专利名称:链结合的方法本发明提供一种将人类松弛素的A链和B链或者人类松弛素的A链类似物和B链类似物进行结合，以有效的产率产生具有生物活性的人类松弛素或人类松弛素类似物产物的方法。具体地说，本发明包括在PH值大于7.0，并且在使人类松弛素B链温和变性的条件下，将还原的人类松弛素A链及B链或它们的类似物发生结合的方法。通过将混和物维持在自15℃至30℃左右的温度下，并在反应过程中逐渐地暴露于空气氧中，为此该条件提供了一个形成具有生物学活性的人类松弛素或其类似物的环境。本发明也提供具有生物学活性的人类松弛素的类似物。本发明还进一步提供一种以人类松弛素或其类似物作为唯一活性剂用以引产的方法。人类松弛素是一种卵巢肽可在分娩前使产道发生变化，从而促进分娩出生过程。Hisaw，F.L.，Pros.Soc.Exp.Biol.Med.23，661-663(1926)，Schwabe，C.etal.Biochem.Biophys.Res.Comm.75，503-570(1977);James，R.etal;Nature 267，544-546(1977)。松弛素在怀孕期发性激素中占支配地位，但在非孕期女性及男性中也检测出它的存在。Bryant-Greenwood，GD.，Endocrine Reviews 3，62-90(1982)and Weiss，G.，Ann.Rev.Physiol.46，43-52(1984)。取自于猪、鼠、虎鲨(Tiger shark)角鲨及人类的松弛素的氨基酸顺序已经被建立。该激素由二条肽链组成，称为A链及B链，并以双硫键相连接，A链上有一链内双硫键因而以此方式与胰岛素A链相似。然而，松弛素与其它肽类激素，包括胰岛素在内的惊奇而又重要的区别在于它的令人注意的由于种源的不同造成化学结构的变异。例如，猪、鼠及人类松弛素有50%以上的氨基酸位置是不同的。这些区别解释了不同种的松弛素之间低的免疫交叉反应性和许多其它观察到的专一性生物活性上的区别。DNA重组技术的应用已经使得人们能对编码人类松弛素的基因进行分离并确定其特性。Hudson，P.et al.，Nature 301，628-631(1984)and Hudson，P.et al.，The EMBO Journal 3，2333-2339(1984).对c DNA及基因组克隆核苷酸顺序的分析揭示了人类松弛素的结构组织包括一个信号肽，具有25个残基，随后有一个大约32至33个氨基酸的B链、一个大约有105个氨基酸的C肽及一个24氨基酸的A链。对于人类松弛素，有一个基因内区扰乱了C肽的编码区域。比胰岛素C肽长得多的松弛素C肽的生理作用及负责从A链及B链端除去C肽的酶的性质尚未弄清楚。对于人类的松弛素而言，有两个独立的基因顺序已经被确定了。Id.在怀孕期这些基因中仅有一个基因(H2)在卵巢中获得表达，然而究竟其另一个的基因在其它组织位点被表达呢，或是它代表了一个假基因呢，这一点还不清楚。人类的这两个松弛素基因在核苷酸及氨基酸上显示了互相间的相当多的同系性，尤其是对于B肽及C肽而言。然而，也存在着一些值得注意的顺序上的歧异，特别是在A链及B链的末端氨基区域。参见图1。从H2松弛素在卵巢中被合成及得到表达的这一事实，可推测该顺序参与了孕期生理变化。最近的论文中，报导了约翰斯通等(Johnston et al.，)曾对合成的人类松弛素(H2)及某些人类松弛素类似物的生物学活性进行了测定。Johnston，P.D.et al.，In PeptidesStructure and Function，Proc.，Ninth American Peptide Symposium，Deber，C.M.，Hruby，V.I.and Kopple，F.D.(eds.)(Pierce Chem.Co.，1985)他们确定了对于生物学活性所必需的松弛素核心及可替代甲硫氨酸而不影响其生物活性的某些氨基酸。Id。表1对已知的不同种的松弛素氨基酸的顺序作了比较。除了六个半胱氨酸残基及位于侧翼的甘氨酸残基外，仅有B-链上的位于7位上的异亮氨酸、12位及16位上的精氨酸及32位上的亮氨酸被保留。半胱氨酸残基无疑对维持整个双硫键构型是必需的。Blundell，T.et al.InBigazzi，M.，Greenwood，F.C.，Gaspari，F.(eds.)Biology of Relaxin and its Role in the Human，(Excerpta Medica，Amsterdam，1983)pp.14-21.