专利名称：干细胞修复材料、其制备方法及其应用的制作方法对抗衰老是全人类共同关注的话题。对人体肌肤起支撑作用的物质大部分存在于真皮层，由胶原蛋白、弹性纤维和透明质酸构成的一个纤维网络对皮肤起着支撑作用，其含量的多少决定了皮肤的质地。这三种物质都是从真皮层中的成纤维细胞分泌而来成纤维细胞不断分泌胶原蛋白、弹性纤维和透明质酸来保持皮肤的光泽度和质感。25岁以后，成纤维细胞以每年1%到m的速度减少，随之而来的就是胶原蛋白、弹性纤维和透明质酸的数量均下降，体现出衰老的迹象。成纤维细胞的衰减是导致肌肤衰老的主要原因。成纤维细胞来源于组织周围的间充质细胞，在体内特定环境下间充质细胞具有分化为成纤维细胞的能力。当前的美容医学朝着简单、微创、安全的方向发展，面部老化的治疗也从过去的手术治疗向生物医学制剂注射治疗转化。最早通过FDA验证获得商业应用的软组织填充剂是可溶性的胶原蛋白。从那以后，液体硅胶作为注射填充剂被广泛使用，然而液体硅胶的并发症如移位变形等问题很难处理。当前使用最广泛的填充剂是透明质酸。胶原和透明质酸注射产品属于生物可降解材料，对于矫正软组织缺陷不能起到永久的效果。医学界一直在寻找一种填充剂能够维持更长时间，同时具有较低的并发症和副作用。美容除皱术已经有近百年的历史，目前常用的几种方法简述如下SMAS除皱简单地说，就是人们常说的拉皮手术。即在皮下潜行分离，然后即切除多余皮肤、拉紧缝合。但术后易造成无表情，面部僵硬的“面具脸”。肉毒素(BotoxhBotox是一种神经毒素，注入导致皱纹的肌肉内，作用于周围运动神径末梢、神经肌肉接点及突触处，抑制突触前膜释放神经递质，阻断乙酰胆碱的释放，从而使肌肉张力下降或瘫痪麻痹，皱纹也随之消失，从而达到治疗面部皱纹的效果。此方法操作简单，无肿胀瘀血，见效快，不发生过敏反应等。但是这种方法是以破坏或减弱人体某些正常生理功能为代价而达到去皱目的，因此消费者须慎重。此方法时效短，需要长期反复注射才能维持效果。皮下填充近年来在整形美容界，皮肤填充剂随着材料和注射技术的进步正以空前速度发展。整形美容消费市场对新型皮肤填充剂的需求正培育着新兴产业。胶原类和透明质酸类是该类注射剂的主要产品。这类填充术的主要特点是微创，手术简单，见效快。但是由于这类填充剂是生物可降解材料，故短期内皱纹会再现。其他填充剂如早期的爱贝芙和伊凡露已经逐渐被透明质酸类填充物所取代。运用细胞技术和组织工程技术进行整形美容手术，是现代美容业发展的一个方向。组织工程是20世纪80年代随着现代医学技术的发展，尤其是细胞生物学、分子生物学和生物材料科学的发展而提出来的医学新概念。组织工程的基本原理和方法是将体外培3养扩增的细胞吸附于一种生物相容性良好并可被机体吸收的生物材料上形成复合物，将细胞/生物材料复合物植入机体组织、器官的病损部分，细胞在生物材料逐渐被机体降解吸收的过程中形成新的在形态和功能方面与相应器官、组织相一致的组织，而达到修复创伤和重建功能的目的。
本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种干细胞修复材料、其制备方法及其应用。本发明的干细胞修复材料，包括干细胞和细胞载体，其中所说的干细胞为自体脂肪间充质干细胞，其浓度为106-108/ml，所说的细胞载体为自体血清、0.9%生理盐水或5%葡萄糖注射液。本发明的干细胞修复材料的制备方法，包括下列步骤1)从自体分离脂肪组织，并从中提取脂肪间充质干细胞；2)将获得的脂肪间充质干细胞进行纯化和扩增；3)将脂肪间充质干细胞在106-108/ml的浓度下与细胞载体混合形成干细胞注射物。本发明的干细胞修复材料具有用于在皮下填充除皱，皮下填充修复疤痕，表面涂覆修复烧伤、烫伤、创面的用途。下面从种子细胞和微生理环境方面阐述本发明的优点
