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超顺磁性氧化铁纳米微粒-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管及其制备方法

  • 专利名称
    超顺磁性氧化铁纳米微粒-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管及其制备方法
  • 发明者
    罗卓荆, 黄景辉, 刘鐘阳, 刘靓
  • 公开日
    2014年7月9日
  • 申请日期
    2014年4月15日
  • 优先权日
    2014年4月15日
  • 申请人
    中国人民解放军第四军医大学
  • 文档编号
    A61L27/50GK103908698SQ201410150272
  • 关键字
  • 权利要求
    1.超顺磁性氧化铁纳米微粒-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管的制备方法,其特征是,其步骤如下 (1)制备SPIONs 分别配制0.lmol/L的Fe3+及Fe2+溶液,在通氮气条件下,按照Fe3+ = Fe2+摩尔比为21混合,机械搅拌3~4h,使其充分混合;然后向混合溶液中滴加lmol/L的NaOH溶液,直至混合溶液PH=9~10,得到黑色沉淀;水浴加热2h后静置5h,移去上层清液,将生成的粒子减压抽滤,用蒸馏水及无水乙醇反复进行洗涤,洗去粒子表面的杂质离子;将粒子在50°C下真空干燥,研磨过筛,得到SPIONs ; (2)制备SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管 将I型胶原蛋白混浊液和壳聚糖混浊液混合,然后加入(1)中制得的SP10Ns,2~6°C下,15000rpm,搅拌80~120min,制得混合混池液,将混合混池液抽真空,静置10h~14h,制得SPIONs-胶原-壳聚糖凝胶状混浊液;然后将其倒入神经导管成形模具中,以小铁夹固定神经导管成形模具的两端,在微型调速仪下,以垂钓的方式将神经导管成形模具顺轴向以2X 10_5m/s的速度缓慢浸入液氮中,对注入神经导管成形模具中的SPIONs-胶原-壳聚糖凝胶状混浊液进行冷淋固形处理,待神经导管成形模具完全浸入液氮后,继续在液氮中保留10h~14h ;将神经导管成形模具连同内部注入的SPIONs-胶原-壳聚糖凝胶状混浊液一同转入-80°C~-70°C的冰箱中冷藏,冷藏24h后取出,迅速去除神经导管成形模具两端的铁夹和铜管,之后放置于预冷好的冷冻干燥机中冻干48h~50h,其中冷冻干燥机设置的预冷参数为-60°C、lOOmtorr ;将冻干处理后的神经导管成形模具放置于真空状态下并升温至(TC,保持5.5h~6.5h,之后再升温至20°C~24°C,保持30min~60min,解除真空状态,最后升至常温;最后将神经导管从神经导管成形模具中取出,即得到SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管; (3)消毒处理 将(2)中制得的SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管放入京尼平和无水乙醇混合溶液中进行交联处理,交联时间为46h~50h,每克的SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管加入20ml的京尼平和无水乙醇混合溶液;交联处理后将SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管用去离子水和质量百分浓度为95%的酒精交替清洗25min~35min ?’然后置于常温下干燥一周,最后用6tlCo照射SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管,进行消毒处理,得到消毒后的SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征是,步骤(2)中,所述I型胶原蛋白混浊液,其制备方法为,每20mgl型胶原蛋白加入1ml冰醋酸,经22h~26h的溶解处理,制得I型胶原蛋白混浊液;所述壳聚糖混浊液,其制备方法为,每20mg壳聚糖加入1.2ml冰醋酸,经22h~26h的溶解处理,制得壳聚糖混浊液3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征是,步骤(2)中,I型胶原蛋白混浊液和壳聚糖混浊液按照I型胶原蛋白和壳聚糖的质量比为0.25~41混合;加入的SPIONs的质量为I型胶原蛋白和壳聚糖总质量的5~20%4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征是,步骤(3)中,京尼平和无水乙醇混合溶液中,京尼平占混合溶液总质量的1%5.根据权利要求1~4任一所述的制备方法制得的超顺磁性氧化铁纳米微粒-胶原-壳聚糖磁性可降解 神经导管
