(OIE)、联合国粮农组织(FAO)以及亚太地区水产养殖发展网络中心(NACA)将其列为需要报告的水生动物病毒性疫病之一。为改良生产性状、解决各种病害问题，抗病新品种的选育越来越被国家和遗传育种学家所重视。在选育过程中一个非常重要的环节就是用人工感染病毒的方法测试选育对象的抗病性能。一般人工感染方法主要有三种，分别为浸浴病毒悬液(Momoyama K，et al. Mass mortalities of cultured kuruma shrimp，Penaeus japonicus，in Japanin 1993 histopathological study. Fish Pathology. 1994,29 :141-148/Nakano H，et al. Mass mortalities of cultured kuruma shrimp，Penaeus japonicus，in Japanin 1993 epizootiological survey and infection trials. Fish Pathology. 1994,29 :135_139/Chou HY, et al. Pathogenicity of a baculovirus infection causingwhite spot syndrome in cultured penaeid shrimp in Taiwan. Diseases of AquaticOrganisms, 1995, 23 165 173)、人工注射病毒粗提液(Momoyama K，et al. Massmortalities of cultured kuruma shrimp， Penaeus japonicus， in Japan in 1993 histopathological study. Fish Pathology. 1994,29 141-148/Nakano H，et al.Massmortalities of cultured kuruma shrimp， Penaeus japonicus， in Japan in 1993 epizootiological survey and infection trials. Fish Pathology. 1994，29 :135-139/Chou HY, et al. Pathogenicity of a baculovirus infection causing white spotsyndrome in cultured penaeid shrimp in Taiwan. Diseases ofAquatic Organisms，1995,23 :165 173)以及整池粗放式投喂毒饵。其中人工注射方法会对测试个体本身造成创伤，影响结果的真实性；同时，浸浴病毒悬液和人工注射病毒粗提液的方法由于与自然环境中病毒侵染宿主的路径不同，导致对虾自身产生的防御机制及结果会有差异；另外，病毒粒子一旦离开宿主处于游离状态，4小时后失去致病力(何建国，莫福.对虾白斑综合症病毒暴发流行与传播途径、气候和水体理化因子的关系及其控制措施.中国水产，1999，7 34-37)，因此不建议在育种过程中采用这两种感染方式。整池粗放式投喂毒饵的方法是将测试个体全部放于测试池中， 停食1-3天后，全池投喂含病毒饵料，并随时捞取、记录死亡个体时间、数量、体重等信息。由于不同对虾个体摄食能力不同，全池投喂毒饵后不能保证每尾对虾摄食毒饵量相同，如有的对虾可能反复多次摄食毒饵；体弱、个小的虾抢食量少或吃不到；蜕皮虾不摄食；已蚕食同类而饱胃的虾也可能不摄食；这种状况会大大增大抗病性能测试过程中的条件误差而使选育效果不理想。另外，由于对虾体色、肠胃透明，一般由病虾组织制备的毒饵经摄食后仍与对虾体色相同，导致极易错误判断人工感染过程中对虾个体是否摄食毒饵，使测试数据不准确。此外，如果将存活对虾直接用于留种亲虾，在不知对虾是否仍携带病毒的情况下对整个育种系统存在潜在危险。