组织工程中使用的种子细胞需满足以下几点要求增殖能力强，能进行大规模扩增以产生足够数量的细胞；活力和功能良好；细胞纯度高；不发生免疫排斥反应；生物安全性好。在种子细胞取材方面要考虑几点原则细胞来源广泛，来源充足；取材安全方便，供区创伤小；细胞培养技术简单易行，培养与扩增成本低。本发明中采用的脂肪来源的间充质干细胞完全满足上述需求，被认为是一种非常理想的组织工程种子细胞。脂肪间充质细胞来源非常丰富，平均每300毫升脂肪组织可以获得2-6亿个这样的细胞。另外由于采用病人自身的成体干细胞，避免了伦理争议和免疫排斥反应。脂肪组织取材一般有两种方法，即仪器抽吸法和手术切取法。有实验表明这两种方法对脂肪干细胞的增殖能力和分化能力的影响没有显著差异。仪器吸脂法由于操作简单，创伤小，可作为临床获取组织工程种子细胞的首选方法。适当的微观生理环境是构建具有生命活性的各种组织和器官至关重要的因素。组织内环境包括了不同的细胞因子、组织特异性细胞外基质以及细胞间相互作用等。其中各种营养成分(如氧)的供应是保证组织工程所构建的各种组织具有生命活性的必要条件。自体血清、0. 9%生理盐水、5%的葡萄糖注射液作为细胞载体将有益于机体内各种营养成分在其中的运动，从而为细胞提供养分。本发明中使用的种子细胞是从病人自身脂肪组织内分离纯化制得，因而避免了伦理争议和免疫排斥反应。可以采用仪器抽吸法进行脂肪组织的取材，操作简单，给病人带来的创伤和痛苦小。本发明中使用的种子细胞是脂肪组织内经分离、纯化、培养得到的间充质干细胞。 这些细胞在一定的诱导条件或生理环境下能分化成为成纤维细胞。本发明中使用的细胞载体是自体血清、0. 9%生理盐水或者5%葡萄糖液。混合入脂肪间充质干细胞后可以通过注射器注入病人体内，手术过程非常简单，不留疤痕，从而避免了给病人带来的机体损伤和痛苦，病人容易接受。


图1是脂肪间充质干细胞的照片；
图2-1是脂肪间充质干细胞体外诱导分化成脂肪细胞的照片； 图2-2是脂肪间充质干细胞体外诱导分化成骨细胞的照片； 图3-1是脂肪间充质干细胞裸鼠体内分化为皮肤成纤维细胞的照片； 图3-2是脂肪间充质干细胞裸鼠体内分化为皮肤成纤维细胞时检测角蛋白抗体的的照片；
图4-1是自体脂肪间充质干细胞临床治疗颈纹手术前的照片； 图4-2是自体脂肪间充质干细胞临床治疗颈纹手术后的照片； 图5-1是注射前耳后组织活检照片； 图5-1是自体脂肪间充质干细胞注射后组织活检照片。

1)将通过仪器吸脂法获得的30毫升脂肪组织内血管、结缔组织等多余成分剔除后用含有抗生素的可注射级0. 8%的生理盐水冲洗2-3遍，得到淡黄色的脂肪颗粒组织；
2)向净化后的脂肪颗粒内加入ang/ml的I型胶原酶溶液(美国Worthington公司)于 37°C消化60-90 min，完全培养基(DMEM+10% FBS,均为美国Gibco公司)终止消化；
3)150目筛网过滤人脂肪组织消化后的产物；
4)过滤后以1000转/分钟的转速离心10min,完全培养基重悬，苔盼蓝(中国国药集团)染色后计数；
5)在完全培养基中以lX105/cm2的密度将人脂肪间充质干细胞接种在T25的塑料培养瓶(美国Corning公司)中，并置于37°C、5%的二氧化碳培养箱内培养；
6)细胞长至85%左右时进行细胞传代。传代时先移去血清培养基，然后每瓶加入aiil 0. 25%胰酶(Sigma，美国)室温消化5分钟，显微镜下观察，待细胞变圆后加入血清培养基终止消化，收集消化得到的细胞悬液以1500转/分的转速离心10 min，完全培养基重悬后以 1 3的比例重新接种细胞，待细胞长满后得到第一代细胞。7)细胞培养扩增按照步骤(6)的方法重复进行。得到的脂肪间充质干细胞在显微镜下观察如图1所示。2.人脂肪间充质干细胞的鉴定 (1)人脂肪间充质干细胞生物学特性检测
