原发性肥大性骨关节病致病基因的制作方法[0002]原发性肥大性骨关节病(primaryhypertrophic osteoarthropathy ；PH0),也称作厚皮性骨膜病(pachydermoperiostosis ；PDP),是一种很少见的家族遗传疾病，通常表现为:回状头皮增生、杵状指、骨膜增厚和大关节痛，属于常染色体遗传病，严重影响患者的外观，给患者造成巨大心理负担。PHO通常为男性发病，女性较少发病(男女比例为7:1)[4，5]，目前我国所报道的32例病患均为男性。治疗一般采用手术切除增生皮肤。PHO病因尚不清楚，多数人认为本病为遗传性疾病，但由于遗传模式尚未清楚，发病率极低，且由于疾病表现严重导致家族性病例极罕见，因此对于该疾病的致病基因研究较为困难。国外早期的分子方面发病机制聚焦于前列腺素E2 (PGE2)的代谢途径，PGE2是体内普遍存在的脂类代谢物，其产物会扩大炎症区域，故而在体内循环水平较低。研究发现了患者羟基前列腺素脱氢酶(HPGD)基因中负责编码分解PGE2酶(15-PGDH)的部分发生了突变，导致了酶功能的丧失。并在患者和携带者尿液中发现了 PGE2含量的上升。[0003]目前单基因疾病的研究开始大量采用外显子组重测序的方法，最近，外显子组测序(exome sequencing)被成功地应用于发现稀有单基因疾病的致病基因，如Freeman - Sheldon 综合症的 MYH3 基因，Schinzel-Giedion 综合征的 SETBPl 基因，以及严重大脑畸形的 TOR62 突变等(Ng SB, Turner EH, Robertson PD, et al, Targetedcapture and massively parallel sequencing of 12 human exomes.Nature2009，461 (7261):272-276; A H, Bff vB, C G, et al, De novo mutations of SETBPl causeSchinzel-Giedion syndrome.D-9216904(-1546-1718(Electronic));Bilguvar K, OzturkAK, Louvi A, et al, ffhol e-exome sequencing identifies recessive WDR62mutations insevere brain malformations.Nature 2010, 467 (7312): 207-210.)。全外显子测序技术已被证明为降低稀有单基因疾病候选基因甚至发现其致病基因的有力、有效手段，仅通过对几个很少的个体(包括患者及正常对照)的全外显子进行测序来筛选与疾病相关的变异，其成功率大为提升。[0004]本领域中急需找到PHO的致病基因，以及突变位点。
[0005]本研究通过外显子组测序的方法确定了 PHO的致病基因。[0006]在第一方面，本发明涉及PHO的生物标记物，即突变的SLC02A1基因或SLC02A1蛋白，所述生物标记物是具有选自如下的突变的SLC02A1基因或SLC02A1蛋白:[0007]在外显子2 中移码突变(c.121delC;p.L40Cfs*36)；
[0008]在外显子13 中错义突变(c.1781G>A;p.C593Y)；[0009]在外显子12 中错义突变(c.1681C>T;p.R560C)；
[0010]在外显子4中错义突变(c.440G>A;p.W146X)；
[0011]在外显子7-8剪接中错义突变(c.940+lG>A;p.R343H)；
[0012]在外显子5-6剪接中错义突变(c.724+lG>A;p.A241Y)。
[0013]在一个实施方案中，本发明的突变的SLC02A1基因为SEQ ID NO:1的序列中具有以下突变:
[0014]在外显子2中移码突变(c.121delC)；
[0015]在外显子13中错义突变(c.1781G>A)；
[0016]在外显子12中错义突变(c.16810T)；
[0017]在外显子4中错义突变(c.440G>A)；
[0018]在外显子7-8剪接中错义突变(c.940+lG>A)；
[0019]在外显子5-6剪接中错义突变(c.724+lG>A)。
[0020]在一个实施方案中，本发明的突变的SLC02A1蛋白为SEQ ID N0:2的序列中具有以下突变:
[0021]在外显子2中移码突变(p.L40Cfs*36)；
[0022]在外显子13中错义突变 (p.C593Y)；
[0023]在外显子12中错义突变(p.R560C)；
[0024]在外显子4中错义突变(p.W146X)；
[0025]在外显子7-8剪接中错义突变(p.R343H)；
[0026]在外显子5-6剪接中错义突变(p.A241Y)。
[0027]在一个实施方案中，本发明的突变的SLC02A1蛋白为SEQ ID NO:2的序列中具有外显子2中移码突变(p.L40Cfs*36)，在一个具体实例中，所述突变的SLC02A1蛋白的序列是 SEQID NO:31。