本发明要解决的技术问题是提供一种对虾抗白斑综合症病毒能力的等量、定量测试方法，以解决目前对虾抗病性能测试过程中不能等量、定量感染、不能控制对虾摄食量、不能准确分辨对虾是否摄食毒饵、不明确存活对虾是否可以安全用于育种等无法避免的问题，从而实现中国对虾抗WSSV性能测试的准确性、高效性，克服现有技术的不足。本发明是按如下技术方案实现的对虾抗白斑综合症病毒能力的等量、定量测试方法，包括I)、毒饵制备；2)、抗WSSV性能测试；3)、数据及样品采集；4)、确定留种亲本，具体步骤如下I)、毒饵制备(I)毒饵病毒含量检测人工感染所用毒饵为经WSSV感染致死、具明显白斑综合征症状的对虾；分别取5mg肌肉组织提取基因组DNA并进行核酸浓度测定、TaqMan实时荧光定量PCR法进一步确定感染病毒种类并检测病毒拷贝数，选取病毒拷贝数相同的对虾用作制备毒饵，根据实际人工感染需要，计算出特定重量肌肉组织中病毒拷贝数；(2)染色毒饵制备取经荧光定量PCR确定病毒且病毒含量相同的对虾，去除其头胸部、附肢和甲壳后，仅使用肌肉组织，称重后按lOiil/g加入可食用红色素，在充分预冷的组织匀浆机中搅匀，制成病毒量均一、颜色醒目的毒饵，毒饵制备过程必须在低温环境中快速进行，色素与毒饵混合后在海水中不变色、不发散，可供对虾抱食、且便于观察；2)、抗WSSV性能测试(I)等量人工感染选取规格整齐、体质健康的对虾为测试对象，将待测试对虾分别置于透明塑料容器中饥饿2小时后，将现制备的毒饵置于有冰层的托盘中，用镊子夹取特定重量毒饵轻轻送至对虾口器处，对虾抱食，10-15分钟后观察，可见摄食毒饵的对虾胃及肠道呈现鲜艳的红色，未摄食毒饵的对虾胃及肠道无色，挑选抱食完毕的对虾放入测试池内；测试池所用器皿、工具严格与对照池、暂养池区分，用后及时用50ppm有效氯消毒；⑵对照池对虾人工感染测试必须设置对照池，即投喂经荧光定量PCR检测后不含WSSV病毒、且经与毒饵等量可食用红色素染色的鲜蛤肉；3)、数据及样品采集感染完备后，测试池和对照池正常投饵、换水，观察对虾死亡情况，从出现第一尾对虾死亡开始，随时捞出死亡对虾并记录其存活时间、体长、体重、性别、家系编号，并于-80°C保存死亡对虾；待对虾状态稳定、不再有对虾死亡后，将所有存活对虾转入新池继续养殖；4)、确定留种亲本感染测试后存活的对虾，在作为留种亲本进入遗传育种中心前，必需进行活体取样检测病毒含量，病毒含量低于阴性对照组的个体作为留种亲本，同时根据需要选取存活时间较长家系的备份留种。进一步，所述的步骤4中活体取样检测病毒含量的步骤为首先用70%酒精消毒待取样附肢、解剖剪、镊子，并在眼柄处套上带有编号的环状眼标用作个体间标识，然后用酒精喷灯将解剖剪烧红，快速剪取1/3-1/10附肢置于干净的印pendorf管中，同时用解剖剪将附肢剪口部位烫白，最后将对虾放入1-3%氟苯尼考药浴的干净池中，完成活体取样；然后提取附肢基因组DNA并进行核酸浓度测定、TaqMan实时荧光定量PCR法检测病毒拷贝数，挑选未携带病毒或病毒含量低于背景值的存活对虾用于留种亲虾，所述的背景值为38个PCR循环时阴性对照样品的检测值。进一步，在所述的等量人工感染过程中所用的镊子为不带横纹的尖头镊子。本发明与现有技术对比的有益效果(I)由于对虾体色、肠胃透明，一般由病虾组织制备的毒饵经摄食后仍与对虾体色相同，很难辨认是否摄食毒饵。本发明使用经鲜艳的红色食用色素染色的毒饵投喂测试对虾，对虾摄食后，胃及肠道都会呈现醒目的粉红色，非常容易辨认，从而可以正确剔除未摄食毒饵对虾，易操作、数据可靠。(2)本发明可实现对虾人工感染的定量、可控、无伤害。不同个体、同一个体的不同组织(鳃、肝胰腺、心脏、附肢、肌肉)病毒含量差异非常大(可相差10-1000倍)，粗放式人 工感染无法控制每尾对虾的摄食量、摄食部位和摄食次数，对某些个体来说可能造成未感染、多次感染和摄食部位不同而感染差异大等现象。注射感染虽然可以控制注射的病毒量，但会造成对虾体本身的伤害而影响测试结果。另外，注射感染和浸浴感染都使用病毒提取液进行，离开宿主的游离病毒会很快失活，导致感染失败或数据不准确。本发明使用新鲜制备的病虾组织，去除头胸部、甲壳及所有附肢后，仅使用躯干部位的肌肉组织制备毒饵，并准确定量用作制备毒饵的每尾对虾的肌肉组织，保证了感染源的同一性。本发明还可根据需要控制投喂的毒饵量，如IO3病毒拷贝、IO5病毒拷贝，或设置I次、2次感染，简单、准确、可控。(3)本发明对存活的对虾进行病毒携带量检测，挑选未携带病毒或病毒含量低于背景值的存活对虾用于留种亲虾。保证了育种系统的安全。取样过程轻、快、准，取样量少，对虾体本身造成的伤害小，可顺利养成至亲虾规格。图I :人工投喂染色毒饵过程中虾胃及肠道的颜色变化a.未摄食毒饵对虾；b.正在摄食经染色毒饵的对虾；c.已摄食毒饵的对虾；d.感染完毕后放入测试池中的对虾。

