专利名称：一种含藤黄酸类药物的药物组合物及其制备方法癌症在全球范围内已成为严重威胁人类生命健康的多发常见病。手术、化疗等临 床治疗是清除肿瘤瘤体的有效手段，但手术仅能切除肉眼可见的瘤体，对不可见的亚临床 病灶和已转移或浸润到正常组织的肿瘤细胞却无法清除；而常规化疗由于现有的抗癌药对 肿瘤组织和细胞几乎无选择性，普遍存在临床疗效低、毒性大、转移灶难以控制、患者用药 顺应性差等问题，从而导致部分患者拒绝用药或用药失败的不良局面。抗肿瘤药物治疗癌 症是目前临床治疗的主要方法之一，但由于现有的抗肿瘤药物大多溶解性差，口服吸收较 差，生物利用度较低，而且在体内代谢较快，维持血药浓度时间较短，为了提高疗效往往需 要增大剂量或增加给药次数，加之对正常细胞和癌细胞缺乏选择性，由此带来更大的毒副 作用。因此开发长效、缓释和靶向性抗肿瘤药物制剂是当今研究的重点。抗肿瘤靶向制剂的突出优势在于针对性强、效果显著、副作用低；将抗肿瘤药物制 备成脂质体、微囊(球)等给药系统增强靶向性、提高疗效，已成为肿瘤靶向给药的有效途 径，但脂质体作为药物载体，仍存在包封率低、靶向分布不理想、贮存中稳定性欠佳等缺点； 微囊(球)粒径较大，无法透过粘膜或经体循环直接把药物输送到靶组织，不适合注射用 药；且脂质体、微囊(球)在治疗某些实体瘤(如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等)方面效果不 甚理想。而高聚偶联物则是一种很有效方式，其将小分子疏水性药物接入高分子载体，形成 了一种新型聚合物，特别是纳米级聚合物粒子由于其小尺寸效应和表面、界面效应等，不仅 可以提高药效、减轻不良反应，且方便患者使用。其突出优势还在于①增加疏水药物可溶 性；②被动靶向和缓控释作用；③避免被肾脏快速清除，延长药物血浆半衰期等。藤黄是藤黄科植物所分泌的干燥树脂中提取的，主要包括藤黄酸、新藤黄酸、别藤 黄酸等成分。藤黄酸是藤黄的主要活性成分，对多种肿瘤有明显的抑制作用。研究结果表 明，藤黄酸在肿瘤组织中有较高的分布和较长的持续时间。研究藤黄酸作用机理的分子水 平的研究结果表明藤黄酸具有高效、低毒、多作用靶点的特点，能选择性的杀死癌细胞而 对正常的造血系统和白细胞没有影响，这为寻找新型抗癌药提供了应用前景。藤黄酸极难 溶于水，目前报道的藤黄酸注射剂主要使用硼酸溶液配制，或添加L-精氨酸、葡甲胺、吐温 等增溶剂来制备藤黄酸冻干制剂。长期使用这些增溶剂会引起一系列的不良反应，或需要 较大剂量才能取得稳定有效的增溶效果。发明人在前期研究中发现两亲性高聚偶联物具有良好的增溶作用，对于某些难溶 性药物如紫杉醇、阿霉素等增溶效果良好。这里使用的两亲性高聚偶联物是以天然多糖为 骨架，在多糖的羧基或经衍生化形成的羧基上通过简单的亚烷基二胺为连接臂，引入含羧 基的疏水性药物，使得偶联物既具有疏水性药物部分又具有亲水性多糖部分，大大增强了 两亲性，且兼具聚合物胶束的特征1)在水溶液中可自组装形成纳米胶束，避免了有机溶齐U、表面活性剂、交联剂或加热条件的使用；2)在多糖分子链与疏水性药物的双重作用下， 显著降低胶束的临界胶束浓度，明显延长稳定时间，并提高药物的载药量和包封率；3)由 于増溶在偶联物内核的抗肿瘤药物是以非共价的方式与载体结合，使得运载的药物能够较 为容易的释放出来，与化学偶联的药物释放行为相互辅助，达到程序性释药效果；4)可以 通过物理増溶和化学偶联的抗肿瘤药物的作用机制相互补充，增强抗肿瘤活性，达到联合 治疗的效果。CN101791411A公开了 这些技术。采用两亲性高聚偶联物包裹藤黄酸类药物，与使用其他载体包裹藤黄酸类药物相 比具有明显优势。比如将藤黄酸、磷脂、胆固醇三者按照一定重量比，采用薄膜超声法制得 藤黄酸脂质体。