一种高吸附镉的丝状真菌淡紫拟青霉xla及制备方法和应用的制作方法[0002]20世纪以来，工业化的发展对人类社会进步起到巨大的推动作用，但同时也给水体和土壤带来了严重的环境污染，尤其是重金属污染，进而影响到人类健康(Hsu etal., 2006; Beyer, 1985)，一系列的重金属中毒、重金属超标事件，例如镉污染造成的日本“痛痛病”、汞污染引起的水俣病等(Luigi C.，et al，2006 ;马小凡等，2004)。重金属污染是目前最主要的环境问题之一。[0003]镉(Cd)是一种生物体 非必需金属元素，在低浓度条件下便能对细胞产生毒性。由于人类的活动，镉通过各种途径进入环境中，造成严重的镉污染。镉在环境中和生物体内具有稳定积累和不易消除的特点。镉迁移转化的最大特点在于不易被生物体分解转化并排出体外，不易随水移动，而是沿食物链逐级往上传递并通过富集作用使人体慢性中毒。1992年镉的化合物被国际癌症研究中心(IARC)确认为IA级致癌物；被美国毒性物质管理委员会(ATSDR)列为第六位危害人体健康的有毒物质(黄宝圣，2005)。目前，寻找土壤和水体的镉污染治理策略成为一个巨大的挑战(BastaN.T.，et al.2001;McGregorD B, et al.，2000)。[0004]对重金属污染的土壤及水体的处理方法有化学法、离子交换法、吸附法、电解法、化学氧化还原法、电化学处理法、反渗透法和膜分离法等，但均由于技术繁琐，易导致二次污染和处理成本相对过高等限制因素无法投入实际生产应用中(Kratochvil D, VoleskyB,1998)。生物吸附法修复重金属污染土壤及水体是指通过生物体与重金属颗粒间的相互作用来减轻重金属对于环境的危害(Volesky B.，1999)。在生物修复方法所用的生物材料中，真菌材料具有生物量大、重金属吸附容量大、吸附后金属易回收等众多优点(高伟等，2005; Bhainsa K.C., Souza S.F., 1999; Sud D, et al., 2008 ；ffang J, ChenC,2006;Goksungur Y, et al.，2005)。而微生物代谢物质如胞外多糖，几丁质等也参与重金属的吸附与固定化过程(May H.et al, 1993; Gadd GM, White C, 1993; Brim H., etal, 2000;Galun Μ.，et al, 1983) 0这主要是基于微生物细胞表面的功能基团，如羟基，羰基，巯基和胺基基团等，这些功能基团能够与重金属阳离子有效地结合，从而具有对重金属的吸附效应(VoleSky，B.，Holan, Z.R, 1995)。真菌对重金属的生物吸附是污染治理研究和运用的热点。[0005]目前，随着社会经济的发展，重金属污染日益严重，建立经济，高效的重金属污染修复体系显得尤为重要。微生物种类繁多，繁殖迅速；吸附后的微生物细胞还可通过化学试剂解吸附，来回收生物材料。同时，用于重金属修复的微生物可以对某些重金属吸收、沉淀、氧化和还原作用减少重金属浓度，从而降低毒性。本发明利用微生物在受到自然环境重金属胁迫而产生耐性这个特点，对抗镉微生物进行筛选，获得并提供了可用于生物治理重金属污染的高效耐受菌株。同时，本发明将该菌株用于处理重金属污染水体，发现该菌株具有良好的处理能力和运用潜力。本发明旨在为微生物修复重金属污染提供对多种重金属具有相对高吸附能力且性能稳定的抗性菌株。

[0006]本发明的目的是在于提供了一种丝状真菌淡紫拟青霉XLA。本发明从用于重金属镉污染修复的盆栽试验土样中分离了一株丝状真菌。该菌株在实验室条件下能显著吸附重金属镉；同时，本发明还涉及菌活性状态对吸附的影响以及该菌在重金属污染水体修复方面的实际应用，结果显示本发明所提供的丝状真菌在重金属污染的土壤和水体治理和商业化应用上均具有广阔的前景。
[0007]本发明的另一个目的是在于提供了一种丝状真菌淡紫拟青霉XLA的制备方法，该制备方法简便快捷，所获取的菌体具有高吸附重金属的能力，且吸附过程不受营养条件的限制。
[0008]本发明再一个目的是在于提供了一种丝状真菌淡紫拟青霉XLA在重金属镉污染治理中的应用。丝状真菌XLA活菌和死菌都可以高效的吸附移除重金属污水中的重金属镉，达到治理重金属污染的目的，有效地降低生产成本，简化处理工艺，从而为大规模制备重金属污染废水净水剂提供了可能，具备商业化发展的潜力。
[0009]为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施:
[0010]一种丝状真菌淡紫拟青霉XLA的制备方法，其步骤是分离、纯化和复筛。具体过程为:
[0011]A、称取重金属镉含量为50mg/Kg的用于重金属修复的盆栽试验土样IOg于90ml带有5个0.5mm玻璃珠的无菌水中，于28°C恒温摇床上200r/min振荡30min,静置Imin后，取上清液进行10倍系列稀释；
[0012]B、将IOOyL不同稀释倍数的稀释液涂布在含有60mM镉的马丁平板上，静止片刻，倒置于28°C恒温培养箱中培养5d ；
[0013]C、将平板上生长的微生物进行划线分离纯化，然后重新涂布到上述含镉的马丁平板上进行培养；
[0014]D、经10次分离筛选后，保存对镉具有稳定抗性能力的菌株，在PDA斜面上进行保存，备用。
[0015]依据上述方法， 申请人:从用于重金属镉污染修复的盆栽试验土样中，利用真菌选择性培养基进行筛选，分离得到了一株能在含60mM镉的马丁孟加拉红培养基上生长的丝状真菌， 申请人:将其命名为XLA。经鉴定该丝状真菌为淡紫拟青霉(PaecilomycesIilacinus)，该菌株的保存及产孢子培养基为PDA培养基。 申请人:于2012年4月24日将该菌株送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，地址:中国武汉武汉大学，保藏编号=CCTCC NO:M2012135，分类命名:淡紫拟青霉XLA Paecilomyceslilacinus XLA0
[0016]丝状真菌淡紫拟青霉XLA的特性如下:
[0017]①生物学特性:丝状真菌，专性需氧，最适生长温度20°C-28°C，生长较迅速，但是在35°C以上产孢能力下降，在PDA培养基中产孢量大，菌落呈现毡状，中部隆起，培养早期菌落呈现白色，后期产孢子变为酒红色。
[0018]②遗传学特性:结合形态学观察和分子生物鉴定确认该菌为淡紫拟青霉菌(Paecilomyces lilacinus)。
[0019]③培养条件:保存该真菌及获取其孢子时所使用的培养基为PDA培养基；分离筛选该真菌所用的为马丁培养基:葡萄糖10g，蛋白胨5g，MgSO4 0.5g，蒸馏水1000ml，pH自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。用于吸附实验及测试其对重金属耐受性用矿物盐培养基(MM):葡萄糖20g,硫酸铵5g,磷酸二氢钾15g,无水硫酸镁0.6g,无水氯化韩0.6g,七水硫酸亚铁0.005g, 一水硫酸锰0.0016g,七水硫酸锌0.0014g,氯化钴0.002g,蒸馏水IOOOml溶解，调节pH至5.5，115°C高压蒸汽灭菌15min。培养该菌可以孢子的形式进行接种:以2%体积比的吐温-80冲洗PDA斜面上的孢子，然后用0.2%体积比的吐温-80稀释至需要的孢子浓度后接种，然后进行28°C，150r/min摇瓶培养。
[0020]④功能特性:具有对多种重金属的耐受性。丝状真菌XLA对不同重金属离子的耐受性检测结果为:液体培养条件下对镉(Cd2+)130mM、钴(Co2+)45mM、铜(Cu2+)80mM、锌(Zn2+) 220mM、铬(Cr3+)60mM、铬(Cr6+)5mM、镍(Ni2+) 24mM等重金属有较好的耐受性，固体培养条件下则分别为 265mM、50mM、80mM、145mM、35mM、4mM、16mM。
[0021]一种丝状真菌淡紫拟青霉XLA在重金属污染水体及土壤的生物修复中的应用，其步骤是:
[0022](I)静态镉的吸附:
[0023]将菌株XLA在PDA培养基上培养4d产生大量孢子，制备孢子悬液，然后按照1:100的比例接种到200毫升的新鲜矿物盐培养基中培养5d，过滤收集菌体并进行真空冷冻干燥处理后，将菌体打散至松散状态，然后进行镉的吸附实验。
[0024]将0.002g冻干菌体 加入至含有20mL镉溶液的50mL离心管中进行，置于28°C恒温摇床中，150r/min反应240min，反应过程中分别在0、5、15、30、45、60、120、180和240min取100 μ L上清液，稀释后通过石墨炉原子吸收分光光度计进行镉含量分析。
[0025](2)吸附-解吸附实验:
[0026]选用冻干处理后的菌体进行镉的吸附实验。具体吸附实验条件:镉溶液浓度为500mg/L、pH 4.0、0.lg/L冻干菌体充分吸附4h，吸附饱和后上清取样，样品稀释后用石墨炉原子吸收分光光度计测定吸附前后上清液中镉的含量，计算吸附到菌体表面的镉的含量。过滤收集吸附后样品并进行冷冻干燥。分别选取去离子水、0.lmol/L硝酸、0.lmol/L盐酸、2%质量体积比的EDTA、0.lmol/L氢氧化钠作为解吸附剂，以0.0lg吸附样品/20ml解吸附剂的体系反应4h，选择最适解吸附剂，并对最适解吸附剂作用下解吸附动力学进行研究。
[0027](3)菌株的活性状态对镉吸附的影响:
[0028]将菌株XLA在PDA培养基活化4天后产生的孢子收集制成悬液，然后按照1:100的比例接种到200ml的新鲜矿物盐培养基中培养5d，过滤收集菌体(培养收集活性状态菌体的三角瓶为底部带棱的三角瓶，培养收集死菌的三角瓶为普通三角瓶)。活菌收集后尽量除去水分，取一小部分80°C烘干至恒重测的菌体含水量。死菌收集后进行冷冻干燥一高压蒸汽灭菌一冷冻干燥一研磨后过300 μ m孔径的筛子制成死菌粉末。分别对两种状态的菌进行镉吸附实验，实验在含有20mL镉溶液的50mL离心管中进行，吸附体系条件为活菌:pH5.0、镉浓度300mg/l、吸附120min、活菌干重0.5g/l ;死菌:pH 5.0、镉浓度300mg/l、吸附45min、死菌重0.5g/l。菌体吸附达到饱和后，用石墨炉原子吸收分光光度计测定吸附前后上清液中镉的含量，从而获得其吸附能力。
[0029]将吸附饱和的菌体回收，金属洗脱液去除结合在菌表面的镉后进行酸消化处理，同样用石墨炉原子吸收分光光度计测定菌体中镉的含量。具体酸消化过程如下:菌体干重
0.1-0.5g称重加入消化管底部，滴Iml去离子水将样品润湿。加5ml浓硫酸，与样品混匀后放置过夜再加约0.5ml高氯酸到消化管，消化炉低温180°C消化0.5h，300°C高温消煮至透明无色则消化完成。
[0030](4)电镀废水中重金属移除实验:
[0031]发明人分别进行了一种丝状真菌淡紫拟青霉XLA活菌与死菌对采集的电镀废水中镉去除能力的实验:按实施例3.4中描述收集活菌以及制备死菌，两种菌体均用于移除电镀废水中的镉离子。
[0032]一种丝状真菌 淡紫拟青霉XLA对电镀废水中镉的实际移除实验体系为:20mL电镀废水(Cd2+:0.13mg/L)、干重0.01g/l菌体、28°C和150r/min处理2h后过滤收集上清液，按照前述方法测定吸附前后镉的含量。另外发明人再次利用一种丝状真菌淡紫拟青霉XLA死菌和活菌处理絮凝剂处理过后的污水，以了解一种丝状真菌淡紫拟青霉XLA在去除低浓度污水中的实际应用能力。
[0033] 申请人:利用丝状真菌XLA进行静态镉吸附实验后，显示该菌株能够快速高效吸附重金属镉。该菌在不同活性状态下对重金属镉吸附性能具有明显差异，其中活性菌体的吸附能力更高。随后进行的XLA对电镀废水中重金属的移除实验结果证明，该丝状真菌XLA可以在实际应用中高效吸附并去除污染水体中的镉。
[0034]本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果:
[0035](I)菌体原料易获取，成本低廉，处理工艺简单。
[0036](2)利用丝状真菌淡紫拟青霉XLA的冻干菌体作为生物吸附剂不仅可以高效吸附移除污水中的重金属离子，同时还具备良好的吸附剂再生能力，具备商业化应用的潜能。
[0037](3)丝状真菌淡紫拟青霉XLA对多种重金属具有高耐受性和高吸附特性，对环境中的重金属具有较高的固定能力，降低其生物毒害性。该菌株可以在高浓度重金属水平下存活，因此以淡紫拟青霉XLA作为土壤重金属吸附剂可实现对土壤中重金属长期固定化的同时，避免向环境中多次施加重金属的吸附剂，具备高效修复重金属污染土壤和水体的潜力。



[0038]图1为一种丝状真菌XLA冻干菌体的静态镉吸附量测定结果示意图。
[0039]图2为一种丝状真菌XLA对铺的解吸附剂的选择不意图。
[0040]图3为一种丝状真菌XLA对镉的解吸附动力学结果示意图。
[0041]其中，实验采用最佳解吸附剂为2%质量体积比的EDTA。
[0042]图4为一种丝状真菌XLA死菌与活菌对电镀废水以及絮凝作用后废水中镉移除结果示意图。具体实施方案
[0043]以下叙述是根据本发明实施方案的实施例，应该说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，而没有限制作用。有关DNA的标准操作方法和所使用的药品参考《分子克隆实验指南》所描述的内容(参见J.萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，北京)。本发明中所涉及的其他各种实验操作，均为本领域的常规操作技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。