值得注意的是，在松弛素分子中，即含有松弛素蛋白质的活性部位的A链及B链中的绝大多数位置上的氨基酸是随种源而变化的。这一点事实上与所有的包括胰岛素在内的其它肽激素族形成了鲜明的差别。松弛素结构的另一特点为B链的氨基及羧基末端区域长度的变化及A链具有一个较短的氨基末端。松弛素的化学合成特别困难，其原因极大地是因被分离的B链的不寻常的溶解性及其结构特点。Tregear，G.W.et al.，InBigazzi，M.，Greenwood，F.C.and Gaspari，F.(eds.)Biology of Relaxin and its Role in the Human，(Excerpta Medica，Amsterdam，1983)，pp.42-55。如上所述，人类松弛素，事实上是哺乳动物松弛素普遍地与胰岛素有某些结构上的相似点。胰岛素与松弛素都在两条链的链间及链内具有双硫键。James，R.et al.，Nature 267;544(1977)and Schwabe，C.and Mc Donald，J.R.Science 197，914(1977)。因而，足以推断曾成功地运用于胰岛素的合成方法也同样可用于松弛素。Busse，W.D.and Carpenter，F.H.，Biochemistry 15 1649(1976)，Katsoyannis，P.G.et al.，Biochemistry 6，2656(1967)andKung，Y.T.et al.，Scientia Sinica 15 544(1966)，采格·G等人及格林沃特·F.C.，爱勒斯维亚等人企图利用半胱氨酸巯基的选择性保护单独链方法合成松弛素。Tregear，G.et al.，InRelaxin，G.D.Bryant-Greenwood，Niall，H.D.and Greenwood，F.C.(eds.)Elsevier，New York，1981，他们发现通过胰岛素法制备的合成肽检测出与松弛素相似的生物反应活力，但专一性活力及结合产率非常低。在151是同样的(Id at 151)。猪的松弛素的结合产率低的一个原因为全长的猪的松弛素B-链在PH10.5溶液中的不溶性造成的。采格及休泊等人(Tregear et al.，Supra.)在两个方面对现有的胰岛素的化合方法作了改进用丙酮沉淀混和的猪巢松弛素链以除去还原剂，以及在氧化步骤中加入0.5MNaCl。结果提高了猪松弛素的产率。同时请参见欧洲专利申请第83.304662.6号及欧洲专利申请第83307553.4号。张斯等人(chance et al.，)在1983年12月20日发行的美国专利第4，421，685号揭示了用硫醇还原剂在水介质中于控制的PH及温度下，在同一个单一步骤中完成还原和氧化反应，使S-磺化形式的胰岛素A和胰岛素B链结合以生产胰岛素或其类似物的方法。这一用于改进上述胰岛素合成的方法被发现不能运用于人类松弛素的合成。
人们已经发现在特定的反应条件下，并对条件进行控制，可将人类松弛素还原链结合起来以产生达到有用水平的人类松弛素或其类似物。因而，本发明的一个目的是提供一种人类松弛素的A链及B链结合的方法，至于这些链的来源则与本发明无关，例如，可以用化学合成或通过重组DNA技术，以可被利用的得率产生具生物活性的人类松弛素。
本发明的另一方面是生产具有生物学活性的人类松弛素的类似物。
本发明的再一方面是以人类松弛素或其类似物来作为引产的用途。
本发明是针对使人类松弛素A链或其类似物与人类松弛素B链或其类似物的结合，以生产具有生物学活性的人类松弛素或其类似物的方法。具体地说，该方法包括在PH值大于7.0而使人类松弛素B链在温和变性的条件下，将还原的人类松弛素A链或其类似物与人类松弛素B链或其类似物发生结合反应，并在反应的过程中使之逐渐地暴露于空气氧中的方法。
附图简要说明图1AB显示了人类松弛素H1及H2与人类胰岛素及猪(P)及鼠(R)松弛素之间缺乏同系性。数码系统是以H2松弛素为基准的。松弛素的双硫键为A10-A15，A11-B11及A24-B23。
图2(a)及图2(b)分别显示H2(B33 A24)BL y s4BA l a2 5]]>与H2(B33 A24)的体外链结合反应的高压液相色谱法时程曲线(HPLC time course)。图中对显于人类松弛素类似物或人类松弛素及一个可能的重要分子内A链氧化中间物的形成的体外结合反应时程进行了描绘。描绘了基因2A及B链肽转化至H2人类松弛素类似物及H2人类松弛素。层析采用一个Synchropak R P-C4(4.6×250mm，300 )。在0.05%(TFA)三氟乙酸、H20缓冲液中的乙腈液线性梯度(在500分钟内梯度浓度15→60%)流速为1ml/min。