但藤黄酸脂质体存在以下缺陷物理、化学稳定性差，贮存一定时间后被包 裹的药物容易渗漏；包封率较低，包封率最高仅80%左右；藤黄酸脂质体粒径较大，缺乏血 管通透性，不易通过肝血管的细胞间隙，易被网状内皮系统吞噬；藤黄酸脂质体的制备工艺 和质量控制工艺要求较高，较难实现产业化大生产。针对以上问题，本专利采用藤黄酸类药物和两亲性高聚偶联物的药物组合物，构 建了一种新型抗肿瘤药物传递系统。通过这种方式，藤黄酸以物理包埋及化学偶联的方式 包裹于高聚偶联物中，该药物组合物可大大增强药理作用，提高药物安全性，实现药物的联 合治疗，且药效显著增强，刺激性明显降低，达到理想释药效果。
本发明的目的是针对上述技术问题，提供一种含藤黄酸类药物的药物组合物。该 药物组合物利用两亲性高聚偶联物包裹藤黄酸类药物，该药物组物合安全性好、载药量高、 生理活性好、药效提高、毒副作用降低、稳定性好。本发明的另一个目的是提供包含上述含藤黄酸类药物的药物组合物的制备方法。本发明的另一个目的是提供上述含藤黄酸类药物的药物组合物在制药中的应用。本发明中，两亲性高聚偶联物对藤黄酸类药物具有增溶作用，且增溶效果优于紫 杉醇、阿霉素等难溶性抗肿瘤药物。偶联物在水介质中可自组装为具有抗肿瘤活性的纳米 胶束，包裹藤黄酸类药物，有效的解决了藤黄酸的溶解性问题。含藤黄酸类药物的药物组合物中所述的藤黄酸类药物主要包括总藤黄酸、藤黄 酸、新藤黄酸、别藤黄酸及上述药物与碱性氨基酸、碱金属离子、含氮有机碱性化合物、葡萄 糖胺类化合物形成的药用复合物。含藤黄酸类药物的药物组合物中所述的两亲性高聚偶联物，其中选用的多糖包括 原本含有羧基的多糖包括未分级肝素、低分子量肝素、脱硫酸化肝素、透明质酸、软骨素、多 硫酸化软骨素、海藻酸和含有羧基的多糖衍生物包括多糖壳聚糖、羧甲基壳聚糖、琥珀酰壳 聚糖、葡聚糖、真菌多糖、羧甲基香菇多糖。所述的疏水基团为含羧基的药学活性或药理活 性分子，包括藤黄酸、新藤黄酸、别藤黄酸、全反式维甲酸、9-顺式维甲酸、甲氨蝶呤、氨基 蝶呤、雷替曲塞、培美曲塞、苯丁酸氮芥、氨基乙酰丙酸、人参皂苷、齐墩果酸、熊果酸、阿司 匹林、双氯芬酸、酮洛芬、布洛芬、芬布芬、甲芬那酸、甲氯芬那酸、吲哚美辛、舒林酸、阿西美 辛、苄达明、依托度酸、萘普生、异丁苯丙酸、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、吡哌酸、左氟沙 星、依诺沙星、洛美沙星、培氟沙星、氟罗沙星、妥舒沙星、斯帕沙星、妥美沙星、巴罗沙星、依 达曲沙和包括胆酸、熊去氧胆酸、石胆酸、鹅去氧胆酸在内的胆汁酸类。所述的两亲性高聚偶联物的制备方法，包括下列步骤将含羧基 的疏水性药物溶于适当有机溶剂中，采用亚烷基二胺为连接臂，二环己 基碳化二亚胺(DCC)、羟基琥珀酰亚胺(NHS)为活化剂进行缩合反应，得到游离一端氨基的 活性中间体；将含羧基或经衍生化成羧基的多糖溶于反应溶剂中，与得到的活性中间体通 过1-乙基-(_ 二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)为活化剂，进一步羧基和氨基缩合反应。所述的制备方法，其中适当有机溶剂优选自N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲 基亚砜。所述的制备方法，其中连接臂为碳原子数2 12的亚烷基二胺结构。所述的制备方法，其中反应溶剂优选自水、或甲酰胺、或N，N-二甲基甲酰胺与水、 或甲酰胺与水、或N，N-二甲基甲酰胺与甲酰胺的混合溶剂。本发明中含藤黄酸类药物的药物组合物，其优选制备方法如下两亲性高聚偶联 物与水按重量比为3 50 1000的比例溶解，得到偶联物纳米胶束；将治疗有效量的难溶 或微溶于水的藤黄酸类药物用药学上可接受溶剂溶解后，与所述偶联物纳米胶束混合后， 经超声或高压均质处理，溶液用透析法或超滤法或柱分离法除去有机溶剂和小分子，制成 溶液型制剂。