  • 技术领域
    [0001]本发明涉及长节段外周神经损伤修复
  • 专利摘要
    本发明公开了超顺磁性氧化铁纳米微粒-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管及其制备方法。本发明的制备方法包括如下步骤(1)制备SPIONs;(2)制备SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管;(3)消毒处理。本发明在制备超顺磁性氧化铁纳米微粒-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管的过程中,采用一定浓度的超顺磁性氧化铁纳米微粒,形成具有可磁化的磁性系统,不仅可以引导再生神经定向生长,还能促进神经营养物质的分泌,更有效的促进受损神经再生。本发明制备的神经导管能够使再生神经通过导管内部磁场定向生长加速修复和成髓鞘,进一步提高神经缺损的修复效果。
  • 发明内容
  • 专利说明
    超顺磁性氧化铁纳米微粒-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管及其制备方法
  • 专利详情
  • 全文pdf
  • 权力要求
  • 说明书
  • 法律状态
超顺磁性氧化铁纳米微粒-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管及其制备方法【技术领域】,尤其涉及的是超顺磁性氧化铁纳米微粒-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管及其制备方法。[0002]周围神经缺损是临床最常见的创伤之一。该类型的神经损伤会使受累神经所支配的远端肢体出现完全的感觉和运动功能的双重缺失,从而导致严重残疾的发生,会给患者的工作和生活质量带来巨大的影响。[0003]目前,临床上对于较短距离的周围神经缺损,在无张力缝合的原则基础上,多采用神经断端直接缝合的方法进行修复;而对于长距离的周围神经缺损,则往往采用自体神经移植的方法进行修复。但是,研究表明:自体神经移植仅能实现部分神经功能的恢复,且只有35%~45%的患者在接受移植后能实现运动功能的完全恢复,而感觉神经的功能恢复效果比运动神经或混合型神经要差;同时,这种治疗的方法应用仍然存在诸多的制约因素,例如二次手术、供体神经量有限、配体受体神经不匹配、易形成顽固性神经瘤和神经供区的致残问题。[0004]组织工程神经支架是一种以天然生物材料或者人工合成的高分子聚合物为原料制备而成的,具有特殊的三维结构,用于桥接神经缺损的近端和远端,铺设通道引导再生神经长入,并实现再生神经跨越缺损生长的一种组织工程支架。目前,结构相对简单的神经导管移植物是研究的重点,经多项动物或临床研究证实,其修复长距离神经缺损效果确切。经FDA批准商业化和应用于临床桥接患者神经缺损的组织工程神经支架及相关产品主要集中在这方面。但是大多数神经导管的管壁为密封式设计,既不利于再生神经定向生长,也不利于营养物质、氧和代谢产物的运输,且需要二次手术取出残留植入结构,因而限制了多种神经导管的普及。随着研究的进一步深入,学者们对周围神经损伤局部微环境的研究也越来越重视,渴望通过改善损伤组织局部微环境促进损伤神经的再生和功能的恢复。[0005]磁信号是普遍存在于生活的物理信号,越来越多的研究指出磁场能够定向引导多种细胞的生长,并且能够促进多种细胞分泌营养物质从而促进细胞生长。临床上,磁场作为一种非侵入性的方法被广泛应用,如磁共振成像、低频磁疗等,然而尚未有将可被外磁场磁化的神经导管修复神经缺损的报道。因此,发明一种新的可以通过外部磁场磁化的磁性系统,在神经导管内通过定向引导再生神经生长来促进损伤神经恢复就显得尤为重要。[0006]为了克服这一难题,越来越多的学者开始关注一种新型材料一超顺磁性氧化铁纳米微粒(Superparamagneticironoxidenanopaticles, SPIONs)。