选取规格整齐、体质健康的对虾为测试对象，将测试对虾随机分为4组，每组80尾，分别置于透明塑料容器中(底面直径X高=IOcmX 15cm)，容器内水位高5cm。饥饿2h后，将现制备的毒饵置于有冰层的托盘中，分别用5mg、10mg、20mg毒饵(测试组)和染色鲜蛤肉(对照组)投喂4组测试对虾。用不带横纹的尖头镊子夹取毒饵轻轻送至对虾口器处，对虾抱食(图Ib)。约15分钟后观察，可见摄食毒饵的对虾胃及肠道呈现鲜艳的红色(图Ic)，未摄食毒饵的对虾胃及肠道无色(图Ia)。挑选抱食完毕的对虾分别放入4个测试水族箱(图Id)，因蜕皮等原因未摄食对虾放回暂养池等待再次测试。测试池所用器皿、工具严格与对照池、暂养池区分，用后及时用50ppm有效氯消毒。(2)对照池对虾人工感染测试必须设置对照池，即投喂经荧光定量PCR检测后不含WSSV病毒、且经与毒饵等量草莓红食品级天然红色素(广州市天阳泰天然色素有限公司)染色的鲜蛤肉。3)、数据及样品采集(I)日常管理感染完备后，正常投馆、换水，每天吸底I次、换水I次(换水量40-70% );每6小时投饵一次，一天共计4次，分别投喂配合饵料、活卤虫、鲜蛤肉、配合饵料。按照体重计算，投喂量为配合饲料1_2%，活卤虫、鲜蛤肉等鲜活饲料10-15%。(2)信息收集注意观察对虾死亡情况，从出现第一尾对虾死亡开始，随时捞出死亡对虾并记录存活时间、体长、体重、性别、家系编号，并于-80°C保存死亡对虾。待实验池内对虾状态稳定，统计4组对虾生存状况。人工感染后第13天(300小时)时，20mg毒饵组对虾全部死亡，IOmg毒饵组对虾存活率52. 05%，5mg毒饵组对虾存活率82. 18% ;人工感染后26天(608小时)时测试结束，20mg毒饵组对虾平均存活时间为187. 33±47. 99小时，IOmg毒饵组对虾平均存活时间为323. 29± 134. 05小时，5mg毒饵组对虾平均存活时间为389. 27±98. 32小时。摄食不同病毒含量的对虾存活时间差异显著(P < 0. 01)。实施例2留种家系的选择及亲本病毒携带量检测实验用中国对虾为2011年山东省青岛市岙山卫“中国对虾遗传育种中心”培育的“黄海2号”家系，共计104个家系，每家系随机选取60尾，体长2-3cm，进行VIE (visibleimplant elastomer)突光标记后暂养,2天之后转移至山东省海阳黄海水产有限公司海珍品养殖基地进行人工感染WSSV测试，包括I)、毒饵制备；2)、抗WSSV性能测试；3)、数据及样品采集；4)、确定留种亲本，具体步骤如下I)、毒饵制备(I)毒饵病毒含量检测方法同实施例I。病毒含量检测值为I. 6X IO5Copy/iU，计算出5mg肌肉组织中病毒拷贝数为6. 8 X IO8Copy。(2)染色毒饵制备方法同实施例I。2)、抗WSSV性能测试方法同实施例I。投喂毒饵量全部为5mg/尾。3)、数据及样品采集方法同实施例I。大规模人工感染测试从2011年7月I日开始到8月5日结束，共进行36天，每尾对虾摄食毒饵5mg (6. 8 X 108copy)。在人工感染48小时后开始有个别对虾出现白斑综合症的典型症状，行动迟缓、摄食量减少，甲壳出现直径为0. 5-2. Omm的白色斑点。第六天(140小时)出现死亡高峰，累计死亡率为61. 40%。第13天(300小时)后对虾死亡速度越来越慢,基本不再死亡。4)、确定留种亲本感染测试后15天，测试对虾状态稳定，有59尾对虾存活。对所有活体进行附肢取样检测病毒含量。取样方法为首先用70%酒精消毒待取样附肢、解剖剪、镊子等，并在眼柄处套上带有编号的环状眼标，然后用酒精喷灯将解剖剪烧红，快速剪取1/3部分附肢置于干净的印pendorf管中，同时用解剖剪将附肢剪口部位烫白，最后将对虾放入1_3%氟苯尼考药浴的干净池中，完成活体取样。提取附肢基因组DNA、核酸浓度测定、TaqMan实时荧光定量PCR检测病毒拷贝数的方法同毒饵的有关检测方法。测试结果表明，有42尾对虾病毒含量低于lcopy/ng DNA，可直接安全作为留种亲本，其它17尾个体病毒含量值范围为9. 6-10223copy/ng DNA，不能纳入常规育种体系。同时，依据存活时间对所有测试家系进行 排序，另外选取存活时间较长的24个家系的备份留种。


对虾抗白斑综合症病毒能力的等量、定量测试方法，属于对虾抗病品种选育技术领域，包括1)毒饵制备；2)抗WSSV性能测试；3)数据及样品采集；4)确定留种亲本。通过TaqMan实时荧光定量PCR法确定感染病毒种类并检测病毒拷贝数，选取病毒拷贝数相同的对虾用作制备毒饵，根据实际人工感染需要，计算出特定重量肌肉组织中病毒拷贝数；通过在毒饵中加入可食用红色素，并逐尾对待测试对虾进行感染，实现对虾等量、定量的测试方法，为获得真实可靠的数据提供了保障。