所述药学可接受溶剂优选甲醇、乙醇、二氯甲烷、氯仿、二甲基亚砜、N，N_ 二甲基甲 酰胺中的一种或几种混合溶剂。药学可接受溶剂进一步优选乙醇。用此法制得的胶束载药 量高，包封率高，药物可持续释放，延长在血液循环中的时间。 研发发现，以藤黄酸-透明质酸偶联物和藤黄酸的药物组合物为例，藤黄酸-透明 质酸偶联物与藤黄酸的用量不同，载药量不同。藤黄酸量过少或者过多情况下，载药效果均 不理想。发明人经过实验最终确定两亲性高聚偶联物与藤黄酸的质量比为1 0.01-1 1。 进一步优选两亲性高聚偶联物与藤黄酸的质量比为1 0.4-1 0.6。采用最优工艺制备 得到的藤黄酸与藤黄酸-透明质酸偶联物形成的胶束，载药量最高可达38. 7%，包封率可 达88. 2 %，制得的胶束粒径达纳米级别。本发明中藤黄酸胶束单位体积中的药物含量高，具 有稳定的载药量和包封率。本发明的药物组合物经过稳定性对比试验，证明其与藤黄酸原 料药以及藤黄酸脂质体相比具有更优良的稳定性。藤黄酸原料药在经过一定时间后药物含 量明显下降，藤黄酸脂质体在一定时间后药物也有渗漏现象，而相同时间内，本药物组合物 的胶束粒径大小基本不变，含药量稳定。还可将上述含藤黄酸类药物的药物组合物冻干制成冻干制剂。制成冻干制剂时可 加入冻干保护剂，冻干保护剂可选自右旋糖酐、甘露醇、葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖中的一 种或几种。冻干保护剂的量按照胶束溶液体积计算，每份胶束溶液优选加入0.01-0.1份冻 干保护剂，过滤后冷冻干燥。上述方法制备的含藤黄酸类药物的冻干制剂，不含任何有机溶剂，临床使用前可 用注射用水、葡萄糖注射液或生理盐水复溶，本发明的冻干制剂再溶解时溶解迅速，溶液澄 清。藤黄酸胶束冻干粉针既能显著提高贮存稳定性，又能降低临床用药的不安全性。本发明的药用组合制剂可通过口服或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的 患者，用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂等，制成液体制 剂如水或油悬浮剂或其他液体制剂如糖浆、口服液等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射 用溶液、粉针、水或油性悬浮剂等。优选形式是注射用粉针、片剂、包衣片剂。本发明的另一目的是提供一种治疗肝癌、宫颈癌及其他肿瘤的药物组合物，其疗 效优于藤黄酸，刺激性与毒性均降低。本发明还提供上述药物组合物在制备治疗肝癌、宫颈 癌及其他肿瘤药物方面的用途。本发明发现， 含藤黄酸的药物组合物无血管刺激性(家兔耳静脉滴注，相当于Img 藤黄酸/20ml/kg)。以2%兔红细胞混悬液进行本发明的溶血试验，表明0.5ml以下剂量 在2h内未见红细胞溶血和聚集现象。该药物组合物在血管途径给药时，产生的局部刺激 性副作用比单用藤黄酸要低。如家兔耳缘静脉无菌操作分别缓慢滴注藤黄酸钠盐、含藤 黄酸的药物组合物如全反式维甲酸-透明质酸与藤黄酸的组合制剂、0.9%氯化钠注射液， 间日一次，连续3次。结果表明，与对照组相比含藤黄酸的药物组合物对家兔耳缘静脉无 刺激性，组织切片检查家兔耳缘静脉血管结构正常，无内皮损伤，无血栓形成及其它药理性 变化；藤黄酸对家兔耳缘静脉有刺激性，组织切片检查耳缘静脉略有扩张，部分内皮细胞坏 死、脱落，周围组织可见炎症反应。本发明还发现，含藤黄酸类药物的药物组合物增加了藤黄酸类药物在水中的溶解 度，同时药效也显著增强。采用四甲基偶氮唑盐比色法，发现全反式维甲酸_透明质酸与藤 黄酸形成的药物组合物其对宫颈癌Hela细胞和肝癌HepG2细胞的药效较藤黄酸原料药显 著提高，是符合临床需求的既具有良好水溶性且药效高的药物。