专利名称：Dna甲基转移酶抑制剂的制作方法1.发明领域本发明涉及抗生素领域，尤其是抗菌化合物。特别是本发明涉及靶向DNA修饰酶的抗生素，尤其是腺嘌呤DNA甲基转移酶，它是各种不同细菌病原体的成分，该细菌病原体包括那些为细菌细胞生长所必需者。本发明特别提供了这种腺嘌呤DNA甲基转移酶的抑制剂，其对胞嘧啶甲基转移酶的抑制作用很小或没有抑制作用，并因此对真核细胞尤其是哺乳动物细胞的抗菌作用有限。本发明还提供了制备和使用本发明腺嘌呤DNA甲基转移酶抑制剂的方法，以及它们的药物组合物。2.发明背景现代医学发展的一个标志是降低与细菌感染有关的发病率和死亡率。20世纪早期和中期各种抗生素药物的开发第一次为医学从业人员提供了对各种感染性疾病的有效治疗。但是，滥用常规抗生素和感染性细菌群的自然选择已导致了大多数细菌感染性药剂的耐药性发展为不同程度的大多数抗生素药剂的耐药性。严重情况下，诸如MRSA(耐多种药物的StaphA)，目前只有一种或仅一些抗生素是有效的。另外，免疫缺陷综合症的存在导致另外发生需要抗生素加强治疗的机会性致病感染。因此，本领域越来越需要新的更有效的抗生素化合物来治疗对现有的疗法产生耐药性的细菌感染。大多数细菌通过使特定的核苷酸碱基甲基化来修饰它们的基因组DNA。DNA甲基化对于基因调节和突变损伤的修复很关键(见Jost和Soluz，1993，DNA甲基化，分子生物学和生物学显著性，Birhauser VerlagBasel，Switzerland；Palmer和Marinus，1994，《基因》1431-12；Dryden，1999，“细菌DNA甲基转移酶”，在《S-腺苷蛋氨酸依赖性甲基转移酶结构和功能》中，X.Cheng和R.M.Blumenthal(编)，World Scientific Publishing，p.283340，评论)。DNA甲基化是由一类具有不同序列特征的酶来催化的。有这样一些DNA甲基转移酶，例如(dam)，它们使GATC序列中的腺嘌呤残基或者CCAGG或CCTGG序列中的胞嘧啶(dcm)残基甲基化，这些序列不包含在关联限制酶的识别部位。有这样一些DNA甲基化转移酶，它们使包含在关联限制酶的识别部位的残基甲基化(例如，ApaI，AvaII，BclI，ClaI，DpnII，EcoRI，HaeIII，HhaI，MboI，和MspI；见Marinus和Morris，1973，《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)1141143-1150；May和Hatman，1975，《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)123768-770；Heitman，1993，Genet.Eng.1557-108)。另外，本发明人已经从新月柄杆菌中发现了一种腺嘌呤DNA甲基转移酶，这种酶可使GANTC序列中的腺嘌呤残基甲基化，这公开在国际申请公开号WO98/12206中。这种甲基转移酶是细胞周期调节性的酶并且是成功的细菌细胞生长所必需的；酶的抑制作用使得细菌不能生存。在流产布鲁氏菌、幽门螺杆菌、根癌土壤杆菌和苜宿中华根瘤菌中也发现了相似的甲基转移酶。与细菌细胞相比，真核细胞尤其是哺乳动物细胞中的DNA甲基化限于包括序列CpG部位的胞嘧啶甲基化(Razin和Riggs，1980，《科学》210604-610；Jost和Bruhat，1997，Prog.NucleicAcid Res.Molec.Biol.57217-248)。因此，DNA甲基化的存在，尤其是，本发明人在某些细菌种类中发现有细胞-周期调节的腺嘌呤DNA甲基转移酶，表明本领域对于抗生素活性需要提出新的研究目标。发明概要本发明提供了能抑制细菌细胞中的腺嘌呤DNA甲基转移酶的抗生素化合物。本发明的抗生素化合物特别抑制腺嘌呤特异性细菌DNA甲基转移酶，而不抑制细菌的或真核细胞的，尤其是哺乳动物和大多数特定的人的胞嘧啶特异性DNA甲基转移酶。本发明化合物还抑制植物中的腺嘌呤特异性DNA甲基转移酶。这种抗生素化合物也能以药物组合物的形式给动物尤其是人服用，用于治疗细菌病原性疾病、或机会性感染，它是由免疫妥协或衰弱状态的动物(尤其是人)的一种细菌感染的。本发明还提供了制备抗生素化合物及其药物组合物的方法，和治疗上使用所述抗生素的方法。还提供了本发明抗生素化合物和药物组合物的试剂盒和包装形式。本发明特别优选的实施方式体现在下列对某些优选实施方式的更为详细的说明和权利要求书中。


图1和2表示细菌腺嘌呤DNA甲基转移酶的“活性部位”的示意图。
优选实施方式的详细说明本发明提供了作为细菌腺嘌呤DNA甲基转移酶抑制剂的抗生素、尤其是抗细菌的化合物。本发明化合物对任何产生腺嘌呤DNA甲基转移酶的细菌种类具有抗细菌特性、生长抑制特性。这些酶包括属于本领域已知的细菌限制/修饰体系成分的腺嘌呤DNA甲基转移酶、以及细胞周期调节的腺嘌呤DNA甲基转移酶(CcrM)，例如，公开在国际申请公开号W098/12206中的那些，引作参考。因此，本发明特别提供了腺嘌呤DNA甲基转移酶抑制剂。
本发明的腺嘌呤DNA甲基转移酶抑制剂包括一类新的广谱抗生素。大多数细菌种类具有一种DNA甲基转移酶，该转移酶是修饰剂的部分，尤其与限制酶有关，它保持细胞DNA的完整性、同时防卫外来的(特别是大多数病毒的)DNA。另外，某些细菌产生为细菌细胞生长所必需的腺嘌呤DNA甲基转移酶。为本发明抑制剂的抗细菌活性提供适当目标的医学上重要的细菌种类包括革兰氏阳性细菌，包括球菌例如葡萄球菌类和链球菌类；杆菌，包括杆状菌类、棒状杆菌类和梭菌类；细丝状细菌，包括防线菌类和链霉菌类；革兰氏阴性细菌，包括球菌例如奈瑟氏菌属类；杆菌，例如假单胞菌属类、布鲁氏杆菌属类、植物肥大病菌属类、博代氏杆菌属类、埃希氏杆菌属类、志贺氏菌属类、耶尔森氏菌属类、沙门氏菌属类、克雷白氏杆菌属类、水栖菌属类、嗜血杆菌类、巴斯德氏菌属类、和链杆菌属类；螺旋体类、弯曲杆菌属类、弧菌属类；和细胞内的细菌包括立克次氏体属类和衣原体属类。
作为本发明腺嘌呤DNA甲基转移酶抑制剂的目标物的特殊细菌种类包括金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、酿脓链球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、炭疽芽孢杆菌、白喉棒杆菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌、破伤风梭菌、淋病奈瑟氏球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、铜绿假单胞菌、侵肺军团菌、大肠埃希氏菌、鼠疫耶尔森氏菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、胚胎弯曲杆菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、彻白密螺旋体、衣氏放线菌、普氏立克次氏体、立氏立克次氏体、砂眼衣原体、鹦鹉热衣原体、流产布鲁氏菌或根癌土壤杆菌。
本发明腺嘌呤DNA甲基转移酶抑制剂的一个重要特性在于含胞嘧啶特异性DNA甲基转移酶的这些物质的活性水平低。这是因为胞嘧啶特异性DNA甲基转移酶出现在哺乳动物的(尤其是人的)细胞中，并且本发明腺嘌呤DNA甲基转移酶的一个有用特性是对哺乳动物的甲基转移酶很少有或没有抑制活性。这一特性使得这些分子具有本发明所提供的对细菌细胞特异性的有利特性、并且对哺乳动物的(最优选人的)细胞很少有抗生素活性。优选的是，这些化合物对胞嘧啶特异性DNA甲基转移酶的IC50大于500μM。