SPIONs 由于具有特殊的磁导向性、超顺磁性,以及表面可连接生化活性功能基团等特性,使其在核酸分析、临床诊断、靶向药物、酶和细胞固定化等领域的应用得到了广泛的发展,其特点是:①超顺磁性,SPIONs为FeO和Fe2O3的混合价态化合物,其物理长度恰好处于纳米量级(50nm以下),在受到外加磁场作用时,磁性纳米微粒中相邻原子或离子的热无序磁矩在一定程度上出现与磁场强度方向一致的定向排列,而当外加磁场消失后,粒子的磁性消失。②靶向性,SPIONs在外加磁场导向作用下,能靶向性移动、聚集,产生局部特异性浓集,从而实现选择性成像。Chertok等将SPIONs注入小鼠静脉,在0.4T磁场中可以选择性聚集在小鼠脑胶质细胞瘤中进行显影。③良好的生物相容性,尽管目前SPIONs在体内的代谢过程还未完全阐明,但大量的研究表明其具有良好的生物相容性。Feng等将SPIONs注入小鼠体内后,对其尿液及血清中的代谢物进行分析,发现α -苯基琥珀酰亚胺-η-戊酸等代谢产物量仅有细微变化,对小鼠生理无影响。Levy等模仿体内环境,显示纳米微粒分解为纳米晶体,并能稳定悬浮于体液中。Stamopoulos等报道SPIONs对人类白细胞、红细胞及血小板无明显影响。N.Bock用简单经济的浸润包被(dip-coating)方法,将SPIONs与轻磷灰石-壳聚糖骨再生支架复合,制备了新型磁性骨组织工程支架,对其进行检测,发现其磁性稳定性良好,并且对骨髓间充质干细胞的活性无影响。此外还发现,该磁性支架能够通过磁性驱动力,吸引并摄取体内的生长因子,从而促进骨缺损的再生。[0007]基于超顺磁性氧化铁纳米微粒的上述优点,SPIONs也许能够通过定向引导再生神经生长,促进营养物质分泌,从而促进移植的种子细胞的存活,从而提高功能化组织工程支架的修复能力。然而,目前尚未有将SPIONs用于动物体内的神经细胞支架的文献报道。
[0008]本发明为了解决再生神经生长方向不确定,使得现有神经支架修复效果不佳,减缓神经生长速度,导致支配区功能恢复不良的问题,提供了超顺磁性氧化铁纳米微粒-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管及其制备方法。
[0009]本发明的技术方案如下:
[0010]超顺磁性氧化铁纳米微粒-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管的制备方法,其步骤如下:
[0011](I)制备 SPIONs
[0012]分别配制0.lmol/L的Fe3+及Fe2+溶液,在通氮气条件下,按照Fe3+ = Fe2+摩尔比为2:1混合,机械搅拌3~4h,使其充分混合;然后向混合溶液中滴加lmol/L的NaOH溶液,直至混合溶液pH=9~10,得到黑色沉淀;水浴加热2h后静置5h,移去上层清液,将生成的粒子减压抽滤,用蒸馏水及无水乙醇反复进行洗涤,洗去粒子表面的杂质离子;将粒子在50°C下真空干燥,研磨过筛,得到SPIONs ;
[0013](2)制备SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管
[0014]将I型胶原蛋白混浊液和壳聚糖混浊液混合,然后加入(I)中制得的SP10Ns,2~6°C下,15000rpm,搅拌80~120min,制得混合混池液,将混合混池液抽真空,静置IOh~14h,制得SPIONs-胶原-壳聚糖凝胶状混浊液;然后将其倒入神经导管成形模具中,以小铁夹固定神经导管成形模具的两端,在微型调速仪下,以垂钓的方式将神经导管成形模具顺轴向以2X10_5m/s的速度缓慢浸入液氮中,对注入神经导管成形模具中的SPIONs-胶原-壳聚糖凝胶状混浊液进行冷淋固形处理,待神经导管成形模具完全浸入液氮后,继续在液氮中保留IOh~14h ;将神经导管成形模具连同内部注入的SPIONs-胶原-壳聚糖凝胶状混浊液一同转入_80°C~_70°C的冰箱中冷藏,冷藏24h后取出,迅速去除神经导管成形模具两端的铁夹和铜管,之后放置于预冷好的冷冻干燥机中冻干48h~50h,其中冷冻干燥机设置的预冷参数为:-60°C、lOOmtorr ;将冻干处理后的神经导管成形模具放置于真空状态下并升温至0°C,保持5.5h~6.5h,之后再升温至20°C~24°C,保持30min~60min,解除真空状态,最后升至常温;最后将神经导管从神经导管成形模具中取出,即得到SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管;
[0015](3)消毒处理