图3显示结合了人类基因-2松弛素H2(B2-33 A24)BL y s4BA l a2 5]]>的链与天然人类松弛素结合的链生物活性(MPS)。
图4显示了将各种不同剂量的人类松弛素的类似物，H2(B2-33 A24)
及H2(B33 A24)
用于灵长目动物的改进的毕晓普氏计分法计分(Bishop score)。
此处所称之“人类松弛素”或“人类松弛素类似物”是指可改变产道以加快生育过程的一类功能蛋白。据了解改变产道包括诸如子宫颈的成熟、孕期子宫之子宫内膜的变厚及增进该区域的血管形成作用，以及对胶原蛋白合成的影响等生理作用。人类松弛素同样可存在于女性乳房中并且可能与乳汁生成有关。人类松弛素同样被发现也存在于人类之精液中并可能促进人类精子的泳动能力。人类松弛素对子宫颈产生的作用可以增加精子穿过子宫颈的能力。人类松弛素可以提高皮肤弹性，对结缔组织产生影响。
人类松弛素类似物除了功能上的定义外，在结构上是指一类具有包括人类松弛素A链及B链的基本结构的蛋白质。人类松弛素之类似物通过与人类松弛素A链和/或B链上的一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、增加或修饰而与天然产生之人类松弛素不同，但须补充说明的是人类松弛素类似物却保留了类似松弛素的生物学活性。这些人类松弛素之类似物的例子如下，但不尽于此一条全长的A链及一条羧基末端缩短的B链，H1(B2-27 A24)BA l a2 5]]>;H2(B2-25 A24);H2(B33 A24);H2(B33 A24)
H2(B2-33 A24)
H2(B2-33 A24)
及H2(B33 A24)
命名法如下H1、H2是指编码人类松弛素的两条人类基因。H2已明确为在人类卵巢中表达，而H1仅为一基因组克隆。A及B分别指人类松弛素的两条链。A或B后的数字是指链的长度，即A或B链包含的氨基酸数目。氨基酸以惯用的三字母符号来表示。氨基酸符号之前的下标是指明该氨基酸位于A链或B链，而氨基酸符号之后的上标则是标明该氨基酸在链中的位置。
松弛素A链及B链或其类似物的链可以用经典的蛋白合成方法来获得，包括用在溶液中或用固相技术或用DNA重组技术或从人类松弛素来制取或合用上述的方法，例如，用化学合成制一条链而用DNA重组制另一条链。单独的肽链通过固相合成方法来合成，Barany，G.and Merrifield，R.B.(1980)in The Peptides 2，1-284.Gross，E.and Meienhofer，J.Eds.Academic Press，New York.被保护的N-叔丁基氧碳羰氨基酸系购自Peninsula实验室公司(Peninsula Laboratories Inc.)采用了以下的侧链保护作用精氨酸，甲苯磺酰基、天冬酰胺，呫吨基;天冬氨酸，苄基酯;半胱氨酸，甲氧苄基;谷氨酰胺，呫吨基、谷氨酸，苄基酯;组氨酸，甲苯磺酰基;赖氨酸，邻-氯苄基氧羰基;丝氨酸，苄基;苏氨酸，苄基;酪氨酸，2，6-二氯苄基。首位氨基酸用在二甲基甲酰胺中的氟化钾与氯甲基聚苯乙烯(1%二乙烯基苯)成酯。取代水平为0.6毫克当量/克。用存在于二氯甲烷中的二环己基碳二亚胺(蒸馏的)使和氨基酸偶合。精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸及半胱氨酸残基在二氯甲烷/二甲基甲酰胺为50/50的介质中偶合。用45%三氟乙酸、5%苯甲醚、5%乙二硫醇及45%二氯甲烷除去叔丁基氧羰基团。在偶合之前先用10%的三乙胺的二氯甲烷溶液进行中和。用苯甲醚及甲基乙硫醚的液态无水氟化氢(3∶1∶20V/V/V)溶液，于0℃作用一小时以使之从树脂上裂解并去除所有的保护基团。用10%含水乙酸从树脂上洗出A链粗品并通过冷冻干燥。B链粗产物首先用80%含水乙腈洗涤然后用30%含水乙酸洗下，最后用水稀释并冷冻干燥而使之从树脂上除去。肽的粗品被溶解于100毫摩尔的二硫苏糖醇，然后用含0.1%三氟乙酸的10%乙腈水液进行稀释至大体积。该溶液注入5×55cm的用多孔层实心球C18(300A 15-20微米)填充的柱中，用0.1%三氟乙酸水液洗涤，并用乙腈进行梯度洗脱。含肽的组份被收集并冷冻干燥，然后分析氨基酸组成、氨基酸序列并进行反相HPLC分析。当采用先前的胰岛素或猪松弛素方法时，半胱氨酸残基不由磺化作用或其它衍生作用进行保护。Means，G.E.and Feeney，R.E.，Chemical Modification of Proteins(1971)本发明通过将人类松弛素A链及B链处于还原态的方法提高了产率及肽的溶解性。还原的并被冷冻干燥的A链及B链被直接地用于所有重组合反应，而不转化为其磺酸化衍生物，也不使用其它的半胱氨酸巯基保护基。