本发明所提供的抑制化合物可以式I表示 其中R1、R2和R2相同或不同、并且各自为氢、低级烷基、芳基或取代的芳基、低级烷氧基、低级烷氧烷基、或环烷基或环烷基烷氧基，其中每个环烷基基团具有3-7个环原子，其中该环原子中至多两个是或不是选自氧和氮的杂原子，且其中每个烷基、芳基或环烷基基团均可被氢、低级烷基或低级烷氧基、芳基或取代的芳基取代或不取代，并且其中R3可以是核糖、脱氧核糖或其磷酸化衍生物，包括硫代磷酸酯、磷酰胺糖醇和本领域已知的相似衍生物，条件是R1、R2和R3不都是氢，当R3是核糖、脱氧核糖或其磷酸化衍生物时，R1和R2不都是氢。在一个优选的实施方式中，R1为H，R2为(2-二苯基硼酸酯)乙基或二苯基丙基，且R3为H、2-(4-吗啉基)-乙基、3-(N-邻苯二甲酰)-氨基丙基、2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基、或乙基-2-(丙烯酸酯)-甲基。在另外优选的实施方式中，R1为H，R2为(S-高胱氨酸基)甲基，R3为核糖、5’-磷酰基核糖、脱氧核糖或5’-磷酰基脱氧核糖。在其它优选的实施方式中，R2为H，R1和R2均为2-(二苯基甲基)环戊基或2-(二苯基羟基甲基)环戊基。在另外的优选实施方式中，R1为H，R2为丙氨酰基丁基酯、2-羧基亚氨基-2-氨基乙基、2-氨基乙基或单-或二取代的2-氨基乙基、R3为2-(4-吗啉基)-乙基。
本发明还提供了式II化合物 其中键1或2可以是双键或单键，Ar1和Ar2可以相同或不同，并且各自为芳基或杂芳基、或者在一个或多个位置用卤素、硝基、亚硝基、低级烷基、芳基或取代的芳基、低级烷氧基、低级烷氧基烷基、或环烷基或环烷基烷氧基取代的芳基或杂芳基，其中每个环烷基基团具有3-7个环原子，其中该环原子中至多两个是或不是选自硫、氧和氮的杂原子，且其中烷基、芳基或环烷基基团均可被卤素、低级烷基或低级烷氧基、芳基或取代的芳基、卤素、硝基、亚硝基、醛、羧酸、酰胺、酯或硫酸盐取代或不取代，Ra、Rb和Rc相同或不同，并且各自为氢、卤素、硝基、亚硝基、低级烷基、低级烷氧基、低级烷氧基烷基、或环烷基或环烷基烷氧基、或芳基或杂芳基、或在一个或多个位置以低级烷基、芳基或取代的芳基、低级烷氧基、低级烷氧基烷基、或环烷基或环烷基烷氧基取代的芳基或杂芳基，这里每个环烷基基团具有3-7个环原子，其中该环原子中至多两个是或不是选自硫、氧和氮的杂原子，并且其中烷基、芳基或环烷基基团均可被卤素、低级烷基或低级烷氧基、芳基或取代的芳基、卤素、硝基、亚硝基、醛、羧酸、酰胺、酯或硫酸盐取代或不取代，或者其中Ra，Rb和Rc可被芳族的、脂肪族的、杂芳族的、杂脂肪族的环结构或其取代方式连接。
本发明还提供了嘌呤衍生物的组合化学品文库。在一个优选的实施方式中，通过嘌呤环的C6位的氨化将6-氯嘌呤转化为腺嘌呤衍生物；本发明将这些文库叫做“N6库”。在另一个优选的实施方式中，在嘌呤环的N9位衍生为未取代的腺嘌呤或6-氯嘌呤；本发明将这些文库叫做“N9库”。还有一个实施方式中，使C6和N9位均被衍生，用胺或取代的氨基使C6位氨化；本发明将这些文库叫做“N6/N9库”。
在N6或N9库的制备中，在各个“罐”或反应混合物中将起始嘌呤环结构与多种胺或取代的胺(对于N6库)或卤化物(对于N9库)中的每一个反应。因此这些库是以起始原料之间的各个反应产物的集合形式出现。对于N6/N9库，最优选首先衍生N9位、然后在C6位反应。在这些库中，典型的是使用单一卤化物(导致N9位的均匀取代)和多种胺(优选2-5种胺，最优选3种不同的胺)进行反应。由此产生化合物的一种混合物。另外，根据本发明的方法可生产区域异构体(包括N1、N3、和N7异构体)。典型的是，也可产生缺少嘌呤起始原料的反应混合物、以监测卤化物与不同胺之间的反应。
基于对腺嘌呤DNA甲基转移酶的推定活性部位的理解，本发明还提供了称谓“合理设计”的腺嘌呤DNA甲基转移酶抑制剂，如图1所示。正如图中所示，这种酶在DNA链中具有对腺嘌呤残基的结合位点，和S-腺苷蛋氨酸结合位点，这提供了所示的供体甲基基团。所谓的“合理设计”抑制剂在酶的结合位点模仿分子的构型，如图2所示。这些化合物通常包括一种腺嘌呤残基，它含有或不含5’-磷酸盐基团，通过亚甲基桥与高半胱氨酸部分共价连接。
本发明还提供了这样的一类腺嘌呤DNA甲基转移酶抑制剂，它们是硼酸衍生物、优选二苯基或取代的二苯基硼酸的衍生物、最优选其二苯基或取代的二苯基硼酸烷基胺酯。在优选的实施方式中，本发明提供了包括二-(对氟苯基)硼酸8-羟基喹啉(quiniline)酯、二-(对-氯苯基)硼酸8-羟基喹啉酯、二苯基硼酸8-羟基喹啉酯、二-(对-氟苯基)硼酸乙醇胺酯、和二-(对-氯苯基)硼酸乙醇胺酯。
本发明还提供了使用固相化学方法合成的腺嘌呤DNA甲基转移酶抑制剂，最优选使用包括本文所提供的用于在嘌呤环的C6或N9位取代的残基(例如胺或卤化物)的树脂。在优选的实施方式中，提供了这些树脂、由此利用共价键将取代基与树脂共价结合，这种共价键可被特定裂解以便在完成固相合成后从树脂中释放该化合物。优选的是，该取代基存在于含活性基团的树脂上，例如胺或卤化物，易受与树脂接触的嘌呤的影响。反应后，该嘌呤通过取代基与树脂连接，然后可逐步处理反应产物并采用本领域众所周知的方法从树脂中去除。参见，例如Bunin，1998，《组合索引》(THECOMBINATORIAL INDEX)，学院出版社。
在某些情况下，本发明化合物可包含一个或多个的不对称的碳原子，因此这些化合物可以不同的立体异构形式存在。例如这些化合物可以是外消旋物或旋光体形式。在这些情况下，单一的对映体即旋光活性形式可通过不对称合成或通过外消旋物的拆分而获得。例如可采用常规方法如在拆分试剂存在下的结晶作用或使用如手性HPLC柱的色谱法完成外消旋物的拆分。
有利的是，采用上述树脂的固相化学方法可测定取代基是否具有手性或与抗菌活性有关的立体定向性。在这些实施方式中，使用旋光类如氨基酸的外消旋物混合物制备各种化合物用于筛选。由于发现了所得到的化合物具有腺嘌呤DNA甲基转移酶抑制活性，每个立体异构体的旋光纯制剂可用于制备相应的腺嘌呤DNA甲基转移酶抑制化合物的旋光纯异构体，以确定异构体之间的生物活性是否有任何不同。这种方法较可供选择的将外消旋混合物分离成立体异构体成分的其它方法有效。
根据本发明不论推定的腺嘌呤DNA甲基转移酶是如何制备的，对该化合物都分析其腺嘌呤和胞嘧啶特异性DNA甲基转移酶活性。敏感细菌(已知表达一种腺嘌呤DNA甲基转移酶)在抑制化合物存在和不存在的情况下均生长，并且测定了在该化合物存在下的生长抑制的程度与不存在该化合物的生长比较。根据国际申请公开No.W098/12206、通过使用半甲基化DNA、氚化S-腺苷蛋氨酸(C3H3)和纯化腺嘌呤DNA甲基转移酶的滤膜结合放射性检测证实了每个生长抑制化合物的作用机制(即，腺嘌呤DNA甲基转移酶的抑制)。
本发明化合物可以互变异构体溶液的形式存在。当对一种互变异构体形式给出了结构和名称时，则其它互变异构体形式也包括在本发明中。本发明的代表性化合物包括、但不限于本文所公开的化合物及其药学上可接受的酸加成盐和碱加成盐。另外，如果得到了酸加成盐形式的本发明化合物，则可通过碱化该酸式盐溶液获得游离碱。反之，如果产物是游离碱，则可根据从碱化合物中制备酸加成盐的常规方法、通过将游离碱溶解在适当的有机溶剂中并用酸处理该溶液而生产加成盐，尤其是药学上可接受的加成盐。
本发明也包括本发明化合物的酰化前体药物。本领域熟练技术人员都会清楚各种不同的合成方法可用于制备无毒性的本发明化合物的药学上可接受的加成盐和酰化前体药物。
本发明中的“烷基”、“低级烷基”和“C1-C6烷基”意指具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、2-戊基、异戊基、新戊基、己基、2-己基、3-己基和3-甲基戊基。
本发明中的“烷氧基”、“低级烷氧基”和“C1-C6烷氧基”意指具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、2-戊基、异戊氧基、新戊氧基、己氧基、2-己氧基、3-己氧基和3-甲基戊氧基。
本发明中的术语“卤素”意指氟、氯、溴和碘。