本发明的有益效果一、本发明将藤黄酸类药物与两亲性高聚偶联物结合，采用亲水壳和疏水核组成 的纳米胶束包裹抗肿瘤药物，能够延长体内循环、减少网状内皮细胞的吞噬，增加肿瘤靶 向，提高安全性。二、本发明提供的含藤黄酸类药物的药物组合物中，两亲性高聚偶联物利用多糖 接枝疏水基团，可在水中自发形成纳米胶束，不但可用于抗肿瘤药物的包载，而且由于亲水 壳和疏水核组成的纳米胶束结构，能够延长体内循环、减少网状内皮细胞的吞噬，增加肿瘤 靶向，故可通过物理包裹和化学偶联抗肿瘤药物的方式，达到联合治疗癌症的效果；三、本发明提供的含藤黄酸类药物的药物组合物可用于注射、口服、外用或粘膜给 药。具有高度安全性，粒径可控制在10 lOOOnm，溶解性好，稳定性好。四、本发明提供的含藤黄酸类药物的药物组合物改进了目前藤黄酸制剂的缺陷， 经济实用，具有良好的抗肿瘤作用，无血管刺激性，药效高。实施例2 藤黄酸_透明质酸偶联物的合成取IOmmol藤黄酸、12mmol 二环己基碳化二亚胺(DCC)、15mmol羟基琥珀酰亚胺 (NHS)，溶解在30mlN，N- 二甲基甲酰胺中，避光、氮气保护下，冰浴反应30min，然后升至室 温反应24h。反应结束后，滤去沉淀，并加大量乙酸乙酯洗涤沉淀。对滤液进行萃取，合并 乙酸乙酯层，旋转蒸发除去溶剂得到藤黄酸活化中间酯。将Immol藤黄酸活化中间酯溶于 IOml 二氯甲烷中，在冰浴条件下，缓慢滴入3mmol/ml乙二胺的二氯甲烷溶液中，薄层色谱 法(TLC法)监控反应至完全后，对反应液进行萃取，合并有机层，硅胶柱层析法分离纯化所 得产物，即藤黄酸活性中间体。取26mmol 1_乙基_ (3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，加入 含0. Immol透明质酸的甲酰胺溶液中，室温反应15min，将含26mmol藤黄酸活性中间体的 N，N-二甲基甲酰胺的溶液缓慢加入上述反应液中，室温反应24h。反应结束后，加入丙酮沉 淀产物，抽滤得沉淀。加水复溶沉淀，在水中透析3d，冷冻干燥，即得最终产物藤黄酸-透明 质酸偶联物。实施例3 含藤黄酸和藤黄酸_透明质酸偶联物的自组装纳米胶束组合物的制备(1)透析法藤黄酸-透明质酸偶联物18mg，溶解在3ml水中搅拌lh。藤黄酸9mg溶解在乙醇 (甲醇)中。然后二者混合，探头超声30min后，重蒸水透析过夜，离心(3000rpm)15min，用 0. 45 μ m滤膜过滤，冷冻干燥。(2)乳化溶剂挥发法藤黄酸-透明质酸偶联物18mg，溶解在3ml水中搅拌lh。藤黄酸9mg溶解在 二氯甲烷中。然后二者混合，探头超声30min，室温敞口搅拌过夜，使二氯甲烷挥发，离心 (3000rpm) 15min,用0. 45 μ m滤膜过滤，冷冻干燥。实施例4 含藤黄酸和藤黄酸_肝素偶联物的自组装纳米胶束组合物的制备藤黄酸-肝素偶联物18mg，溶解在3ml水中搅拌lh。藤黄酸9mg溶解在乙醇(甲 醇)中。然后二者混合，探头超声30min后，重蒸水透析过夜，离心(3000rpm) 15min，用 0. 45 μ m滤膜过滤，冷冻干燥。实施例5 含藤黄酸和全反式维甲酸_透明质酸偶联物的自组装纳米胶束组合物 的制备全反式维甲酸-透明质酸偶联物18mg，溶解在3ml水中搅拌lh。藤黄酸9mg 溶解在乙醇(甲醇)中。然后二者混合，探头超声30min后，重蒸水透析过夜，离心 (3000rpm) 15min,用0. 45 μ m滤膜过滤，冷冻干燥。实施例6 含藤黄酸和甲氨蝶呤_硫酸软骨素偶联物的自组装纳米胶束组合物的 制备甲氨蝶呤-硫酸软骨素偶联物18mg，溶解在3ml水中搅拌lh。藤黄酸9mg溶解在乙 醇(甲醇)中。