[0028]在第二方面，本发明涉及一种检测PHO的方法，所述方法包括检测受试者的SLC02A1基因或SLC02A1蛋白中是否存在突变位点，如果有突变位点，则所述受试者被鉴定为患有PHO或易患ΡΗ0,所述突变位点选自如下任一种或其组合:
[0029]在外显子2 中移码突变(c.121delC;p.L40036)；
[0030]在外显子13 中错义突变(c.1781G>A;p.C593Y)；
[0031]在外显子12 中错义突变(c.1681C>T;p.R560C)；
[0032]在外显子4中错义突变(c.440G>A; p.W146X)；
[0033]在外显子7-8剪接中错义突变(c.940+lG>A;p.R343H)；
[0034]在外显子5-6剪接中错义突变(c.724+lG>A;p.A241Y)。
[0035]在一个实施方案中，SLC02A1蛋白为SEQ ID NO:2的序列表示。
[0036]在一个实施方案中，SLC02A1基因为SEQ ID NO:1的序列表示。
[0037]在一个实施方案中，本发明的检测PHO的方法包括如下至少一组引物扩增的步骤:
[0038]SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ；
[0039]SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 10 ；
[0040]SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 ；[0041]SEQ ID NO:15 和 SEQ ID NO:16 ；
[0042]SEQ ID NO:23 和 SEQ ID NO:24 ；
[0043]SEQ ID NO:25 和 SEQ ID NO:26。
[0044]在一个实施方案中，本发明的检测PHO的方法中检测突变位点通过选自如下的技术进行:测序、电泳、核酸杂交、原位杂交、PCR、逆转录酶链反应和变性高效液相色谱。
[0045]在第三方面，本发明涉及通过PCR检测SLC02A1基因或SLC02A1蛋白突变中使用的引物对，所述突变是选自如下任一种或其组合:
[0046]在外显子2 中移码突变(c.121delC;p.L40036)；
[0047]在外显子13 中错义突变(c.1781G>A;p.C593Y)；
[0048]在外显子12 中错义突变(c.1681C>T;p.R560C)；
[0049]在外显子4中错义突变(c.440G>A; p.W146X)；
[0050]在外显子7-8剪接中错义突变(c.940+lG>A;p.R343H)；
[0051]在外显子5-6剪接中错义突变(c.724+lG>A;p.A241Y)，
[0052]其中所述引物对分别基于选自如下的位置前后设计，使得扩增该位置(编号基于SLC02A1的cDNA序列，724+1表示cDNA序列的724位之后在基因组DNA中是内含子序列，该内含子序列的第一位发生突变，940+1与之类似):121、1781、1681、440、940+1和724+1。
[0053]在第四方面，本发明涉及与突变SLC02A1基因互补的核酸探针，所述突变是选自如下任一种或其组合:
[0054]在外显子2 中移码突变(c.121delC;p.L40036)；
[0055]在外显子13 中错义突变(c.1781G>A;p.C593Y)；
[0056]在外显子12 中错义突变(c.1681C>T;p.R560C)；
[0057]在外显子4中错义突变(c.440G>A; p.W146X)；
[0058]在外显子7-8剪接中错义突变(c.940+lG>A;p.R343H)；
[0059]在外显子5-6剪接中错义突变(c.724+lG>A;p.A241Y)，
[0060]所述探针与突变SLC02A1基因的互补区包括选自如下的位置(编号基于SLC02A1的cDNA序列，724+1表示cDNA序列的724位之后在基因组DNA中是内含子序列，该内含子序列的第一位发生突变，940+1与之类似):121、1781、1681、440、940+1和724+1。
[0061]在第五方面，本发明涉及检测突变SLC02A1基因或SLC02A1蛋白的试剂盒，包含一组或多组引物对，其中所述突变是选自如下任一种或其组合:
[0062]在外显子2 中移码突变(c.121delC;p.L40036)；
[0063]在外显子13 中错义突变(c.1781G>A;p.C593Y)；
[0064]在外显子12 中错义突变(c.1681C>T;p.R560C)；
[0065]在外显子4中错义突变(c.440G>A; p.W146X)；
[0066]在外显子7-8剪接中错义突变(c.940+lG>A;p.R343H)；
[0067]在外显子5-6剪接中错义突变(c.724+lG>A;p.A241Y)，
[0068]其中所述引物对分别基于选自如下的位置前后设计，使得其扩增产物涵盖该位置(编号基于SLC02A1的cDNA序列，724+1表示cDNA序列的724位之后在基因组DNA中是内含子序列，该内含子序列的第一位发生突变，940+1与之类似):121、1781、1681、440、940+1和 724+1。[0069]在一个实施方案中，所述检测突变SLC02A1基因或SLC02A1蛋白的试剂盒包含选自如下的至少一组引物:
[0070]SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ；
[0071]SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 10 ；
[0072]SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 ；
[0073]SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 16 ；
[0074]SEQ ID NO:23 和 SEQ ID NO:24 ；
[0075]SEQ ID NO:25 和 SEQ ID NO:26。
[0076]在第六方面，本发明涉及检测突变SLC02A1基因的试剂盒，包含一个或多个核酸探针，所述突变是选自如下任一种或其组合:
[0077]在外显子2 中移码突变(c.121delC;p.L40036)；
[0078]在外显子13 中错义突变(c.1781G>A;p.C593Y)；
[0079]在外显子12 中错义突变(c.1681C>T;p.R560C)；
[0080]在外显子4中错义突变(c.440G>A; p.W146X)；
[0081]在外显子7-8剪接中错义突变(c.940+lG>A;p.R343H)；
[0082]在外显子5-6剪接中错义突变(c.724+lG>A;p.A241Y)，
[0083]所述探针与突变SLC02A1基因上包含选自如下的位置的区域互补(编号基于SLC02A1的cDNA序列，724+1表示cDNA序列的724位之后在基因组DNA中是内含子序列，该内含子序列的第一位发生突变，940+1与之类似):121、1781、1681、440、940+1和724+1。
[0084]该研究将为PHO的发病机制研究奠定重要基础，有可能为PHO的患者治疗提供全新的理论依据。

[0085]在本发明中，采用本领域通用表示法表示突变。例如，突变(c.1781G>A;p.C593Y)中，c表示cDNA，p表示蛋白质，DNA水平的突变对应蛋白质水平的突变；移码突变(c.121delC;p.L40Cfs*36)中，c.121delC 表示 DNA 水平第 121 位缺失 C，p.L40Cfs*36 表示从40位起算的36个氨基酸的移码，形成的突变蛋白质仅有75个氨基酸，如SEQ ID N0:31中所示；在错义突变(c.940+lG>A;p.R343H)中，c.940+1表示c.940后面是内含子，+1表示该内含子的第I位，这位的G突变为A ;同理在突变(c.724+lG>A;p.A241Y)中，c.724+lG>A表示c.724后面是内含子，+1表示该内含子的第I位,这位的G突变为A。
[0086]野生型SLC02A1基因的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，其中
[0087]外显子1:为1-96 ;外显子2:为97-234 ;外显子3:为235-397 ;外显子4:为398-625 ;外显子5:为626-724 ;外显子6:为725-861 ;外显子7:为862-940 ;外显子8:为941-1105 ;外显子 9:为 1106-1295 ;外显子 10:为 1296-1461 ;外显子 11:为 1462-1625 ;外显子12:为1626-1690 ;外显子13:为1691-1814 ;外显子14:为1815-1932。其中外显子5后的内含子第I位和外显子7后的内含子第I位是G (在本发明中该位置分别以724+1和940+1表示)，该突变影响剪接，从而使得剪接后的蛋白序列分别发生A241Y和R343H突变。
[0088]SEQ ID NO:2:野生型SLC02A1蛋白的氨基酸序列。
[0089]对于本发明说明书和权利要求书中，提及基因序列，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如提及SLC02A1基因的cDNA序列，实际上包括该序列以及其互补序列。例如，提及SEQ ID NO: 1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。
[0090]本申请中的基因序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。例如提及SLC02A1基因的cDNA序列，实际也包括相应的RNA序列。
[0091 ] 实施例1确定PHO的致病基因。
[0092]发明人近几年在国内收集到5例PHO病例，所有患者均表现出回状头皮增生、易出油出汗、杵状指、X光片检测表明长骨骨膜增厚等典型的PHO疾病特征。
[0093]发明人对其中患有PHO的两兄弟(在表1中编号Pl和P2)和其父母的外显子组序列进行了测序。具体步骤如下:
[0094]样品制备:采集所述两PHO患者及其父母家人外周血，利用试剂盒抽提外周血白细胞中的基因组 DNA (RelaxGene Blood DNA System DP319-02.TIANGEN, China)，利用NanoDrop 2000测量DNA的浓度及纯度(Thermo Scientif ic, USA),所得的每个标本基因组DNA的0D260/0D280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于100ng/ul，总量不少于30 μ L.[0095]然后，对上述四个样本的外显子组序列进行了测序。测序平台为Illumina Hiseq2000,依照 Illumina/Solexa 标准建库说明书(参见 http://www.1llumina.com/)进行测序，简述如下:
[0096]I)将基因组DNA随机打断成200_300bp左右的片段，随后在片段两端分别连接上接头制备杂交文库；
[0097]2)文库经纯化后经过连接反应介导的PCR(LM-PCR)的线性扩增与生物素标记的DNA文库进行杂交富集，再经过L M-PCR的线性扩增后进行上机测序,读取长度为90bp，每个样本的平均测序深度最少为50 ；
[0098]3)测序后获得的原始测序片段(reads)由 Illumina basecalling SoftwareI.7 进行处理，经过过滤去污染、使用 SOAPaligner 2.20 (Li R, Li Y, KristiansenK，et al，SOAP: short oligonucleotide alignment program.Bioinformatics2008，24 (5): 713-714 ;Li R，Yu C，Li Y，et al，S0AP2:an improved ultrafast tool forshort read alignment.Bioinformatics 2009，25 (15): 1966-1967)比对参考基因组，获得比对到基因组上的唯一匹配测序片段。靶区域的基因型由S0APsnp(Li R，Li Y, Fang X，YangH，et al，SNP detection for massively p arallel whole-genome resequencing.GenomeRes 2009，19(6):1124-1132)确定。
[0099]结果，在这些样本中分别发现:父亲有84841个单核苷酸多态性(SNPs)和7168处的插入/缺失；母亲有83064个单核苷酸多态性(SNPs)和7149处的插入/缺失；患者Pl有83547个单核苷酸多态性(SNPs)和7160处的插入/缺失；患者P2有82499个单核苷酸多态性(SNPs)和7109处的插入/缺失。
[0100]随后，对结果通过四个公共数据库(dbSNP(vl31): http: //hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hgl9/database/snpl31.txt.gz.； 1000 人:ftp://ftp.1OOOgenomes.eb1.ac.uk/voll/ftp或ftp://ftp_trace.ncb1.nih.gov/1000genomes/ftp ；hapmap:ftp://ftp.ncb1.nlm.nih.gov/hapmap ； 以及 YH 数据 库:http://yh.genomics, org.cn)进行过滤,去掉所有已知的且在数据库中等位基因频率大于0.005的变异。
[0101]发现两患者在基因SLC02A1上都同时具有两个符合共分离的杂合突变点:在外显子2中移码突变(c.121delC;p.L40C);在外显子13中错义突变(c.1781G>A;p.C593Y)。通过家族中2名患者和13位正常人SNP筛查共分离，这个位点可能是致病位点。
[0102]结果显示于表1。SLC02A1负责编码前列腺素转运蛋白，是一个拥有12次跨膜结构的转运子超家族成员。具有14个外显子。能够转运P⑶2、PGEl、PGE2、PGF2a和PGH2。
[0103]因此，发明人认为SLC02A1基因极有可能为PHO的致病基因。
[0104]实施例2在其他病例中确认上述PHO的致病基因。
[0105]接着，发明人纳入其它PHO患者，对SLC02A1基因为PHO的致病基因进行验证。验证中利用sanger法测序验证SLC02A1基因的突变，其中考虑了家系内、家系外、散发等样本验证情况。
[0106]分别对5名患者、20名家系内正常人(即该5例患者的父母，他们均未发病)和384名家系外正常人(即与表2中所有患者无血缘关系的对照)基因进行检测，针对SL0C02A1基因所有外显子序列设计引物，通过PCR扩增，产物纯化，测序的方法获得有关序列，根据序列测定结果属于突变型还是野生型，验证SLC02A1与PHO疾病之间相关性。
[0107]具体方法步骤如下:`[0108]1.DNA 提取:
[0109]分别采取5名家系内患者、20名家系内正常人和384名家系外正常人外周静脉血按照实施例1的方法提取基因组DNA和测定DNA含量。
[0110]2.引物设计及PCR反应
[0111]引物设计参考人类基因组序列数据库hgl9/build36.3，具体见下。
[0112]a)引物序列:
[0113]