专利名称：一种抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(gvhd)制剂及其制备方法早在19世纪，在创伤愈合的研究領域，就有观点第一次提出了骨髄中可能存在着非造血功能的干细胞。但直到1976年，间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSC)才首次被报导，并由此开始逐渐被人们重视。MSC是ー种存在于骨髓中的具有多向分化潜能的干细胞，将同种异体甚至异种异体的间充质干细胞移植入宿主体内，在一定的诱导条件下可分化成具有中胚层、外胚层或内胚层特点的细胞，并參与宿主的构成。这使得人们一直以来对于异体移植的理解产生了巨大的冲击，甚至在ー些研究中间充质干细胞还可以用来治疗由于器官移植造成的移植物抗宿主病，可见间充质干细胞有着独特的免疫调节功能使其在人和动物体内可以避免异种移植排斥反应的发生，逐渐成为移植治疗中的研究热点。 近年来，MSC的免疫调节作用愈发引起了新的重视，MSC具有独特的免疫学特性。首先，MSC没有免疫原性，MSC仅低水平表达人类主要组织相容性I类分子，而不表达人类主要组织相容性II类分子，由于人类主要组织相容性II类分子是诱发异体免疫排斥的主要抗原，因而导致了间充质干细胞的低免疫原性，不会刺激机体产生免疫反应，这就可以使其逃避细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞(NK)的杀伤作用；另ー个方面，MSC又显示出一定的免疫调节作用，可以降低机体的免疫反应，具有复杂的调节T细胞和B细胞功能的作用。MSC表面不表达T细胞共刺激分子Β7-1、Β7-2，也不表达刺激细胞凋亡的分子如⑶40、⑶80、⑶86。有报道表明，用⑶80、⑶86基因转染MSC，从而为T细胞增殖提供⑶28介导的共刺激信号，或是用Y-干扰素预处理MSC以上调人类主要组织相容性II类分子的表达，这些经处理的MSC仍不能有效提呈抗原和刺激T细胞的増殖，进ー步证实了间充质干细胞的低免疫原性。正因为MSC具有重要的体内外免疫调节作用，同时其取材方便，数量丰富，扩增效率高，具有多向分化潜能，因而，MSC正成为最具临床应用潜能的干细胞，也展现了在器官移植后的免疫排斥抑制方面的广泛应用前景。移植物抗宿主病(GVHD)是由于供受体间次要组织相容性抗原的差异，即便在MHC配型极大的提高了骨髄移植的成功性的今天，GVHD仍然是骨髄移植患者所面临的重要问题，是导致骨髄移植患者死亡的重要因素，而MSC的免疫调节功能，为临床上治疗GVHD提供了一种全新的思路。目前，对MSC的临床应用尝试主要集中与直接进行自体或异体的细胞移植，有报道显示MSC对免疫细胞的调节作用具有剂量依赖性，尤其是对T细胞增殖的抑制作用，随着MSC剂量增加，抑制作用加強。尽管在细胞移植的角度，MSC应用取得了一定程度的进展，但细胞移植本身的局限性，例如活细胞的保存困难、移植的操作难度等极大的限制了 MSC的更为广泛的应用，针对这ー问题，本发明人通过相关研究，证实移植的MSC在參与免疫调节抑制的过程中所分泌出的生长因子和细胞活素，可借由MSC在体外特定环境中所分泌的条件培养基中获得，并完全可能将其应用于临床上的器官移植或组织工程后的免疫抑制方面的应用，从而提升器官移植或者组织工程(例如人工骨移植)后的愈后效果。因此，MSC在体外人工环境中分泌的促血管及周边组织修复或再生的生长因子和细胞活素在临床上有巨大的潜力，可以作为干细胞疗法的有效替代品或辅助药物。
本发明的目的在于提供ー种抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂，应用于抑制临床由于器官移植、骨组织工程手术等因素引起的自体免疫排斥反应。本发明的目的还在于提供一种制备免疫抑制及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂的方法，该方法步骤为 I)从健康人血液中通过白细胞置换(Ieukapheresis)获取外周血单核细胞,或从骨髓中(通过密度梯度离心的方法，可选步骤)获取骨髓单核细胞，或从人脂肪吸取物(Iipoaspirate)中直接提取 MSC;2)筛选及培养外周血或骨髓单核细胞以获得MSC细胞；3)在特定条件下培养MSC细胞使其分泌促组织修复和再生的生长因子和细胞活素，分离MSC细胞和培养基，获得富含促血管生成因子和细胞活素的无细胞培养基；4)对步骤3)中所获得的无细胞培养基进行后处理，该后处理步骤包括过滤细胞碎片、纯化该无细胞培养基、检测各有效生长因子的成分及含量、对该培养基进行冻干处理或冷冻保存，即获得抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂。本发明所述制备免疫抑制及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂的方法中，步骤I)所述的健康人血液或骨髄的来源可以是自体来源或异体来源，获得途径可以是直接骨髓抽取或者外周血液中提取，或由血库直接购买的健康人外周血白细胞悬液样本，或通过临床白细胞置換。