[0016]将(2)中制得的SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管放入京尼平和无水乙醇混合溶液中进行交联处理,交联时间为46h~50h,每克的SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管加入20ml的京尼平和无水乙醇混合溶液;交联处理后将SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管用去离子水和质量百分浓度为95%的酒精交替清洗25min~35min ;然后置于常温下干燥一周,最后用6tlCo照射SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管,进行消毒处理,得到消毒后的SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管。
[0017]所述的制备方法,步骤(2)中,所述I型胶原蛋白混浊液,其制备方法为,每20mgl型胶原蛋白加入1ml冰醋酸,经22h~26h的溶解处理,制得I型胶原蛋白混浊液;所述壳聚糖混浊液,其制备方法为,每20mg壳聚糖加入1.2ml冰醋酸,经22h~26h的溶解处理,制得壳聚糖混池液。[0018]所述的制备方法,步骤(2)中,I型胶原蛋白混浊液和壳聚糖混浊液按照I型胶原蛋白和壳聚糖的质量比为0.25~4:1混合;加入的SPIONs的质量为I型胶原蛋白和壳聚糖总质量的5~20%。
[0019]所述的制备方法,步骤(3)中,京尼平和无水乙醇混合溶液中,京尼平占混合溶液总质量的1%。
[0020]所述的制备方法制得的超顺磁性氧化铁纳米微粒-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管。
[0021]本发明在制备超顺磁性氧化铁纳米微粒-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管的过程中,采用一定浓度的超顺磁性氧化铁纳米微粒,形成具有可磁化的磁性系统,不仅可以引导再生神经定向生长,还能促进神经营养物质的分泌,更有效的促进受损神经再生。本发明制备的神经导管能够使再生神经通过导管内部磁场定向生长加速修复和成髓鞘,进一步提高神经缺损的修复效果。



[0022]图1是本发明的超顺磁性氧化铁纳米微粒-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管制备方法的示意图;图中,I胶原-壳聚糖混浊液,2超顺磁性氧化铁纳米微粒,3微型调速仪,4图2所示神经导管成形模具,5液氮罐。
[0023]图2是本发明的制备方法中采用的神经导管成形模具的结构图;图中,6实心不锈钢管,7填充的超顺磁性氧化铁纳米微粒-胶原-壳聚糖凝胶状混浊液,8中空硅胶管,9铜管。
[0024]图3是本发明制备出的超顺磁性氧化铁纳米微粒的透射电镜图。
[0025]图4是本发明制备出的超顺磁性氧化铁纳米微粒-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管磁性检测图。
[0026]图5是本发明制备出超顺磁性氧化铁纳米微粒-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管横切面扫描电镜图。
[0027]图6是本发明制备出的超顺磁性氧化铁纳米微粒-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管横切面扫描电镜放大图。

[0028]以下结合具体实施例,对本发明进行详细说明。
[0029]实施例1
[0030](I)分别配制0.lmol/L的Fe3+及Fe2+溶液,在通氮气条件下,按照Fe3+:Fe2+摩尔比为2:1混合,机械搅拌3h,使其充分混合。在持续通氮气条件下,在混合溶液中滴加lmol/L的NaOH溶液,直至混合溶液pH=9,得到黑色沉淀。然后水浴加热2h,然后静置5h后,移去上层清液,将生成的粒子减压抽滤,用蒸馏水及无水乙醇反复进行洗涤,洗去粒子表面的杂质离子,将获得的粒子在50°C下真空干燥,研磨过筛,得到SPIONs。[0031](2)分别称取I型胶原蛋白和壳聚糖,I型胶原蛋白和壳聚糖的质量分别为50mg、50mg,称取(I)中制得的SP10Ns5mg。
