专利名称:S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶的测定方法及其试剂盒的制作方法生物大分子的甲基化修饰在信号传导、生物合成、蛋白修复、基因沉默和染色体表达调控等方面发挥着重要作用,S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine, SAM)是体内仅次于ATP的甲基供体,其依赖的S-腺苷甲硫氨酸转移酶利用SAM作为甲基供体,从而将DNA和蛋白质进行甲基化修饰作用,从而参与重要生理活动。目前研究表明,该酶的异常水平与老年痴呆症、抑郁症、帕金森综合症、癌症等多种疾病有关,在医学诊断方面具有重要的应用价值和临床意义。目前测定SAM甲基转移酶活力有放射性底物法、纸层析法。放射性底物法通常采用14C或3HSEAdoMet,甲基转移反应完成后,通过同位素扫描成像仪观察放射性标记的产物量,从而检测该酶的活性。该方法需要分离反应产物和底物,费时费力,重复性差,难以做到准确定量,而且反应产物S-腺苷一L-同型半胱氨酸(Hcy)对该酶催化的甲基化反应具有强烈的反馈抑制作用,导致反应不完全。另外,该方法具有有放射性,对环境及操作人员污染大。而纸层析法通常采用纸层析技术将反应底物和产物分离出来,在特定条件下检测产物的生成量,从而检测该酶的活性,该方法只能半定量检测产物的生成量,而且同样存在产 物反馈抑制,难以准确定量。目前也有专利和文献报道SAM甲基转移酶的酶偶联法测定方法。专利《一种S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)依赖的甲基转移酶的检测方法》申请号为201010197808. 5,该专利报道了利用重组的S-腺苷-L-高半胱氨酸核苷酶和重组的S-核糖基高半胱氨酸酶催化S-腺苷-L-高半胱氨酸反应生成高半胱氨酸,后者用Ellman试剂5,5’ -联硫-2,2’ -双硝基苯甲酸定量,从而最终测定SAM甲基转移酶的酶活。但是该方法也存在高半胱氨酸定量反应比较繁琐,工作量大,并且无法在半自动或全自动生化仪上操作的不足。
本发明针对现有技术的上述不足,提出了一种解除了产物的反馈抑制,结果稳定可靠,定量反应准确,同时克服了放射性标记法存在的操作繁琐,费时费力,和放射性对环境及操作人员污染的不足的SAM甲基转移酶的检测方法。为了解决上述技术问题,本发明采用的技术方案为一种SAM甲基转移酶的检测方法,过程为通过与S-腺苷同型半胱氨酸水解酶和腺苷脱氨酶偶联,将SAM甲基转移酶的生成产物S-腺苷同型半胱氨酸迅速转化成醌化物,并在可见光范围内通过检测吸光度的变化,来确定醌化物的生成量,从而确定SAM甲基转移酶的活性。本发明针对上述问题,结合现有发明的不足,利用酶偶联反应法,提供一种可以定量、检测方便的SAM甲基转移酶酶活测定试剂盒,反应原理如下 本发明公开了一种S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶的测定方法及其试剂盒。该检测方法是通过S-腺苷-同型半胱氨酸水解酶和腺苷脱氨酶的酶偶联反应检测SAM甲基转移酶,该检测技术不仅解除了产物的反馈抑制,结果稳定,定量反应准确,同时有效克服了放射性标记法的放射性污染问题,而且本发明由双试剂组成,可采用手工或全自动生化仪上在可见光范围内检测,使用方便,便于大量样品的快速检测。另外,本发明也同样适用于s-腺苷同型半胱氨酸水解酶和腺苷脱氨酶的酶偶联反应检测。
S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶的测定方法及其试剂盒制作方法
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