1)利用倒置显微镜观察各代人脂肪间充质干细胞的细胞生长形态特征及测定细胞生长周期，通过观察测定人脂肪间充质干细胞原代及传代细胞呈梭形贴壁生长，通过对P1、 P2、P3代周期测定，各代均在传代第5-6天进入生长对数期，无明显差异性存在。2)利用免疫荧光的方法对人脂肪间充质干细胞相对特异性标记进行检测。结果显示人脂肪间充质干细胞抗原⑶四、⑶44、⑶71、⑶106呈阳性表达，抗原⑶45、⑶34呈阴性表达。(2)人脂肪间充质干细胞多向分化能力的检测选取P1、P2、P3
代人脂肪间充质干细胞在成脂肪诱导液(基本培养基+胰岛素+地塞米松+吲哚美辛) 培养下，培养9天后油滴样的脂肪细胞出现，继续培养脂肪油滴逐渐增大，第20天油红染色鉴定脂肪细胞，结果阳性。成骨诱导分析选用成骨诱导液(基本培养基+地塞米松+抗坏血酸+ β -甘油磷酸钠)培养，持续诱导培养22天后用茜素红染色鉴定成骨细胞，结果阳性。 脂肪间充质干细胞体外诱导分化结果如图2-1和图2-2所示。实施例2脂肪间充质干细胞/自体血清复合物的制备与检测 1.脂肪间充质干细胞/自体血清复合物的制备
按照实施例1所述方法进行脂肪间充质干细胞的提取分离、培养扩增，将获得的脂肪间充质干细胞混入自体血清中配制成细胞浓度为5X 106/ml的细胞悬浮液。此悬浮液可直接应用于临床治疗。2.脂肪间充质干细胞/自体血清复合物的检测
(1)细胞成活率检测利用苔盼蓝排斥试验对收集得到的细胞进行细胞成活率及细胞数目进行测定，细胞存活率在95%以上；
(2)细胞无菌、无病毒检测参见《中国药典》2005版第三部附录
XII A第73页和《组织工程医疗产品第12部分细胞、组织、器官的加工指南》相关规定，
对培养中的各代细胞进行无菌、无外源性病毒检测；
(3)复合物免疫反应检测在临床试验注射前，取100？ 1复合物对临床实验病人进行皮试，观察无免疫反应出现。实施例3动物实验
将实施例2中的细胞/血清复合物经Iml注射器进行裸鼠皮下注射。注射前将裸鼠全麻，每个注射点的注射量控制在250ul左右，对照组采用等量生理盐水代替注射物。 实验组与对照组每次各选用裸鼠(体重约20g，健康，雄性)5只，两组实验同等条件下重复三次。实验组和对照组裸鼠在注射实验30天后解剖观察，采集注射部位的皮肤进行组织切片染色检查。结果表明实验组裸鼠注射部位的皮肤部位存在外源性人脂肪干细胞，且角蛋白抗体阳性。脂肪间充质干细胞体内分化为皮肤成纤维细胞结果如图3-1和图3-2所示。实施例4自体脂肪间充质干细胞临床治疗颈纹
在病人皱纹局部表面麻醉情况下，将实施例二中的细胞/自体血清复合物沿颈纹注射入真皮层，边注射边退针。手术完成后按照标准的随访跟踪制度对临床效果进行监测。结果显示在皱纹下方注射的复合物未引起免疫反应，复合物能够起到支持组织结构的作用， 原有皱纹得到明显改善。自体脂肪间充质干细胞临床治疗颈纹效果如图4-1和4-2所示。实施例5 自体脂肪间充质干细胞注射前后组织活检对比
局部表面麻醉情况下，依实施例4的方法在病人耳后真皮层注射细胞/自体血清复合物，同样边注射边退针。手术后一个月在病人耳后注射部位和未注射部位分别取长7毫米宽5毫米的皮肤组织，常规HE染色，结果显示注射干细胞部位有明显毛细血管增生现象。自体脂肪间充质干细胞注射前后组织活检对比效果如图5-1和图5-2所示。


本发明涉及一种干细胞修复材料、其制备方法及其用途，包括干细胞和细胞载体，其中所说的干细胞为自体脂肪间充质干细胞，其浓度为105-108/ml，所说的细胞载体为自体血清、0.9%生理盐水、或5%葡萄糖注射液。本发明中使用的种子细胞是从病人自身脂肪组织内分离纯化制得，因而避免了伦理争议和免疫排斥反应。可以采用仪器抽吸法进行脂肪组织的取材，操作简单，给病人带来的创伤和痛苦小。本发明中使用的细胞载体是自体血清、0.9%生理盐水、或者5%葡萄糖液，混合入脂肪间充质干细胞和其他成分之后，可以通过注射器注入病人体内。手术过程非常简单，不留疤痕，避免了给病人带来的机体损伤和痛苦，病人容易接受。