人参形成层干细胞分离及培养方法[0002]人参是名贵的中药材，深受广大消费者喜爱，市场需求量很大。野生的人参资源有限，目前生产上采用人工种植人参的办法来满足市场需求。[0003]但由于人参生长周期长，占用耕地，生产过程中又容易受到环境条件、病虫害和重金属污染的影响，所以这种传统的生产技术的成本相对较高和质量难以控制。[0004]为解决上述问题，产生了通过离体悬浮培养人参的细胞来生产人参的药用成份的技术，这种技术不受人参生长季节的限制就可以通过规模化生产来获得大量人参产品。通常取人参的根或叶片为外殖体在特定培养基上培养，经过脱分化阶段诱导成具有分裂能力的愈伤细胞，进一步将该细胞悬浮培养来扩大生产。[0005]但目前采用该技术在分离人参细胞时，均采用已经分化的组织器官为外殖体，通过离体培养阶段的培养(脱分化过程)将其诱导为具有分化能力的愈伤细胞。但这种细胞的本质是来源于已经分化的体细胞，所以分裂能力有限，抗逆能力不强。在工业化量产过程中，经常会出现细胞系退化，分裂能力弱，很难进行超大体积的培养。[0006]针对已有的人参细胞悬浮培养体系中采用体细胞的缺点，本发明则注重分离和培养人参的形成层干细胞。因为形成层干细胞是处于未分化状态的细胞，具有无限分裂的能力，所以悬浮培养中如果采用形成层干细胞将可以避免脱分化体细胞的缺点。
[0007]本发明提供一种人参形成层干细胞分离及培养方法，目的是解决现有技术问题，提供一种采用未分裂的形成层干细胞进行分离及培养人参干细胞的方法，该方法仅使形成层干细胞进行无限增殖，而体细胞则不会增殖。
[0008]本发明解决问题采用的技术方案是:
[0009]1.人参形成层干细胞分离及培养方法，包括以下步骤；
[0010]( I)首先将东北人参的直径为2厘米的块根经过0.1%的升汞消毒处理10分钟，然后横切成0.2厘米厚的包含周皮、韧皮部和形成层在内的半圆形切片。
[0011](2)将半圆形切片放置在含有0.1-4.0mg.L—1毒莠定与0.1-4.0mg.1^2,4~ 二氯苯氧乙酸的WPM培养基上，25°C黑暗下培养。
[0012](3)两周后将形成层明显增殖的外殖体取出，分离形成层干细胞并转移到转继代培养基上培养；继代培养基为含有0.1-4.0mg.L-1毒莠定与0.1-4.0mg.1^2,4~ 二氯苯氧乙酸的WPM培养基，每两周继代一次，短期内可以获得大量的干细胞。
[0013]步骤(2)中WPM培养基上毒莠定的浓度优选1.0mg.L—1，2，4_ 二氯苯氧乙酸的浓度优选 0.5mg.171。[0014]步骤(3)中继代培养基上毒莠定的浓度优选0.5mg.U1, 2,4_ 二氯苯氧乙酸的浓度优选 0.5mg.171。
[0015]本发明的有益效果:本发明中提供的人参形成层干细胞分离及培养方法可以有效地分离人参的形成层干细胞，形成层干细胞具有无限分裂的能力，生长速度快，抗逆能力强，为超大体积的液体悬浮培养提供基础，可以显著减少生产成本。而且通过控制培养基中毒莠定和2，4_ 二氯苯氧乙酸的浓度，使形成层干细胞进行增殖的同时其体细胞不会进行增殖。



[0016]图1是本发明中的人参外殖体切片，箭头所指处为环形的形成层干细胞；
[0017]图2是人参干细胞在人参外殖体切片上增殖的示意图，箭头所指处为形成层干细胞增殖团块；
[0018]图3是人参干细胞在固体培养基上增殖示意图。

[0019]对人参形成层干细胞进行分离和培养的方法具体过程如下实施例中所示:
[0020]实施例1
[0021 ] ( I)首先将东北人参的直径为2厘米的块根经过0.1%的升汞消毒处理10分钟，然后横切成0.2厘米厚的包含周皮、韧皮部和形成层在内的半圆形切片，见图1。
[0022](2)将上述半圆形切片放置在含有1.0mg.L—1毒莠定与0.5mg.1^2,4-二氯苯氧乙酸的WPM培养基上，25°C黑暗下培养。由于形成层的干细胞分裂速度快，导致形成层干细胞团在外殖体上显著积累而形成一个凸起，见图2，这种干细胞团质地致密，表面较光滑平整。
[0023](3)两周后将形成层明显增殖的外殖体取出，分离形成层干细胞并转移到转继代培养基上培养，见图3。继代培养基为含有0.5mg.1/1毒莠定与0.5mg.1^2,4- 二氯苯氧乙酸的WPM培养基，每两周继代一次，短期内可以获得大量的干细胞。
[0024]实施例2
[0025](I)首先将东北人参的直径为2厘米的块根经过0.1%的升汞消毒处理10分钟，然后横切成0.2厘米厚的包含周皮、韧皮部和形成层在内的半圆形切片。
[0026](2)将半圆形切片放置在含有0.lmg.L—1毒莠定与0.5mg.d4_ 二氯苯氧乙酸的WPM培养基上，25 °C黑暗下培养。
[0027](3)两周后将形成层明显增殖的外殖体取出，分离形成层干细胞并转移到转继代培养基上培养；继代培养基为含有1.0mg.1-1毒莠定与2.0mg.1^2,4~ 二氯苯氧乙酸的WPM培养基，每两周继代一次，短期内可以获得大量的干细胞。
[0028]下述表格I中数值为实施例3至实施例15采用的WPM培养基和继代培养基中毒莠定和2，4-二氯苯氧乙酸的浓度。
[0029]表1
[0030]