本发明中的“环烷基”、例如C3-C7环烷基意指具有3-7个碳原子的环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。在C3-C7环烷基基团中，优选在C5-C7环烷基基团中，形成环的一个或两个碳原子可用诸如硫、氧或氮的杂原子任选代替。这些基团例如有哌啶基、哌嗪基、吗啉基、吡咯烷基、咪唑烷基、噁唑烷基、氮杂全氢庚因基、氧氮杂全氢庚因基、氧杂庚环基、氧氮杂全氢因基、和氧二氮杂全氢因基。具有一个被氮或氧代替的原子数的C3和C4环烷基基团包括氮杂环丙烯基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、和环氧乙烷基。
“芳基”意指具有单环(例如苯基)、多环(例如二苯基)、或多稠合环的芳族碳环基团，其中至少一个是芳族的(例如1，2，3，4-四氢萘基、萘基、蒽基、或菲基)，它可用例如卤素、低级烷基、低级烷氧基、低级烷基硫代、三氟甲基、低级酰氧基、芳基、杂芳基、和羟基任选单、二或三取代。优选的芳基包括苯基和萘基，其中每一个都如本文所述任选取代。
“杂芳基”意指一种或多种含有至少一个至四个选自氮、氧或硫的杂原子的5原、6原或7原环芳环体系。这些杂芳基基团包括，例如噻吩基、呋喃基、噻唑基、咪唑基、(异)噁唑基、吡啶基、嘧啶基、(异)喹啉基、萘啶基、苯并咪唑基、苯并噁唑基。优选的杂芳基为噻唑基、嘧啶基(优选嘧啶-2-基)、和吡啶基。其它优选的杂芳基包括1-咪唑基、2-噻吩基、1-，或2-喹啉基、或2-异喹啉基、1-，或2-四氢异喹啉基、2-或3-呋喃基和2-四氢呋喃基。
从本文的组合库、固相合成、“合理的”药物设计、或常规合成中的任一种方法均提供了本发明的细菌生长抑制的、腺嘌呤DNA甲基转移酶抑制化合物。组合库的构建根据本领域熟练技术人员所知道的方法制备组合库。对于单取代库(N6和N9)，将各个取代基用于单独的反应混合物中以制备本文所述的每个嘌呤衍生物。另一方面，在组合库(本文为N6/N9)中，典型的是将一个位置(尤其是N9)与特定的取代基反应，然后将多个取代基(最优选3个)的混合物用于衍生其它反应位置(尤其是C6)。
在适合于经济地产生足够的试验用产物的规模下进行该反应。优选的是，这些反应并行进行，例如使用96-孔平皿、每一孔具有足够小的体积(100-500μL)以使所需的试剂量最小。使用此类型的反应容器也有利于平行处理和分析，包括这类方法的自动改型。
a.N6库将下列条件用于合成在N-6位取代的腺嘌呤类似物。在一种反应示意图中，将6-氯嘌呤在85℃与伯胺或仲胺的三乙胺和正丁醇溶液反应过夜。或者，将这些试剂在85℃在碳酸钾和二甲基甲酰胺的溶液中反应过夜。此合成过程如反应示意图1所述。反应示意图1 R”和R?为低级烷基、杂原子取代的低级烷基、芳基、杂芳基或取代的芳基或杂芳基，例如下列化合物。在此反应中可使用任何伯胺或仲胺。这些反应中用伯胺或仲胺的优选方案如下组胺二盐酸盐去甲新福林盐酸盐1，2-二氨基丙烷5-氨基-1，3，3-三甲基环己烷甲基胺3-异丙氧基丙基胺二苯基硼酸、乙醇胺酯2-(2-氨基乙基氨基)-乙醇四氢糠胺5-甲基色胺盐酸盐3，3-二苯基丙胺1-(3-氨基丙基)-2-吡咯烷酮(pyrrolidinone)2-(2-氨基乙基)-1-甲基吡咯烷2-(氨基甲基)苯并咪唑二氢-氯水合物2，2，2-三氟乙胺盐酸盐L-肌肽(R)-(-)-1-氨基-2-丙醇2-(1-环己烯基)乙胺4-(三氟甲基)苄胺2，5-二氯戊胺盐酸盐(+/-)-4-氨基-3-羟基丁酸N，N-二甲基1，2-乙二胺3，3-二甲基丁基胺1，4-二氨基-2-丁酮二盐酸盐氨基甲基苯甲酸氨基羟基甲基丙二醇2-(氨基乙基)吡啶氨基丁醇金刚胺氨基己酸N-苄基乙醇胺乙基-6-氨基丁酸酯盐酸盐1，2-乙二胺2-环己-1-烯基乙胺这些胺产生不同的区域异构体，即，对于一些化合物，可将胺加在不同取向的6-氯嘌呤的C6位上，依此含这种胺的反应部分与C6共价结合。然而，这些区域异构体的出现不是有害的，因为它仅仅增加了库中候选化合物的数目。
b.N9库使用下列反应示意图制备N9库。我们发现了反应示意图2的途径2不产生含所有有机卤化物(RivX or R4X)的产物，发现另一可能途径B形成了所试验的全部有机卤化物的产物。在每一可选择的途径中，将有机卤化物与嘌呤(或者腺嘌呤或者6-氯嘌呤)在45℃下在碳酸钾和二甲基甲酰胺中反应过夜。但是，在途径B中，通过在85℃下将首次反应的产物与氢氧化铵反应过夜、使N9-衍生的6-氯嘌呤转化为N9-衍生的腺嘌呤。在相同的反应混合物中顺序进行这两种反应。反应示意图2 Riv为低级烷基、杂原子取代的低级烷基、芳基、杂芳基或取代的芳基或杂芳基，例如下列化合物。
通过HPLC分析途径B的产物、发现它是N-9和N-7取代的腺嘌呤类似物的混合物；在某些反应混合物中也可以是N-1和N-3取代的类似物。如上所讨论的，这些副产物的优点在于它们的存在只是增加了库中的候选分子数目。
任何有机卤化物都可用于此反应中。用于这些反应中的优选有机卤化物如下甲基4-碘丁酸酯1-溴-3-苯基丙烷肉桂基溴化物2-氯乙基膦酸乙基2-(2-氯乙酰氨基)-4-噻唑-醋酸盐4-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐(2-溴乙基)三甲基溴化铵4-氯苯基2-溴乙基醚N-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺(pthalimide)异氰酸2-氯乙基酯2-氯-N，N-二甲基乙酰乙酰胺3-氯-2-羟丙基异丁烯酸酯2-溴-2’-羟基-5’-硝基乙酰苯胺3-(2-溴乙基)吲哚5-氯-2-戊酮乙烯酮缩醇2-氯乙基乙基硫化物3-氯-N-羟基-2，2-二甲基-丙酰胺L-1-对-甲苯磺酰基氨基-2-苯乙基氯甲基酮2-(2-溴乙基)-1，3-二氧戊环乙基2-(溴甲基)丙烯酸酯2-(2-(2-氯乙氧基)乙氧基)乙醇(3-氯丙基)三甲氧硅烷氯霉素4-(氯甲基)苯甲酸溴乙胺盐酸盐表溴醇碘戊烷苄基溴化物c.N6/N9组合库已研究发现上面关于N6和N9库的反应示意图，反应示意图3 使用反应示意图2的途径B的变式制备了在C6氨基和N9位上有取代基的组合库。
于45℃下将6-氯嘌呤与上述有机卤化物在二甲基甲酰胺的碳酸钾溶液中反应过夜。此后，将伯胺或仲胺加入反应混合物中(虽然示意图描述了伯胺、伯或仲胺用于反应示意图3)并通过在85℃反应过夜制备化合物(7)。在此变式中，伯胺或仲胺在该反应中取代了反应示意图2的途径B所示的氢氧化铵。
任何有机卤化物都可用于此反应的第一个步骤。用于这些反应中的优选有机卤化物如下甲基4-碘丁酸酯1-溴-3-苯基丙烷肉桂基溴化物2-氯乙基膦酸乙基2-(2-氯乙酰氨基)-4-噻唑-醋酸盐4-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐(2-溴乙基)三甲基溴化铵4-氯苯基2-溴乙基醚N-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺(pthalimide)2-氯乙基异氰酸酯2-氯-N，N-二甲基乙酰乙酰胺3-氯-2-羟丙基异丁烯酸酯2-溴-2’-羟基-5’-硝基乙酰苯胺3-(2-溴乙基)吲哚5-氯-2-戊酮乙烯酮缩醇2-氯乙基乙基硫化物3-氯-N-羟基-2，2-二甲基-丙酰胺L-1-对-甲苯磺酰基氨基-2-苯乙基氯甲基酮2-(2-溴乙基)-1，3-二氧戊环乙基2-(溴甲基)丙烯酸酯2-(2-(2-氯乙氧基)乙氧基)乙醇(3-氯丙基)三甲氧硅烷氯霉素4-(氯甲基)苯甲酸溴乙胺盐酸盐表溴醇碘戊烷苄基溴化物任何伯胺或仲胺都可用于该反应的第二个步骤。用于这些反应中的优选伯胺或仲胺如下组胺二盐酸盐去甲新福林盐酸盐1，2-二氨基丙烷5-氨基-1，3，3-三甲基环己烷甲基胺3-异丙氧基丙基胺二苯基硼酸、乙醇胺酯2-(2-氨基乙基氨基)-乙醇四氢糠基胺5-甲基色胺盐酸盐3，3-二苯基丙胺1-(3-氨基丙基)-2-吡咯烷酮(pyrrolidinone)2-(2-氨基乙基)-1-甲基吡咯烷2-(氨基甲基)苯并咪唑二氢-氯脱水物2，2，2-三氟乙胺盐酸盐L-肌肽(R)-(-)-1-氨基-2-丙醇2-(1-环己烯基)乙胺4-(三氟甲基)苄胺2，5-二氯戊胺盐酸盐(+/-)-4-氨基-3-羟基丁酸N，N-二甲基1，2-乙二胺3，3-二甲基丁基胺1，4-二氨基-2-丁酮二盐酸盐氨基甲基苯甲酸氨基羟基甲基丙二醇2-(氨基乙基)吡啶氨基丁醇金刚胺氨基己酸N-苄基乙醇胺乙基-6-氨基丁酸酯盐酸盐1，2-乙二胺2-环己-1-烯基乙胺使用任何卤化物和任何胺组合均可重复这种化学过程得到该类型的任何腺嘌呤类似物。