[0032](3)按每20mgl型胶原蛋白加入1ml冰醋酸,将冰醋酸与I型胶原蛋白混合,经22h的溶解处理制得I型胶原蛋白混浊液;按每20mg的壳聚糖加入1.2ml的冰醋酸,将量取的冰醋酸溶液与壳聚糖混合,经22h的溶解处理,制得壳聚糖混浊液;将(2)中制备的I型胶原蛋白混池液与壳聚糖混池液混合,然后加入5mgSP10Ns,于2°C条件下恒温搅拌IOOmin,搅拌速度为15000rpm,即得到混合混浊液;将混合混浊液先进行抽真空处理之后再静置10h,得到SPIONs-胶原-壳聚糖凝胶状混浊液。
[0033](4)将(3)中的SPIONs-胶原-壳聚糖凝胶状混浊液注入神经导管成形模具中,以小铁夹固定神经导管成形模具的两端;在微型调速仪下,以垂钓的方式将神经导管成形模具顺轴向以2X10_5m/s的速度缓慢浸入液氮中,对注入神经导管成形模具中的SPIONs-胶原-壳聚糖凝胶状混浊液进行冷淋固形处理,待神经导管成形模具完全浸入液氮后,继续在液氮中保留IOh ;将神经导管成形模具连同内部注入的SPIONs-胶原-壳聚糖凝胶状混浊液一同转入_80°C的冰箱中冷藏;
[0034](5)冷藏24h后,将神经导管成形模具从_80°C的冰箱中取出,迅速去除神经导管成形模具两端的铁夹和铜管;将神经导管成形模具放置于预冷好的Alphal-2型冷冻干燥机中冻干48h ;其中冷冻干燥机设置的参数为:-60°C、IOOmtorr ;将冻干处理后的神经导管成形模具先放置于真空状态下并升温至0°C保持5.5h,之后再升温至20°C,保持30min,解除真空状态,最后升至常温;将神经导管从神经导管成形模具中取出,按不同的要求,裁剪成各种不同长度的神经导管,神经导管横截面的外径为2.5mm,内径为1.5mm,即制备得到SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管。
[0035](6)将称取的京尼平与无水乙醇混合,京尼平的质量占混合溶液总质量的1% ;将(5)中制得的SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管放入配制的京尼平和无水乙醇混合溶液中进行交联处理,交联时间为46h,每克的SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管加入20ml的京尼平和无水乙醇混合溶液;经交联处理后,将SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管用去离子水和质量百分浓度为95%的酒精反复清洗25min ;将清洗后的SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管置于常温下干燥一周,最后用6tlCo照射SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管进行消毒处理,得到消毒后的SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管。
[0036]实施例2
[0037](I)分别配制0.lmol/L的Fe3+及Fe2+溶液,在通氮气条件下,按照Fe3+:Fe2+摩尔比为2:1混合,机械搅拌3.5h,使其充分混合。在持续通氮气条件下,在混合溶液中滴加Imol/L的NaOH溶液,直至混合溶液pH=9.5,得到黑色沉淀。然后水浴加热2h,然后静置5h后,移去上层清液,将生成的粒子减压抽滤,用蒸馏水及无水乙醇反复进行洗涤,洗去粒子表面的杂质离子,将获得的粒子在50°C下真空干燥,研磨过筛,得到SPIONs。
[0038](2)分别称取I型胶原蛋白和壳聚糖,I型胶原蛋白和壳聚糖的质量分别为80mg、20mg,称取(I)中制得的 SPIONslOmg。
[0039](3)按每20mgl型胶原蛋白加入1ml冰醋酸,将冰醋酸与I型胶原蛋白混合,经24h的溶解处理制得I型胶原蛋白混浊液;按每20mg的壳聚糖加入1.2ml的冰醋酸,将量取的冰醋酸溶液与壳聚糖混合,经24h的溶解处理,制得壳聚糖混浊液;将(2)中制备的I型胶原蛋白混池液与壳聚糖混池液混合,然后加入IOmgSPIONs,于4°C条件下恒温搅拌80min,搅拌速度为15000rpm,即得到混合混浊液;将混合混浊液先进行抽真空处理之后再静置12h,得到SPIONs-胶原-壳聚糖凝胶状混浊液。[0040](4)将(3)中的SPIONs-胶原-壳聚糖凝胶状混浊液注入神经导管成形模具中,以小铁夹固定神经导管成形模具的两端;在微型调速仪下,以垂钓的方式将神经导管成形模具顺轴向以2X10_5m/s的速度缓慢浸入液氮中,对注入神经导管成形模具中的SPIONs-胶原-壳聚糖凝胶状混浊液进行冷淋固形处理,待神经导管成形模具完全浸入液氮后,继续在液氮中保留12h ;将神经导管成形模具连同内部注入的SPIONs-胶原-壳聚糖凝胶状混浊液一同转入-75 °C的冰箱中冷藏;