然后二者混合，探头超声30min后，重蒸水透析过夜，离心(3000rpm) 15min，用0. 45 μ m滤膜过滤，冷冻干燥。 实施例7 含新藤黄酸和藤黄酸_透明质酸偶联物的自组装纳米胶束组合物的制 备藤黄酸-透明质酸偶联物18mg，溶解在3ml水中搅拌lh。新藤黄酸9mg溶解在乙 醇(甲醇)中。然后二者混合，探头超声30min后，重蒸水透析过夜，离心(3000rpm) 15min， 用0. 45 μ m滤膜过滤，冷冻干燥。实施例8:含新藤黄酸和阿司匹林-海藻酸偶联物的自组装纳米胶束组合物的制 备阿司匹林-海藻酸酸偶联物18mg，溶解在3ml水中搅拌lh。新藤黄酸9mg溶解在乙 醇(甲醇)中。然后二者混合，探头超声30min后，重蒸水透析过夜，离心(3000rpm) 15min， 用0. 45 μ m滤膜过滤，冷冻干燥。实施例9 含新藤黄酸和熊去氧胆酸_透明质酸偶联物的自组装纳米胶束组合物 的制备熊去氧胆酸-透明质酸偶联物18mg，溶解在3ml水中搅拌lh。新藤黄酸9mg 溶解在乙醇(甲醇)中。然后二者混合，探头超声30min后，重蒸水透析过夜，离心 (3000rpm) 15min,用0. 45 μ m滤膜过滤，冷冻干燥。实施例10 含别藤黄酸和熊去氧胆酸-透明质酸偶联物的自组装纳米胶束组合物 的制备熊去氧胆酸-透明质酸偶联物18mg，溶解在3ml水中搅拌lh。别藤黄酸9mg 溶解在乙醇(甲醇)中。然后二者混合，探头超声30min后，重蒸水透析过夜，离心 (3000rpm) 15min,用0. 45 μ m滤膜过滤，冷冻干燥。实施例11 药物组合物自组装纳米胶束中藤黄酸含量的测定用HPLC(LC_2010C，Shimadzu, Japan)方法进行含量测定。流动相为甲醇水= 93 7 (ν/ν)，含0. 的冰醋酸，色谱柱为Lichrospher C18 (150 X 4. 6 μ m)，柱子粒径为 5μπι。流速为 1. OmL/min，检测波长为 360nm(SPD-10A，UV detector，Shimadzu，Japan)，柱 温为30°C，注射样品体积为20μ 1。以公式(1)计算样品的载药量。结果见表1。包封率(％) 二賺束的药物*χ100 (1) 投药量表1实施例3 6载有藤黄酸的两亲性高聚偶联物自组装纳米胶束_两亲性高聚偶联物制备工艺载药量(％ )实施例3透析法38. 7实施例3乳化溶剂挥发法 29. 5实施例4透析法34. 5实施例5透析法31.2实施例6透析法28. 9_ 实施例12 药物组合物自组装纳米胶束中新藤黄酸含量的测定
用HPLC(LC_2010C，Shimadzu, Japan)方法进行含量测定。流动相为甲 醇1.0mol/L 磷酸=90 10 (ν/ν)，色谱柱为 Lichrospher C18 (150 X 4. 6 μ m)，柱子粒径 为 5ym。流速为 1. OmL/min，检测波长为 360nm(SPD-10A，UV detector, Shimadzu, Japan), 柱温为30°C，注射样品体积为20 μ 1。结果见表2。表2实施例7载有新藤黄酸的两亲性高聚偶联物自组装纳米胶束


本发明公开了一种含藤黄酸类药物的药物组合物及其制备方法。本发明具体涉及一种含藤黄酸类药物的药物组合物，其特征是包含一种与两亲性高聚偶联物形成胶束的藤黄酸类药物。本发明中藤黄酸类药物通过物理包埋及化学偶联的方式包裹于两亲性高聚偶联物中，既能大大增加藤黄酸类药物的溶解性，又能显著提高贮存稳定性和抗肿瘤活性，提高药物安全性。和藤黄酸类药物相比较，该药物组合物在治疗肝癌、宫颈癌及其他肿瘤方面疗效提高，刺激性降低。本发明还提供了一种制备上述两亲性高聚偶联物，以及该含藤黄酸类药物的药物组合物的制备方法。本发明制备方法简单，工艺成熟，产率高，适于工业化生产。