可选步骤中所述的梯度离心以获取单核细胞的步骤为将所获得的骨髄或外周血液在密度梯度剂中梯度离心，所用的梯度剂可为Ficoll-Paque (GE healthcare)、Histopaque-1077 (Sigma),或其他公司同类产品，优选为Histopaque-1077 ;适用温度范围为15到25°C，优选为25°C。具体操作为将含有骨髄或外周血及梯度剂的容器在200g-500g下离心20-40分钟，分层后，用无菌一次性针管吸取当中不透明层，即为富含单核细胞的悬浮液，经鉴定，此单核细胞群体来源于骨髓髓系干细胞其内所含多种细胞亚群，呈多形性。本发明所述制备抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂的方法中，步骤2)中的培养单核细胞以获得MSC细胞时，所用的培养基可为Ml 19、DMEM、F12、RPMI-1640中的ー种，并可添加有h印arin(0-100U/ml)。培养基中另可含有质量比为5%至20%的胎牛血清或者人血清白蛋白或自体血清。在预设条件为培养温度37°C，ニ氧化碳浓度为5-7%的细胞培养箱中培养。本发明所述制备抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂的方法中，步骤2)中的培养单核细胞以获得MSC细胞的步骤为以下所述方法①至④中的ー种方法①将单核细胞以每平方厘米5X IO5至2X IO6个细胞的密度培养1_2天，去除悬浮细胞，将贴壁的细胞继续培养7-21天。所获I型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干细胞及单核细胞受体。方法②将单核细胞与fibrin微球(直径50-250微米，可由商业途径获得，如Forticell Bioscience)共同培养 1-2 天，姆 IOO-IOOOmg fibrin 微球可吸附 I X IO6 至I X IO8个细胞的密度，去除悬浮细胞，将附着于fibrin微球的细胞继续培养7_21天。所获I型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干细胞及单核细胞受体。方法③将单核细胞通过⑶14，或⑶45特异性抗体进行磁珠分选(MACS ,由德国Miltenyi Biotec公司生产)，筛选出不含⑶14或⑶45的单核细胞亚群，将此⑶14—或⑶45_单核细胞亚群以每平方厘米5 X IO5至2 X IO6个细胞的密度培养1_2天(或用方法②培养)，去除悬浮细胞，将贴壁(或附着于fibrin微球)的细胞继续培养7_21天。所获II 型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干细胞及单核细胞受体。方法④将人脂肪吸取物(lipoaspirate,约50_100ml)在pH = 7. 4的磷酸盐缓冲液(PBS)或O. 9%的医用生理盐水中洗浄，用I型和II型胶原酶(collagenase type I，ILSigma-Aldrich)消化(酶的浓度范围O. 05% -O. 1% )，消化步骤为置于37°C条件下震荡30-60分钟。将消化分散后的单核细胞以每平方厘米5X IO5至2X IO6个细胞的密度培养1-2天(或用方法②培养)，将贴壁(或附着于fibrin微球)细胞继续培养7_21天。所获III型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，即大量表达细胞表面受体⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干细胞及单核细胞受体。本发明所述制备抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂的方法中，步骤3)中所述的在特定条件下培养MSC细胞的方法为以下所述方法①或②中的ー种方法①将步骤2)所获得的I、II、III型MSC置于不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为O. 5%至2%，温度为37°C的环境中培养I至3天，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI-1640、F12、磷酸盐缓冲液(pH = 7. 4)或O. 9%的医用生理盐水，并可添加1%的医用人血清白蛋白或自体血清。方法②将步骤2)所获得的I、II、III型MSC先置于促血管内皮细胞生长的培养基中培养1-2天，此培养基可为M119、DMEM、F12、RPMI-1640、EBM、EBM-2中的ー种，并可添加有O. 5-1 %的生长因子添加剂EGM、EGM-MV, EGM-2或EGM2-MV中的ー种(由瑞士 Lonza公司购买，其中含血管内皮生长因子VEGF-1、碱性成纤维细胞生长因子FGF-2、表皮生长因子EGF，和胰岛素样生长因子IGF-1);或添加有内皮细胞生长因子ECGF(IO-IOOygAil);并可添加有h印arin(0-100U/ml);培养基中另可含有质量比为5%至20%的胎牛血清或者人血清白蛋白或自体血清。