正如对于反应示意图1和2，某些N6胺产生不同的区域异构体，通过与有机卤化物反应可在N1、N3和N7位以及N9位产生取代的嘌呤。
为了在合理时间内得到完全的组合库，在96孔平皿中在某一时刻使用80孔进行该化学过程(1-10列，A-H排)。在每一排将单一卤化物加入反应混合物中，反应示意图3所示的第一部分反应如上所述进行过夜。然后将几组三种不同胺加入1-7列每一列的每个孔中；将8、9和10列的孔中制备为仅含一种胺，尤其是对于那些有与反应混合物中的任何其它的胺反应趋向的类型。第二部分反应进行过夜。结果，大多数孔含有化合物的混合物，每一孔包括一组嘌呤衍生物、其中特定的取代基在N9位、三个不同取代的氨基之一在C6位。根据每个氨基与N9衍生的6-氯嘌呤的反应性，可认为某些反应混合物缺少C6取代基中的一个、两个或所有三个。另外，该反应混合物含有这些产物的不同区域异构体。最终，胺的组合直接与卤化物而不与6-氯嘌呤反应是可能的。测试了作为抗菌混合物的每个反应混合物中的这些产物，特别是腺嘌呤DNA甲基转移酶抑制活性。将具有阳性结果的混合物分离以确定对该结果有意义的化合物。组合库的筛选用体内和体外方法筛选按上述制备的每个库的反应产物。
体内筛选方法包括测定表达细胞生长所必需的腺嘌呤DNA甲基转移酶的细菌细胞生长的抑制作用。这些筛选方法最好不只用一种细菌、以确定具有最广谱的抗菌活性的首要候选物。在某些实施方式中，首先筛选抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的样品的推定抑制剂；新月柄杆菌和枯草芽孢杆菌是优选的例子。用于检测体内腺嘌呤DNA甲基转移酶活性的另外优选的细菌种类包括幽门螺杆菌、根癌土壤杆菌、流产布鲁氏菌和炭疽芽孢杆菌。
在这些测定中，将细菌培养物例如茎菌属在适当的细菌培养基例如蛋白胨酵母膏(PYE)培养基(DIFCO)中生长过夜至饱和。将此培养物的等份稀释至600nm(OD600)时的光密度约为0.05的浓度。这种测定在96孔微量滴定板中进行，尤其是使用在这些板中制备的库。使用这些微量滴定板，将稀释的细菌培养物的等份量(100-500μL)置于96孔的该滴定板的88孔中；剩余的8孔用作阴性(无细菌)对照。8个孔用作阳性(未加入试验化合物)对照。对于库筛选，可将146μL征细菌等分试样用于每个孔中、每孔加有4μL组合库样品。
将库化合物的不同混合物加入每块板的剩余80孔的每个孔中，细胞在37℃生长24小时。使用微板读数器间隔监测细菌的细胞生长以监测细胞生长；可通过测定OD630监测细胞生长。将含生长慢于对照孔的细胞的孔用于确定相应的组合库反应混合物，然后合成并逐个测试以测定抑制化合物的特性。
采用这些方法，确定在＜100pM的估计浓度下抑制细菌的细胞生长的候选化合物。从这些库确定的候选化合物包括6-N-(二苯基硼酸酯)-乙基-腺嘌呤、6-N-(二苯基硼酸酯)-乙基-9-(2-(4-吗啉基)-乙基)-腺嘌呤、6-N-(二苯基硼酸酯)-乙基-9-(3-(N-邻苯二甲酰)-氨基丙基)-腺嘌呤、6-N-(二苯基硼酸酯)-乙基-9-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙基)-腺嘌呤、和6-N-(二苯基硼酸酯)-乙基-9-(乙基-2-丙烯酸酯)-甲基-腺嘌呤。
体外测定是直接在本发明的组合库的反应混合物上、或上述体内筛选测定中所确定的候选化合物上进行。这是两种类型的测定，使用来自新月柄杆菌和枯草芽孢杆菌的纯化CcrM甲基转移酶、或使用市售的细菌的dam甲基酶和dcm甲基酶的制剂。在这些测定中，用含有推定的抑制剂和甲基转移酶的组合库样品在30℃下培养合成的半甲基化45/50 DNA底物(如在Berdis等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 952874-2879中所公开的)，通过加入3H-标记的S-腺苷蛋氨酸(其中放射性同位素标记包括转移的甲基)引发甲基转移酶反应。通过比较加入对照组中的放射性标记的数量检测抑制，对照组的反应是在有或没有组合库样品的情况下进行的；抑制剂导致聚集在DE81滤器上并通过液体闪烁放射性测量的甲基化的、3H-标记DNA的数量减少。
采用这种测定，检测到来自N6库的四种另外的化合物在约500μM的估计浓度时可完全抑制体外DNA甲基化。这些化合物(具有如下所示结构)是腺嘌呤的核糖形式，该腺嘌呤含有二苯基硼酸乙醇胺酯或与腺嘌呤环的C6氨基共价连接的3，3-二苯基异丙基 进一步分析了来自N-6腺嘌呤库的由上面所示结构合成的一种反应混合物并发现在＜50μM时抑制细胞生长。测定了该化合物的Ki约为1μM(假定孔中的最大理论浓度)，该化合物具有下列结构 采用这种测定法测试了从N-9腺嘌呤库选择的反应混合物对腺嘌呤DNA甲基转移酶活性的抑制。发现在合成中所得到的、具有被3-乙基吲哚或2-乙基-1，3-二氧戊环取代的N9的化合物(具有如下结构)在500μM时是腺嘌呤DNA甲基转移酶活性的抑制剂 用dcm甲基转移酶的体外测定基本上按所述的使用来自嗜血杆菌(Hemophilus hemolyticus)(New England Biolabs，Beverly，MA)的市售甲基转移酶和pUC18 DNA作为底物来进行；也可用其它市售dcm甲基转移酶例如来自藤黄节杆菌、解淀粉芽孢杆菌H、埃及嗜血杆菌(Hemophilus aegyptius)、副流感嗜血杆菌、或摩拉克氏菌属类来进行这种测定。在这些测定中，通过检测dcm甲基转移酶很少或无抑制作用证实了腺嘌呤特异性，因此在有或没有组合库混合物或推定腺嘌呤特异性抑制剂的情况下，聚集在DE81滤器上的并通过液体闪烁放射性测量的甲基化3H-标记的DNA的数量是相同的。
或者，用dam甲基酶(例如来自大肠埃希氏杆菌)进行测定，其中的抑制作用是通过聚集在DE81滤器上的并通过液体闪烁放射性测量的甲基化3H-标记的DNA的数量减少来证实的。“合理设计”的腺嘌呤DNA甲基酶抑制剂的合成a.活性部位类似物腺嘌呤DNA甲基转移酶的“合理设计”是根据这样的假设，即该酶的活性部位包含被修饰的腺嘌呤部分以及S-腺苷蛋氨酸甲基供体的特异性结合部位，如图2所示。优选的是在甲基转移酶的活性部位内的化合物，并且特别优选模仿推定的“过渡态”的分子，该过渡态产生酶的甲基转移活性。制备了四种这种过渡态类似物并体外测定腺嘌呤DNA甲基转移酶活性。
合理设计的化合物具有以下结构 1 R1＝OH R2＝H2 R1＝H R2＝H3 R1＝OH R2＝PO34 R1＝H R2＝PO3并用反应示意图6合成该化合物，如下所示。反应示意图6 如上所述测定这些化合物的腺嘌呤DNA甲基转移酶活性。发现这些化合物可抑制具有表1所示的Ki的CcrM。由数据的Dixon图计算化合物2和4的Ki，对于化合物3该数据在抑制剂浓度为0-150μM时测定的、对于化合物4是在0-80μM时测定的。由IC50估计化合物1和2的Ki。
表I化合物1-4的Ki 腺嘌呤DNA甲基转移酶抑制剂的固相合成使用本领域公知的固相合成法也可有效地合成本发明的腺嘌呤DNA甲基转移酶抑制剂，参见Bunin，ibid。