[0044]实施例1:一种丝状真菌淡紫拟青霉XLA的制备方法，其步骤是:分离、纯化和复筛。
[0045]I)分离镉抗性菌株XLA
[0046]A、称取重金属镉含量为50mg/Kg的用于重金属修复的盆栽试验土样IOg于90ml带有5个0.5mm玻璃珠的无菌水中，于28°C恒温摇床上200r/min振荡30min,静置Imin后，取上清液进行10倍系列稀释；
[0047]B、将100μ L不同稀释倍数的稀释液涂布在含有60mM镉的马丁平板上，静止片刻，倒置于28°C恒温培养箱中培养5d ；
[0048]C、将平板上生长的微生物进行划线分离纯化，然后重新涂布到上述含镉的马丁平板上进行培养；
[0049]D、经10次分离筛选后，保存对镉具有稳定抗性能力的菌株，在PDA斜面上进行保存，备用。
[0050] 申请人:将上述分离得到的菌株中的一株菌命名为丝状真菌XLA。
[0051 ] 2 )菌株XLA的生物学特性
[0052]①生物学特性:丝状真菌，专性需氧，最适生长温度20°C-28°C，生长较迅速，但是在35 V以上产孢能力下降，在PDA培养基中产孢量大，菌落呈现毡状，中部隆起，培养早期菌落呈现白色，后期产孢子变为酒红色。
[0053]②培养条件:保存该真菌及获取其孢子时所使用的培养基为PDA培养基；分离筛选该真菌所用的为马丁培养基:葡萄糖IOg,蛋白胨5g,MgSO40.5g,蒸懼水1000ml,pH自然，121°C高压蒸汽灭菌30min。用于吸附实验及测试其对重金属耐受性用矿物盐培养基(MM):葡萄糖20g,硫酸铵5g,磷酸二氢钾15g,无水硫酸镁0.6g,无水氯化韩0.6g,七水硫酸亚铁0.005g, 一水硫酸锰0.0016g,七水硫酸锌0.0014g,氯化钴0.002g,蒸馏水IOOOml溶解，调节pH至5.5，115°C高压蒸汽灭菌15min。培养该菌可以孢子的形式进行接种:以2%体积比的吐温-80冲洗PDA斜面上的孢子，然后用0.2%体积比的吐温-80稀释至需要的孢子浓度后接种，然后进行28°C，150r/min摇瓶培养。
[0054]3)分子生物学鉴定
[0055]采用CTAB法提取分离筛选得到的菌株的总DNA，并作为PCR模板，以ITS1-1TS4引物进行PCR扩增上述分离菌株的ITS保守序列(部分18S rRNA基因，ITS1，5.8S rRNA基因，ITS4，28S rRNA基因)，以用于菌株的分子鉴定。结合形态学观察和分子生物鉴定确认该菌为淡紫拟青霉菌(Paecilomyces lilacinus)。 申请人:于2012年4月24日将该菌株送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为=CCTCC NO:M2012135。[0056]实施例2:
[0057]—种丝状真菌淡紫拟青霉XLA在重金属镉污染治理中的应用，其应用过程是:
[0058]I)丝状真菌XLA对多种重金属的耐受性检测
[0059]液体培养条件:接种前向矿物盐(MM)液体培养基中添加一定量过滤灭菌的重金属母液至需要浓度，然后按1%接种量接种淡紫拟青霉XLA孢子悬液，培养7d，观察其生长状况。
[0060]固体培养条件:接种孢子至矿物盐(MM)液体培养基，摇床培养至菌丝球刚好形成。将含有一定浓度重金属的矿物盐(MM)固体平板划分三等分区域，分别在每一区域以点种法接种直径相同的菌丝球，28°C培养7天。每24小时记录一次菌丝球直径。用Sigmaplot10.0分析不同浓度平板上随着时间变化菌落大小变化趋势。能使菌落直径基本无变化的重金属浓度即为该菌的最低抑菌浓度。
[0061]表I (见下表)为淡紫拟青霉XLA对不同重金属离子的耐受性。液体培养条件下不同重金属对淡紫拟青霉XLA的最低抑菌浓度分别为镉(Cd2+)130mM、钴(Co2+)45mM、铜(Cu2+) 80mM、锌(Zn2+) 220mM、铬(Cr3+) 60mM、铬(Cr6+) 5mM、镍(Ni2+) 24mM ；固体培养条件下则分别为265mM、50mM、80mM、145mM、35mM、4mM、16mM。这表明本发明所提供的淡紫拟青霉XLA
对多种重金属的毒害具有较强耐受性。
[0062]表I (本实施例中丝状真菌XLA在矿物盐培养基中对不同重金属离子耐受性检测结果)