[0041](5)冷藏24h后,将神经导管成形模具从_75°C的冰箱中取出,迅速去除神经导管成形模具两端的铁夹和铜管;将神经导管成形模具放置于预冷好的Alphal-2型冷冻干燥机中冻干49h ;其中冷冻干燥机设置的参数为:-60°C、IOOmtorr ;将冻干处理后的神经导管成形模具先放置于真空状态下并升温至0°C保持6h,之后再升温至20°C,保持45min,解除真空状态,最后升至常温;将神经导管从神经导管成形模具中取出,按不同的要求,裁剪成各种不同长度的神经导管,神经导管横截面的外径为2.5mm,内径为1.5mm,即制备得到SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管。
[0042](6)将称取的京尼平与无水乙醇混合,京尼平的质量占混合溶液总质量的1% ;将(5)中制得的SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管放入配制的京尼平和无水乙醇混合溶液中进行交联处理,交联时间为48h,每克的SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管加入20ml的京尼平和无水乙醇混合溶液;经交联处理后,将SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管用去离子水和质量百分浓度为95%的酒精反复清洗35min ;将清洗后的SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管置于常温下干燥一周,最后用6tlCo照射SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管进行消毒处理,得到消毒后的SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管。
[0043]实施例3
[0044](I)分别配制0.lmol/L的Fe3+及Fe2+溶液,在通氮气条件下,按照Fe3+ = Fe2+摩尔比为2:1混合,机械搅拌4h,使其充分混合。在持续通氮气条件下,在混合溶液中滴加Imol/L的NaOH溶液,直至混合溶液pH=10,得到黑色沉淀。然后水浴加热2h,然后静置5h后,移去上层清液,将生成的粒子减压抽滤,用蒸馏水及无水乙醇反复进行洗涤,洗去粒子表面的杂质离子,将获得的粒子在50°C下真空干燥,研磨过筛,得到SPIONs。
[0045](2)分别称取I型胶原蛋白和壳聚糖,I型胶原蛋白和壳聚糖的质量分别为20mg、80mg,称取(I)中制得的 SP10Ns20mg。
[0046](3)按每20mgl型胶原蛋白加入1ml冰醋酸,将冰醋酸与I型胶原蛋白混合,经26h的溶解处理制得I型胶原蛋白混浊液;按每20mg的壳聚糖加入1.2ml的冰醋酸,将量取的冰醋酸溶液与壳聚糖混合,经26h的溶解处理,制得壳聚糖混浊液;将(2)中制备的I型胶原蛋白混池液与壳聚糖混池液混合,然后加入5mgSP10Ns,于6°C条件下恒温搅拌120min,搅拌速度为15000rpm,即得到混合混浊液;将混合混浊液先进行抽真空处理之后再静置14h,得到SPIONs-胶原-壳聚糖凝胶状混浊液。
[0047](4)将(3)中的SPIONs-胶原-壳聚糖凝胶状混浊液注入神经导管成形模具中,以小铁夹固定神经导管成形模具的两端;在微型调速仪下,以垂钓的方式将神经导管成形模具顺轴向以2X10_5m/s的速度缓慢浸入液氮中,对注入神经导管成形模具中的SPIONs-胶原-壳聚糖凝胶状混浊液进行冷淋固形处理,待神经导管成形模具完全浸入液氮后,继续在液氮中保留14h ;将神经导管成形模具连同内部注入的SPIONs-胶原-壳聚糖凝胶状混浊液一同转入_70°C的冰箱中冷藏;[0048](5)冷藏24h后,将神经导管成形模具从_70°C的冰箱中取出,迅速去除神经导管成形模具两端的铁夹和铜管;将神经导管成形模具放置于预冷好的Alphal-2型冷冻干燥机中冻干50h ;其中冷冻干燥机设置的参数为:-60°C、IOOmtorr ;将冻干处理后的神经导管成形模具先放置于真空状态下并升温至0°C保持6.5h,之后再升温至24°C,保持60min,解除真空状态,最后升至常温;将神经导管从神经导管成形模具中取出,按不同的要求,裁剪成各种不同长度的神经导管,神经导管横截面的外径为2.5mm,内径为1.5mm,即制备得到SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管。