在优选的实施方式中，通过使用较大量的用于筛选的库化合物，固相合成补充了本文所述的组合库合成。这种合成方法具有另外的优点，即易于操作且易于纯化，因为它们通过可被特异性裂解的化学上不稳定的基团与树脂连接。例如，从具有相对低(mM范围)的抑制活性的N6库鉴定化合物(8) 运用这些结果，用固相化学方法修饰抑制剂(8)及其相关类似物(9)开发了第二代库。例如，从终端胺和从N-9位能衍生化合物(8)产生抑制剂，该抑制剂被设计为分别与S-腺苷蛋氨酸(SAM)和DNA结合部位相互作用。将这些衍生物制备为可靶向甲基转移酶活性部位的任何部分N9位的修饰对腺嘌呤结合部位具有特异性、而C6胺的修饰对SAM部位具特异性。
用反应示意图4举例说明进行固相化学过程反应示意图4 这些实验使用了市售的甲氧基苯基甲酸基树脂进行被保护的二胺(11)的还原氨化，其中Rv为氢或CO2P”(这里P’和P”为保护基团)。该反应产生了仲胺(12)。加入6-氯嘌呤产生了与树脂结合的腺嘌呤加合物(13)，这使得剩余的功能基团在树脂上衍生。根据本领域已知的方法可从树脂中除去这些加合物，例如用浓缩形式或5％二氯甲烷溶液的三氟醋酸处理。
反应示意图4举例说明了一种实施方式，其中氨基取代基包含一个手性中心(即，它以一对立体异构体的形式存在)。然而，这些立体异构体中仅有一个可能具有生物活性。为了避免不得不分离本发明化合物的非对映体形式，可以使用下列反应示意图5反应示意图5 这种合成法可用于检测化合物中的腺嘌呤DNA甲基转移酶抑制活性，该化合物包括手性中心的一种外消旋混合物(如天门冬氨酸(16)中所存在的)；用商用纯D-或L-天门冬氨酸可重复这种合成而得到本方法中光学纯的方式，该方法中一种立体异构体较其它方法具有明显多的活性。如反应示意图5所示，用氯甲酸苄酯处理D，L-天门冬氨酸得到N-羧基苄基保护的天门冬氨酸(17)。然后用低聚甲醛将α-羧酸保护为噁唑烷酮(18)。使用二苯基磷酰基叠氮化物、在剩余的β-羧酸上进行库尔提斯重排得到异氰酸酯(19)。这些反应包括本领域已知的合成方法；从此以后该化学过程是新的。使用三甲基甲硅烷基乙醇(20)截留该异氰酸酯(19)得到Teoc(三甲基甲硅烷基乙氧羰基)保护的胺(21)。用甲醇钠使噁唑烷酮开环得到甲酯(22)。然后使用三氟醋酸除去Teoc保护基团得到单保护的二胺(23)。
已经将化合物(23)和(11)(其中Rv＝H，P’＝CBz)分别用于合成树脂结合的腺嘌呤类似物(13)，Rv＝COMe，P’＝CBz，和(13)，Rv＝H，P’＝CBz。本发明化合物的用途本发明还提供了本文所公开的化合物用作药物组合物的实施方式。可以按本来已知的方法制备本发明的药物组合物，例如，通过常规的混合、溶解、制粒、制糖衣丸、磨细、乳化、制胶囊、包埋、或冷冻干燥的方法。
因此可以按常规方法、用一种或多种生理学上可接受的载体配制用于本发明的药物组合物，其中的载体包括在活性化合物加工成制剂时便于使用的赋形剂和辅助剂。合适的制剂是根据所选择的给药途径而定的。
无毒性的药用盐包括酸盐，其中的酸例如盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸、亚磺酸、甲酸、甲苯磺酸、甲磺酸、硝酸、苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、马来酸、氢碘酸、链烷酸如醋酸、HOOC-(CH2)n-CH3(其中n为0-4)，等等。无毒性的药用碱加成盐包括碱盐，其中的碱例如钠、钾、钙、铵等等。本领域熟练技术人员都知道许多无毒性的药学上可接受的加成盐。
用于注射的，可以将本发明化合物配制成适当的水溶液，例如生理性上相容的缓冲液如Hanks溶液、Ringer溶液或生理盐水缓冲液。对于经粘膜的和经皮的给药，在制剂中使用适合于渗透屏障的渗透剂。这些渗透剂是本领域通常已知的。
用于口服给药的，通过将活性化合物与本领域众所周知的药学上可接受的载体结合可很容易地制备这些化合物。这些载体可使本发明化合物配制成片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、泥浆剂、悬浮液等，用于被治疗患者的口服消化。用固体赋形剂可得到口服用的药物制剂，如需要，在加入适合的辅助剂后，可研磨产生的混合物、并处理混合物颗粒，得到片剂或糖锭剂心层。适合的赋形剂，尤其是充填剂例如糖、包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇、或山梨糖醇；纤维素制剂例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐例如藻酸钠。
用适当的包衣装备糖锭剂。出于此目的，可以使用浓缩糖溶液，该溶液可含或不含阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波母胶、聚乙二醇、和/或二氧化钛、漆液、以及适当的有机溶剂和溶剂混合物。可以将染料或色素加入片剂或糖锭剂包衣中用于鉴别或表明活性化合物剂量的不同组合。
可以口服使用的药物制剂包括由明胶制成的推合的胶囊、以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨糖醇制成的封闭软胶囊。推合的胶囊可含有活性成分和填充剂例如乳糖、粘合剂例如淀粉、和/或润滑剂例如滑石或硬脂酸镁、以及任选的稳定剂。在软胶囊中，可以将活性化合物溶解或悬浮在适当的液体中，该液体例如脂肪油、液体石蜡、或液体聚乙二醇。另外，可以加入稳定剂。所有用于口服给药的制剂应该是适合于该给药方法的剂量形式。对于颊部的给药，该组合物可采用按常规方法配制的片剂或锭剂形式。
对于吸入给药，本发明使用的化合物是以从加压袋或雾化器产生的气溶胶喷雾形式可方便地释放，同时使用适当的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适合的气体。在加压气溶胶中，可通过提供一个释放计量数量的活门来确定剂量单位。可以将用于吸入器或吹入器中的胶囊和明胶药筒制备成含有该化合物和适当的粉末基质如乳糖或淀粉的混合粉末。
可以将这些化合物配制成用于通过注射的非肠道给药制剂，例如通过大丸剂注射或连续输入。注射用制剂可以是单位剂型形式，例如，置于安瓿或多剂量容器中，同时加入防腐剂。这些组合物可采用这类形式，例如油性或含水载体中的悬浮液、溶液或乳状液形式，并且可含有调配剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
非肠道给药的药学制剂包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。另外，可以将活性化合物的悬浮液制备成适当的油性注射悬浮液。适合的亲油性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油、或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯、或脂质体。含水注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、或葡聚糖。可选择地，该悬浮液也可含有适当的稳定剂或增加化合物溶解度的试剂以使该制剂为高度浓缩溶液。或者，使用前，活性成分可以是与适当的载体构成的粉末形式，该载体例如无菌无致热物水。也可将这些化合物配制成直肠用制剂形式，例如栓剂或保留性灌肠剂，例如含有常规栓剂基质如可可脂或其它甘油酯。
除了前面所述的制剂外，也可将这些化合物配制成储存制剂。这类长效性制剂可通过植入法(例如皮下或肌内)或通过肌内注射给药。因此，例如可将这类化合物与适当的聚合物或疏水物质(例如作为可接受的油中的乳液)或离子交换树脂一起配制，或用作少量可溶的衍生物，例如少量可溶的盐。
