人蛋白赖氨酸甲基转移酶set9融合蛋白的制备方法
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专利名称:人蛋白赖氨酸甲基转移酶set9融合蛋白的制备方法SET9又称组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶、组蛋白H3-K4甲基转移酶,是一种蛋白修饰酶,能将S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine, SAM)所供甲基转移至革巴蛋白赖氨酸残基上使其甲基化,引起蛋白质结构和功能改变并产生相关生物效应。SET9全长为366个氨基酸,C端含保守的SET结构域,分子量大约为50KD,其表达基因位于第四号染色体4q28。SET9能使组蛋白H3第4位赖氨酸(lysine 4 of histone 3,H3K4)单甲基化,在调控染色质结构和基因表达中起着至关重要的作用。此外,更重要的是SET9能使p53与TAF10等一些转录因子、肿瘤抑制因子、膜相关受体等非组蛋白单甲基化,调节蛋白稳定性与转录活性(表I)。SET9对非组蛋白赖氨酸的甲基化作用会产生复杂的生物学效应,如甲基化P53的K372位点可增加p53稳定性及其对靶基因的活化作用;甲基化衍生因子(eIongation factor,E2FI)的K185位点可抑制该蛋白的乙酰化和磷酸化,并激活蛋白泛素化,抑制凋亡;还可使成视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein, pRb)、雌激素受体a (estrogen receptor a,ER a )等蛋白甲基化,影响它们的生物学效应。研究表明乳腺癌细胞中SET9下调会导致雌激素(ER)在其靶基因部位的募集反应受损,从而减弱ER驱动的转录反应。可见SET9介导的非组蛋白赖氨酸甲基化作用异常与肿瘤或其他疾病发生机制有关。因此,SET9是一种非常有前景的生物化学蛋白修饰酶,与染色体结构维持、细胞周期及凋亡调控等有关。SET9及其底物可作为肿瘤等疾病诊疗中的标志物或靶点,促进有关试剂或新药的研发。目前提纯SET9蛋白主要通过组氨酸(His)标签或GST标签进行融合蛋白表达与纯化。组氨酸(His)标签的融合蛋白表达存在不可溶性问题,纯化时需要变性,因此,只有经过复性过程才能获得活性蛋白,从而增加了提取活性SET9蛋白的困难。一般经GST标签提纯的蛋白都用于抗体制备、蛋白检测、ELISA等试验。随着科学研究的深入,对具有蛋白赖氨酸甲基转移酶活性的SET9蛋白的需求会越发迫切。表I现有报道关于SET9单甲基化的非组蛋白底物与涉及的生物学功能人蛋白赖氨酸甲基转移酶SET9融合蛋白的制备方法,将SET9基因片段连接至含可编码谷胱甘肽S-转移酶读码框架的载体质粒,再转化宿主菌,宿主菌经诱导表达后通过GlutathioneAgarose吸附柱纯化。利用大肠杆菌BL21(DE3)表达菌的T7RNA聚合酶基因可受IPTG诱导表达、该菌没有膜结合性蛋白分解酶活性则可抑制表达的融合蛋白质分解等优点,本发明将重组载体pGEX-SET9转入BL21(DE3)表达菌,成功地构建了GST-SET9融合蛋白的原核表达系统,并提纯了高活性的融合蛋白。可用于非组蛋白甲基化效应、SET9抗体开发等实验室研究。
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