在执行本发明之方法时，人类松弛素A链和B链或其类似物的A链及B链结合以形成人类松弛素或其类似物的作用可以发生在两种链的比例变化十分大的范围内。当然结合作用固然受到存在较少量A链或B链的限制。过量的B链抑制链的结合，而A链的摩尔数略微大于或等于B链则较佳。尽管并非是必要的，但一般地惯用的A链与B链的重量比例在大约1∶0.5至大约3.0∶1的范围内。实行本发明采用的最佳的A链与B链的重量比在大约自1∶1至大约2.5∶1的范围内。还经发现，在这较佳范围之内的某些比例对于生产某种特殊的松弛素类似物特别有利。因而，对于结合人类松弛素A链及B链以生产去甲硫氨酸(desmethionine)的松弛素，A链与B链优先采用比例在大约1.2∶1至大约2∶1的范围。
另一个可使本发明的方法在最佳水平实行的重要的参数为反应介质中的蛋白质浓度。本方法可在一个非常广泛的蛋白质浓度范围内执行。但是，一般地，蛋白质的浓度是在大约每毫升反应介质中含0.1至大约10毫克的范围内。蛋白质的浓度最好是在大约每毫升0.5至大约5毫克的范围内。进一步还发现，在较后的这个范围内，蛋白质的最佳浓度取决于欲生产的人类松弛素。
本发明的方法是在一个含水介质中进行的。在室温下所测的介质PH值一般在大约7.0至大约12的范围内。优先采用自大约7.5至大约11.0的范围内，并最好是维持在大约自8.0至大约10.6的范围内。可以加入合适的缓冲剂以使介质PH值维持在需要的范围内。典型的缓冲剂有，例如，甘氨酸盐(glycinate)、碳酸盐(carbonate)、三羟基甲基甲胺、焦磷酸盐及其它可以将PH值控制在上述范围内的缓冲剂。普通且较好的缓冲剂为三羟基甲基甲胺(PH8至9)及甘氨酸盐(glycinate)(PH9.5至11.0)。
混合反应在大约15℃至大约30℃的温度下进行，而且在大约自20℃至大约25℃的温度较好，且最好是在室温下。
缓冲剂的浓度一般在自大约0.025M至大约0.2M的范围内。浓度在自大约0.05M至大约0.15M范围内较好，且最好是大约0.1M。
本发明方法的条件之一是使该反应发生在对暴露于空气氧进行控制的环境。据发现，控制氧化可以通过首先将所有溶液用氮吹气来实现，使反应开始时发生在一个封闭氮吹气容器，然后在封闭容器中，可以通过敞开空气而直接与空气接触，也可将氧气通入介质而使之与氧气接触。
本发明的方法的另一个条件是，该反应发生在一个使人类松弛素B链温和变性的条件下。变性剂有尿素、胍盐酸盐及其它的高离液序列剂(chaotropic agent)、盐类、洗涤剂及有机溶剂(乙腈、乙醇、二甲基甲酰胺等等)，这些一般的熟练操作人员所知的变性剂均可使用。较好地采用一定体积百分比(低于10%)的尿素及乙腈等有机溶剂来获得使人类松弛素B链温和变性的条件。
人类松弛素A链及B链以游离的半胱氨酸还原态形式被引入合适的含水介质中。从PH2水溶液中，先加入新鲜原料5mg/mlA链，继而加新鲜原料5mg/mlB链以开始反应。用Na OH来调节的PH值。每步反应均用RP-4反相分析HPLC来监测以期最大程度形成结合的松弛素，然后加入冰醋酸使PH值至4以终止反应。Snyder，L.R.and Kirkland，J.J.in Introduction toModern Liquid Chromatography(1979)混合物继而在16，318g′s下离心30分钟，上清液用制备型反相HPLC来纯化。Id.据观察，在室温之下进行结合反应对于产生有效产率的人类松弛素至关重要。用Synchropak RP-4(4.6×250mm，300
)反相柱进行高性能液相色谱分析工作。用Synchropak RP-4(1×50cm，300
)或手填的多孔层实心球RP-4或RP-18(5×50cm)300
反相柱来进行准备工作。分析型的HPLC用一个沃特系统(water′s system)来进行。制备型的HPLC用一个沃特系统或Prep500来进行。
一旦反应完成之后，可用蛋白质分离


一种结合人类松弛素A链及B链以生产人类松弛素或新颖的人类松弛素类似物的方法，包括将还原态的人类松弛素A链及还原态人类松弛素B链在pH值自大约7.0至大约12的水介质中，在室温及使松弛素B链温和变性的条件下，结合以形成人类松弛素或新颖的人类松弛素类似物。