用于本发明疏水的化合物的药用载体是一种助溶剂体系，该体系包括苄基醇、非极性表面活性剂、水可混溶的有机聚合物、和含水相。该助溶剂体系可以是VPD助溶剂体系。VPD是一种3％w/v苄基醇、8％w/v非极性表面活性剂聚山梨酯80和65％w/v聚乙二醇300的溶液，以无水乙醇的体积为基础。该VPD助溶剂体系(VPD5W)由用5％葡萄糖水溶液1∶1稀释的VPD组成。这种助溶剂可很好地溶解疏水化合物，并且在系统给药时本身产生的毒性低。自然，在不破坏助溶剂的溶解度和毒性的情况下，可以显著改变助溶剂的比例。而且，可以改变助溶剂成分的特性例如，可以用其它低毒性非极性表面活性剂代替聚山梨酯80；也可以改变聚乙二醇部分的多少；其它生物相容性聚合物可以代替聚乙二醇，例如聚乙烯基吡咯烷酮；其它糖或多糖可取代葡萄糖。
或者，可使用其它用于疏水药用化合物的传递体系。脂质体和乳状液是众所周知的用于疏水药物的传递赋形剂或载体的例子。也可使用某些有机溶剂例如二甲基亚砜，尽管通常其代价是毒性更大。另外，可以用一种持续释放体系传递这些化合物，例如含该治疗剂的固体疏水聚合物的半渗透基质。已经确立了各种持续释放物质、并且它们是本领域熟练技术人员所公知的。持续释放胶囊可根据化合物的化学特性释放该化合物数周至100天。根据治疗试剂的化学特性和生物学稳定性，可以采用另外措施使蛋白质和核酸稳定。
该药物组合物也可含有适当的固体或凝胶相载体或赋形剂。这些载体或赋形剂的例子包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物如聚乙二醇。
本发明化合物可以是药学上相容的抗衡离子的盐形式。可以用许多酸形成药学上相容的盐，这些酸包括但不限于盐酸、硫酸、醋酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、磷酸、氢溴酸、亚磺酸、甲酸、甲苯磺酸、甲烷磺酸、硝酸、苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、马来酸、氢碘酸、链烷酸如醋酸、HOOC-(CH2)n-CH3(其中n为0-4)，等等。盐趋向于更易溶于相应的游离碱形式的含水溶剂或其它质子溶剂中。无毒性药用碱加成盐包括诸如钠、钾、钙、铵等碱的盐。本领域熟练技术人员都知道许多无毒性的药学上可接受的加成盐。
本发明化合物的药物组合物可通过各种方法配制和给药，包括全身的、局部的或表面的给药。在“Remington’s药物科学”Mack出版公司，Easton，PA中可找到配制和给药的技术。可以选择给药方式使传递至身体各所需靶部位达到最大化。适合的给药途径可以是例如口服的、直肠的、经粘膜的、经皮的、或肠内的给药；非肠道传递包括肌内的、皮下的、髓内的注射，以及鞘内的、直接心室内的、静脉内的、腹膜内的、鼻内的、或眼内的注射。
或者，可以以局部而不是全身的方式给药，例如，通过将化合物直接注射至特定组织，通常以储存或持续释放制剂的形式。
适用于本发明的药物组合物包括以下组合物，其中含有有效量的活性成分以达到其预期的目的。更具体的是，治疗上有效量是指有效预防受治疗的患者现有症状的发展或缓解该症状的剂量。有效量的确定在本领域熟练技术人员的能力范围内，尤其是可根据本文所提供的详细说明来确定。
如本文所公开的，对于用于本发明方法中的任何化合物，最初可从细胞培养测定估计治疗上的有效量。例如，可在动物模型中配制一种剂量以达到循环浓度范围，该范围包括在细胞培养物中所测定的EC50(增加50％的有效量)，即，所试验的化合物达到最大抑制细菌的细胞生长的半数时的浓度。该制剂可用于更准确地确定用于人的剂量。
但是，我们知道任何特殊患者的特定剂量水平是根据各种因素来确定的，包括所用特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状态、性别、饮食、给药时间、给药途径、和排泄速度、药物组合、进行治疗的特定疾病的严重度、以及处方医师的判断。
对于对非人动物的给药，也可将该药物或含该药物的药物组合物加入动物饲料或饮水中。配制含预定剂量药物的动物饲料和饮水产品是很方便的，因此动物可在饮食的同时摄入适当量的药物。大约在被动物消耗之前，立即将含药物的预混合物加入饲料或饮水中也是很方便的。
本发明优选的化合物具有某些药理学特性。这些特性包括但不限于口服生物可利用率、低毒性、低血清蛋白结合和理想的体外和体内半衰期。可以进行试验以预知理想的药理学特性。用于估计生物可利用率的试验包括经过人肠细胞单层(包括Caco-2细胞单层)的运输。可从白蛋白结合试验预知血清蛋白结合。这些试验在OR2vcova等(1996，J.Chroma.B 6771-27)的评论中有描述。化合物半衰期与化合物的剂量频数成反比。从Kuhnz和Gieschen(药物代谢和布置，(1998)volume 26，第1120-1127页)所述的微粒体的半衰期的测定可预知化合物的体外半衰期。
这些化合物毒性和疗效可以根据细胞培养物或实验动物中的标准药学方法确定，例如，确定LD50(50％的致死量)和ED50(50％有效治疗量)。毒性作用和治疗作用之间的剂量比例为治疗指数，可将其表示为LD50与ED50的比例。优选具有高的治疗指数的化合物。从这些细胞培养测定和动物研究所得到的数据可用于配制用于人的剂量范围。这些化合物的剂量优选在循环浓度范围内，它包括很少毒性或没有毒性的ED50。根据所用的剂型和采用的给药途径、该剂量可在此范围内改变。各个医师根据患者的病情可选择准确的制剂、给药途径和剂量(参见例如Fingl等，1975，在“治疗的药理学基础”，Ch.1，p.1)。
剂量和用药时间间隔可以逐个调节以便使活性部分的血浆足以保持细菌的细胞生长抑制作用的水平。用于全身给药的可耐受剂量为100-2000mg/天。根据患者的体表面积确定的有用剂量范围为50-910mg/m2/天。有用的平均血浆水平应保持在0.1-1000μM。在局部给药或选择性吸收的情况下，化合物的有效局部浓度与血浆浓度无关。
本发明化合物是感染植物、动物和人的细菌中的细胞处理过程的调节剂。本发明的腺嘌呤DNA甲基转移酶抑制化合物的药物组合物可用作抗生素治疗动物和人的疾病，包括但不限于放线菌病、炭疽、菌痢、肉毒中毒、布鲁氏菌病、蜂窝织炎、霍乱、结膜炎、膀胱炎、白喉、细菌性心内膜炎、会厌炎、胃肠炎、鼻疽、淋病、Legionnaire氏病、钩端螺旋体病、细菌性脑膜炎、鼠疫、细菌性肺炎、产后的败血症、风湿热、岩石山斑点热(RockyMountain spotted fever)、猩红热、链球菌咽炎、梅毒、破伤风、兔热病、伤寒热、斑疹伤寒和百日咳。
在本申请说明书中的所有文章和参考资料包括专利，均作为参考文献引用。
下列实施例是为了举例说明而不是要限定本发明的范围。本发明并不限定于所举例的实施方式范围内，该实施方式旨在作为本发明个别的举例说明。实际上，除本文所示和所述之外的本发明的各种改变，对于本领域熟练技术人员来说都可从说明书和附图中显而易见。当然这些改变应在所附的权利要求的范围内。
实施例1溶液相化学库的制备在96孔微滴定板中按如下方法制备上述溶液相组合库。
在1-7列的每个孔中加入K2CO3(7-10mg)、然后加入DMF(140μL)和6-氯嘌呤(30μL 0.5M DMF溶液)。在每一排中加入卤化物(15μL 1M DMF溶液)，该卤化物选自本文所公开的卤化物名单。
在8-10列的每个孔中加入K2CO3(3-5mg)、然后加入DMF(180μL)和6-氯嘌呤(10μL的0.5M DMF溶液)。在每一排中加入卤化物(5μL的1M DMF溶液)，该卤化物选自本文所公开的卤化物名单。
将微滴定板加热至45℃并反应过夜。将反应物冷却至室温、并按如下进行第二次合成反应。
在1-7列的每个孔中加入3种不同的胺(每孔5μL的1M DMF溶液)，此胺选自本文所公开的胺的名单。
在8-10列的每个孔中加入一种胺(每孔5μL的1M DMF溶液)，此胺选自本文所公开的胺的名单。
将微滴定板加热至85℃并反应过夜。将反应物冷却至室温，分别收集每一孔并将溶液的最终体积调节为300μL(代替丢失的溶剂以蒸发)。
然后用本文所公开的体内细菌生长测定法对这些反应中所产生的化合物进行测试。