[0049](6)将称取的京尼平与无水乙醇混合,京尼平的质量占混合溶液总质量的1% ;将
(5)中制得的SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管放入配制的京尼平和无水乙醇混合溶液中进行交联处理,交联时间为50h,每克的SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管加入20ml的京尼平和无水乙醇混合溶液;经交联处理后,将SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管用去离子水和质量百分浓度为95%的酒精反复清洗35min ;将清洗后的SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管置于常温下干燥一周,最后用6tlCo照射SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管进行消毒处理,得到消毒后的SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管。
[0050]实施例1、2、3中,制备SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管用到的主要原料为I型胶原蛋白、壳聚糖及超顺磁性氧化铁纳米微粒。其中I型胶原蛋白主要由成纤维细胞或与其来源相类似的细胞如:成骨细胞、成软骨细胞合成,生物体内胶原的合成,一般包括一系列的过程,其通过在胞内合成胶原蛋白分子形成前胶原,进而在胞外进一步聚合成胶原纤维和胶原束,I型胶原蛋白作为体外细胞培养支架时,有促进细胞黏附和诱导生长分化的作用,是良好的培养黏附剂。胶原与不同的细胞之间存在很强的亲和力,与在创伤的愈合过程中起到关键作用的生长因子间也有着特殊的亲和力,在血液凝固后,还可以通过刺激组织的再生与修复来防止再次发生出血。
[0051]壳聚糖是甲壳素N-脱乙酰基的产物,具有无毒性、无免疫原性、无热源反应、不溶血等特性,其可生物降解性和良好的生物相容性、成膜性,使其成为一种理想的安全可靠的天然生物活性支架材料。
[0052]超顺磁性氧化铁纳米微粒,由于具有特殊的磁导向性、超顺磁性,以及表面可连接生化活性功能基团等特性,使其在核酸分析、临床诊断、靶向药物、酶和细胞固定化等领域的应用得到了广泛的发展,具有超顺磁性、靶向性和良好的生物相容性。
[0053]制备SPIONs-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管采用的神经导管成形模具,如图2所示,包括有中空硅胶管8,中空硅胶管8的两端各连接有一个大小相同的中空铜管9,中空硅胶管8内的空腔为一个实心不锈钢管6,实心不锈钢管6与中空硅胶管8之间填充有SPIONs-胶原-壳聚糖凝胶状混浊液7,其中,中空铜管9的尺寸为:长2cm,横截面外径为
2.5mm,横截面内径为1.5mm ;中空硅胶管8的尺寸为:长IOcm,横截面外径为3.0mm,横截面内径为2.5mm ;实心不锈钢管6的尺寸为:长IOcm,横截面直径为1.5mm。
[0054]实施例4
[0055]应用电生理技术和本实施例2中制备出的超顺磁性氧化铁纳米微粒-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管结合外部脉冲电磁场(2mT, 20Hz ;PulsedElectromagneticField,PEMF)对成年SD大鼠15_坐骨神经缺损修复的效果进行评估,并和自体神经移植修复、胶原-壳聚糖神经导管结合外部脉冲电磁场修复进行比较,结果如下:
[0056]SD大鼠在植入不同种材料后的第4周及第8周,同一时间点使用本发明的超顺磁性氧化铁纳米微粒-胶原-壳聚糖磁性可降解神经导管结合外部脉冲电磁场的运动神经传导速度(MNCV)恢复率、波幅恢复率比胶原-壳聚糖神经导管结合外部脉冲电磁场的显著增高(P〈0.05),其与自体神经组运动神经传导速度恢复率、波幅恢复率相比没有显著性差异(Ρ>0.05)。
[0057]表1MNCV和波幅恢复率(%, x+s)
[0058]

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