1-2天后将MSC转入不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为O.5%至2%，温度为37°C的环境中培养I至3天，所用的培养基为Ml 19、DMEM、RPMI-1640、F12、磷酸盐缓冲液(pH = 7.4)或O. 9%的医用生理盐水，并可添加I %的医用人血清白蛋白或自体血清。在按照上述方法①或②培养完成后，收集富含细胞生长因子的条件培养基，弃去MSC细胞。本发明所述制备抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂的方法中，步骤4)所述的后处理步骤包括①对步骤3)中所收集的无细胞培养基进行过滤，可通过高速离心或过滤器将细胞杂质及碎片去除。②对过滤后的无细胞培养基进行成分鉴定，并对其中所含的代表性促血管及周边组织生长因子及细 胞活素如MCP-I，EGF, MMP-9, MMP-2, PDGF, SDF-I，FGF, VEGF的含量进行鉴定，鉴定方法可为蛋白组学(proteomics),细胞活素阵列(cytokine array),酶联免疫吸附测定(ELISA)，或Bio-Plex 细胞因子测试。③对过滤后的无细胞培养基进行冻干或分装冷冻保存，以便长期保存其中的生长因子及细胞活素成分的活性。图I :本发明所述抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂对对外周血单核细胞(PBMC)中淋巴细胞群増殖活性的抑制作用。图2 :动物实验检测抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂对GVHD模型小鼠的存活率影响。

针对III类MSC细胞的获取方法将人脂肪吸取物(lipoaspirate，约50_100ml)在pH = 7. 4,0. 9%的医用生理盐水中洗浄,用II型胶原酶(collagenase type II)消化(质量浓度O. 075% ),消化条件为于37°C下震荡30分钟。将消化并过滤出的单核细胞在添加有10%人血清白蛋白或自体血清的DMEM培养液中以每平方厘米I X IO6个细胞的密度培养2天，将贴壁细胞继续培养21天。所获III型MSC为纺锤状，具有典型MSC特性，大量表达细胞表面受体⑶90，⑶105及⑶73，并且不含⑶14，⑶34，⑶45等造血干细胞及单核细胞受体。实施例3.抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂的获取。将实施例2所获得的各型MSC置于不含任何生长因子的培养基内，在氧浓度为 O.5%的环境中在O. 9%的医用生理盐水中培养2天(每平方厘米2 X IO5个细胞)，并可添加1%的医用人血清白蛋白或自体血清。培养完成后收集富含细胞生长因子的无细胞培养基，弃去贴壁的MSC细胞。将收集的无细胞培养基通过孔径为O. 2微米的过滤器将细胞杂质及碎片去除井分装于_80°C冷库冷藏备用。视具体情況，每IxlO6个MSC细胞可以制备2-5ml所述抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂。实施例4.抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂中的生长因子及细胞活素的鉴定。实施例3所制得的抗移植排斥制剂中含有的生长因子及细胞活素成分通过细胞活素阵列(cytokinearray)鉴定(由R&D Systems购买)，此抗移植排斥制剂的有效成分包含并不局限于以下生长因子MCP-1、EGF、IL-6、IL_8、MMP-9、SDF-1、HGF、VEGF 以及 PDGF。通过酶联接免疫吸附剂測定(ELISA)，其中有效成分的含量为，MCP-I 5-50ng/ml ;IL_8
1-5 μ g/ml ；SDF-1 :0.5_5ng/ml ;IL_6 5-20ng/ml ；PDGF-BB :0.l-10ng/ml ；VEGF l-20ng/mlo其他成分组成见表I。表I.本发明所述抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)制剂中的成分列表(包含并不局限于以下成分)


本发明涉及一种抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)的制剂及其制备方法，该制剂的制备方法是通过诱导单核细胞获得间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)，进而在低血清条件培养上述MSC细胞，最后分离MSC细胞获得无细胞培养基，并对该无细胞培养基进行相应后处理，即可获得所述制剂。体外和体内实验表明，本发明所述的抑制免疫及治疗移植物抗宿主病(GVHD)的制剂能够显著的抑制受体的免疫反应从而有效的改善GVHD症状。