实施例2腺嘌呤DNA甲基转移酶抑制剂的制备筛选本发明组合库的腺嘌呤DNA甲基转移酶上述的抑制活性。根据下列反应示意图，将具有甲基转移酶抑制活性和含有与二苯基硼酸乙醇胺酯共价连接的C6氨基的化合物用作制备相关类似物的基本化合物 条件i)R-X，DMF，K2CO3，45-95℃；ii)Pb2BOCH2CH2NH2，DMF，K2CO3，90-95℃具体说，于室温和氩气下将6-氯嘌呤(1)溶解在干DMF(约0.3mmol/mL)中。加入碳酸钾(K2CO3；2-3当量)、然后加入1当量烷基卤化物(R-X)。将反应物加热至45度或95度(如果卤化物在较低温度下不反应)并搅拌18小时。此时间后，进行薄层色谱法(用二氯甲烷中的2％-5％甲醇作溶剂)并证实在反应混合物中很少或没有剩余的起始物质。将该反应物冷却至室温、通过过滤除去固体并用干二甲基甲酰胺(DMF)洗涤。得到滤液、并在真空除去任何剩余的DMF得到油状的粗制品。通过硅胶上的柱色谱法(用二氯甲烷中的2％-5％甲醇作溶剂)纯化该产品。在组合的N-9和N-7区域异构体洗脱为混合物之前，将N-9区域异构体洗脱为纯的部分。混合含N-9异构体的部分并在真空除去溶剂得到储藏时固化的固体或油状中间产物2b-2e。
按如下制备终化合物。于室温和氩气下将6-绿嘌呤(1)或9-烷基-6-氯嘌呤(2b-2e)溶解在干DMF(0.03-0.5mmol/mL)中。加入碳酸钾(K2CO3；2-3当量)、然后加入1当量二苯基硼酸乙醇胺酯。将反应物加热至90-95℃并搅拌18小时。使该混合物冷却至室温并如上所述通过过滤除去固体。用1H-NMR、13C-NMR、和两维NMR分光镜法如HMQC和HMBC确定这些化合物的结构。
或者，于室温在氩气下将6-氯嘌呤(1)或N-9烷基-6-氯嘌呤(2b-2e)溶解在1-丁醇(0.1mmol/mL)中。加入3当量二异丙基乙胺，然后加入1.2当量烷基卤化物。将此反应混合物加热至110℃并搅拌18小时。然后将该反应物冷却至室温并在真空除去溶剂。通过硅胶上的柱色谱法(用2％-5％甲醇的二氯甲烷溶液作溶剂)纯化残余物。收集产物部分并在真空除去溶剂而留下白色固体。
本领域人员都知道起始物质二苯基硼酸乙醇胺酯的结构是环状的，硼是四面体的结构。因此抑制本发明化合物的腺嘌呤DNA甲基转移酶的环状和线性类似物可有利于开发另外的抑制化合物。 对于体内测定，将含剩余的DMF或二甲基亚砜(DMSO)的未纯化制剂稀释至16.7mM并直接用作粗混合物。使用各种细菌种类基本上按上述进行细菌的细胞生长抑制的体内测定。在这些测定中化合物(3a)-(3e)显示下列结果新月柄杆菌化合物3a-IC50＜25μM化合物3b-IC50＜25μM化合物3c-IC50＜25μM化合物3d-IC50＜25μM化合物3e-IC50＜25μM流产布鲁氏菌化合物3a-12小时后几乎全部细胞死亡-100μM化合物3b-12小时后全部细胞死亡-100μM化合物3c-从开始细胞生长被抑制-100μM化合物3d-从开始细胞生长被抑制-100μM化合物3e-从开始细胞生长被抑制-100μM幽门螺杆菌化合物3a-IC50＜25μM化合物3b-IC50＜25μM化合物3c-IC50在25-100μM之间化合物3d-IC50在25-100μM之间化合物3e-IC50＝25μM根癌土壤杆菌化合物3a-IC50＞100μM化合物3b-IC50＝25μM化合物3c-IC50＝25μM化合物3d-IC50＜＜25μM化合物3e-IC50＜＜25Mm枯草芽孢杆菌化合物3a-IC50在10-50μM之间化合物3b-IC50在1-10μM之间化合物3c-IC50在1-10μM之间化合物3d-IC50在10-50μM之间化合物3e-未测另外，使用体外腺嘌呤DNA甲基转移酶抑制测定法得到下列结果CcrM化合物3a-在100μM时全部抑制化合物3b-在100μM时全部抑制化合物3c-在100μM时全部抑制化合物3d-在100μM时全部抑制化合物3e-在100μM时全部抑制dam甲基酶(大肠杆菌)化合物3a-在100μM时全部抑制化合物3b-在100μM时全部抑制化合物3c-在100μM时全部抑制化合物3d-在100μM时全部抑制化合物3e-在100μM时全部抑制dcm甲基转移酶(HhaI)化合物3a-在500μM时根本无抑制化合物3b-在500μM时根本无抑制化合物3c-在500μM时根本无抑制化合物3d-在500μM时根本无抑制化合物3e-在500μM时根本无抑制这些结果证实了化合物(3a)-(3e)是腺嘌呤特异性DNA甲基转移酶、没有可检测的dcm交叉反应性。
实施例3腺嘌呤DNA甲基转移酶抑制剂的制备通过优化上述组合库筛选期间所发现的先导物而开发了另外的腺嘌呤DNA甲基转移酶抑制剂。1.6-(2-二苯基甲基环戊基氨基)嘌呤(化合物73)将6-氯嘌呤与正丁醇和2当量二异丙基乙胺(N(iPr)2Et)中的S-(-)-2-(二苯基甲基)-吡咯烷混合。将反应加热至105℃并令其反应24小时。在真空下从反应混合物除去溶剂、并通过硅胶色谱法纯化粗制品。2.6-(2-二苯基羟基甲基环戊基氨基)嘌呤(化合物71)将6-氯嘌呤在正丁醇和2当量N(iPr)2Et中的R-(+)-α，α-二苯基-2-吡咯烷甲醇混合。将反应加热至95℃并令其反应24小时。在真空下从反应混合物除去溶剂、并通过硅胶色谱法纯化粗制品。 3.2-二苯基吡咯(化合物76)将2-吡咯烷酮(pyrrolidinone)与苯中的二甲基硫酸盐混合并回流3小时。在包括蒸馏的纯化后，在室温下将所得到的2-甲基亚氨基酯吡咯烷在干醚中与过量的苯氧化锂(PhLi)混合18小时得到标题化合物。 4.6-氨基-4(2-二苯基硼酸酯)乙基氨基嘧啶(化合物III168)用阮内镍(RaNi)的氨水溶液处理4-氨基-6-羟基-2-硫代嘧啶并加热回流2小时。纯化得到4-氨基-6-羟基嘧啶，将它与氯氧化磷和N，N-二乙基苯胺混合、加热回流4小时得到4-氨基-6-氯嘧啶。将该产物与二异丙基乙胺的甲苯溶液中的二异丙基硼酸乙醇酯混合、并加热回流过夜产生标题化合物。 5.4-氨基-5(2-二苯基硼酸酯乙基亚氨基酯)咪唑(化合物III170)将4-氨基-5-咪唑羧酰胺盐酸盐在氯氧化磷中加热回流3.5小时，纯化后得到4-氨基-5-腈咪唑。将此产物再悬浮在HCl饱和的乙醇中过夜并纯化得到4-氨基-5-乙基亚氨基酯咪唑盐酸盐。将此盐酸盐与四氢呋喃(THF)中的二苯基硼酸乙醇胺酯混合过夜得到标题化合物。 实施例4第二代库根据下列化合物制备两种“第二代库” 从母化合物78按如下所示构建第一个第二代库(“库A”)。在加热器-摇动器中在25℃将化合物78与甲醇中的1当量醛(或酮)混合。重复反应。反应1小时后，加入BH3-树脂并将混合物反应过夜。在一组反应中加入第二当量的下列一种醛环己烷羧乙醛；3-糠醛；1-甲基-2-吡咯羧乙醛；氢化肉桂醛；4-吡啶羧乙醛；2-苯基丙酰基(proprion)乙醛；苯乙醛；间-茴香醛；庚醛；3-硝基苯甲醛；3-苯基丁醛；3-吡啶基乙醛N-氧化物；ethyl leveulinate；乙基-2-乙基乙酰丙酮；乙基-4-丁酸乙酰酯；丙酰(proprionyl)醋酸乙酯；乙基2-苄基乙酰丙酮；1-苯基-2-戊酮；1-乙酯基-4-哌啶酮；N-丙酮基邻苯二甲酰亚胺；2-氟苯基丙酮；4-(3-氧丁基)醋酸苯酯。
然后使整个板反应24小时。所产生的化合物或者是单烷基化的(R＝H，R’＝烷基、芳基)、或者是二烷基化的(R＝R’＝烷基或芳基)。
在三甲基铝(AlMe3)存在下在二氯甲烷中于50℃下将母化合物III142与用于构建N6库且如上所述的胺反应过夜来构建其它的第二代库(“库B”)。通过蒸发除去溶剂，将残余物溶解在乙腈中、并用三甲基甲硅烷基碘化物处理过夜。通过加入甲醇、蒸发溶剂、将残余物分配在醚和水/醋酸(7∶3)之间并萃取产物成含水层，逐步完成反应。
第二代库A 第二代库B 实施例5基于二苯基硼酸酯的化合物根据上述结果，本发明的数个腺嘌呤DNA甲基转移酶抑制剂中的一个共同成分是二苯基硼酸酯。因此，按如下制备数个基于该酯的另外的化合物。这些化合物具有如下结构 这些化合物的一般合成如反应示意图7所示。1.硼酸的合成(化合物8).
在氩气下将二氯硼烷二甲基硫化物复合体(0.5-2mL)溶解在四氢呋喃或二醚中、并冷却至-78℃。将在四氢呋喃、二乙醚、环己烷或这些溶剂的混合物中的适当的苯基格利雅试剂(2摩尔当量)逐滴加入冷的反应物中。令该反应物加温至室温并搅拌过夜。在反应物中加入二乙醚并通过缓慢加入1N盐酸使反应物水解。分离各层并用饱和含水NaCI洗涤有机层。将有机层经硫酸镁(MgSO4)干燥、过滤、并在真空下除去溶剂得到澄清油状的粗制品。将标题化合物的这种粗制剂直接用于合成的下一阶段。反应示意图7 其中反应条件为i)四氢呋喃(THF)或乙醚(Et2O)，-78℃至室温过夜；ii)EtOH，8-羟基喹啉，室温；iii)EtOH，2-氨基乙醇，室温。
每个苯环上X可代表5个以下取代基，它们可各自为氢、低级烷基、芳基或取代的芳基、低级烷氧基、低级烷氧基烷基、或环烷基或环烷基烷氧基，这里每个环烷基基团具有3-7个原子数，环烷基原子数中有两个可以任选是选自氧和氮的杂原子，并且烷基、芳基或环烷基基团的任何原子可被卤素、低级烷基或低级烷氧基、芳基或取代的芳基、卤素、硝基、亚硝基、醛、羧酸、酯、酰胺、或硫酸盐任选取代。2.硼酸8-羟基喹啉酯(化合物9)的合成将粗制硼酸(8)溶解在0.05-5mL乙醇中并用乙醇中1-2当量的1M 8-羟基喹啉处理。将从溶液中沉淀出的产物或溶液浓缩并进行结晶，一旦固体形成、则通过过滤收集产物并用乙醇洗涤。3.硼酸乙醇胺酯(化合物10)的合成将粗制硼酸(8)溶解在0.05-5mL乙醇中并用乙醇中1-2当量的1M乙醇胺处理。将从溶液中沉淀出的产物或溶液浓缩并进行结晶，一旦固体形成、则通过过滤收集产物并用乙醇洗涤。
使用本发明的体内测定法、用新月柄杆菌对如上所述制备的化合物(1)-(5)进行测试，对化合物(1)、(2)、(4)和(5)已经测试了其对枯草芽孢杆菌的细胞生长抑制作用。IC50值如下表II所示。
表II

这些化合物具有优越的物理特性，并且被分离为能适应大规模生产的纯的稳定的固体。本发明的腺嘌呤DNA甲基转移酶抑制剂的另外的特殊实施方式包括具有下列这些附加特征的相关化合物1)在苯环上、在邻位、间位和对位中任一位或其组合上含有不同取代基的类似物，包括稠环和取代的稠环；2)在一个或两个苯基基团上具有各种环大小、取代的杂环、稠杂环和取代稠杂环的芳杂环的类似物；3)利用上述1)和2)的芳族体系的组合、具有两个与硼原子结合的不相同芳环的类似物；4)用在任何可能位置含不同的取代基的喹啉(9)制备的类似物、或者包括在任何可能位置含一个或多个杂原子的稠杂芳环或在任何可能位置含一个或多个杂原子且在任何可能位置含不同取代基的稠杂芳环的结构类似物；以及5)在(10)的2-氨基乙醇的亚乙基的C-1和C-2位中的任一或两者上具有取代基的类似物。
应该认识到前面的说明书着重公开了本发明的某些特定实施方式及对其所做的等同改变或替换都是在所附权利要求书所述的构思和范围内。

1.下式的化合物或其药学上可接受的盐， 其中R1、R2和R3相同或不同，并且各自为氢、低级烷基、芳基或取代的芳基、低级烷氧基、低级烷氧烷基、或环烷基或环烷基烷氧基，其中每个环烷基基团具有3-7个环原子，其中该环原子中至多两个是或不是选自氧和氮的杂原子，且其中每个烷基、芳基或环烷基基团均可被氢、低级烷基或低级烷氧基、芳基或取代的芳基取代或不取代，并且其中R3可以是核糖、脱氧核糖或其磷酸化衍生物，其中R1，R2，和R3不都是氢，且其中当R3是核糖、脱氧核糖或其磷酸化衍生物，R1或R2之一不是氢。
2.根据权利要求1的化合物，其中R1和R2相同或不同并且各自为氢、组胺二盐酸盐、去甲苯福林盐酸盐、1，2-二氨基丙烷、5-氨基-1，3，3-三甲基环己烷甲基-胺、3-异丙氧基丙基胺、二苯基硼酸、乙醇胺酯、2-(2-氨基乙基氨基)-乙醇、四氢糠胺、5-甲基色胺盐酸盐、3，3-二苯基丙基胺、1-(3-氨基丙基)-2-吡咯烷酮、2-(2-氨基乙基)-1-甲基吡咯烷、2-(氨基甲基)苯并咪唑二氢-氯化水合物、2，2，2-三氟乙胺盐酸盐、L-肌肽、(R)-(-)-1-氨基-2-丙醇、2-(1-环己烯基)乙胺、4-(三氟甲基)苄胺、2，5-二氯戊胺盐酸盐、(+/-)-4-氨基-3-羟丁酸、N，N-二甲基1，2-乙二胺、3，3-二甲基丁胺、1，4-二氨基-2-丁酮二盐酸盐、氨基甲基苯甲酸、氨基羟基甲基丙二醇、2-(氨基乙基)吡啶、氨基丁醇、金刚胺、氨基己酸、N-苄基乙醇胺、乙基-6-氨基丁酸盐盐酸盐、1，2-乙二胺、或2-环己-1-烯基乙胺。
3.根据权利要求1的化合物，其中R3为甲基4-碘丁酸酯、1-溴-3-苯基丙烷、肉桂基溴化物、2-氯乙基膦酸、乙基2-(2-氯乙酰氨基)-4-噻唑-醋酸盐、4-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐、(2-溴乙基)三甲基溴化铵、4-氯苯基2-溴乙醚、N-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺、异氰酸2-氯乙酯、2-氯-N，N-二甲基乙酰乙酰胺、3-氯-2-羟基丙基异丁烯酸酯、2-溴-2’-羟基-5’-硝基乙酰苯胺、3-(2-溴乙基)吲哚、5-氯-2-戊酮乙烯酮缩醇、2-氯乙基乙基硫化物、3-氯-N-