专利名称：一种向小麦中导入异属抗白粉病基因的方法 小麦白粉病(Erysiphe graminis f.sp.tritici)是一种世界性病害，过去主要发生在冰冷、潮湿、多雨地区。近些年来，由于生产水平提高所带来的化肥投入增加、种植密度提高、灌溉条件改善等原因，小麦产量稳步提高，同时也为白粉病流行提供了适合的田间环境，导致小麦白粉病危害地区和发生频率逐年扩大，白粉病已经上升为我国小麦的首要病害，成为影响和限止小麦稳产和高产的最大障碍。随着小麦白粉病发生面积和频率的增加，白粉病病菌的生理小种变异频繁。目前，我国已发现了74个生理小种，这些小种流行于不同的麦区和不同的年份，抗病品种的选育工作往往落后于优势小种的变更，加上抗源贫乏等诸多因素的影响，大多数小麦品种很难保持较好的白粉病抗性。簇毛麦(Haynaldia villosa或Dasypyrum Villosum(L)Shur，2n＝14vv)属小麦亚族簇毛麦属，是一年生二倍体禾本草。它分蘖力强，小穗数多(每穗有28-43个小穗)，耐旱，籽粒蛋白质含量高(22-24％)，高抗白粉病，对全蚀病(I.L.Laursen et al 1973年)、眼斑病(A.Yildirim et al，2000年)、Wheat Curl Mite和WSMV(Hongjie Li etal 2001年)均有较强的抗性。最早报道簇毛麦抗白粉病基因Pm-v对84个来自美国、德国、中国的小麦白粉病菌菌系均表现免疫和高抗，是目前已知抗性基因中抗性最强、抗谱最广的，该基因在小麦遗传背景下均能很好表达，呈显性遗传。因此，它被小麦遗传育种工作者所青睐，成为小麦遗传改良的重要种质源。但是，据Sears(1995)报道，簇毛麦染色体组V与普通小麦的A.B.D组染色体亲缘关系较远，常规的远缘杂交程序难以把簇毛麦的有益性状导入到普通小麦中。发明创造内容本发明的目的是提供一种利用现代生物技术，快速、有效地向小麦中导入异属抗白粉病基因的方法。本发明方法是通过如下技术方案实现的一种向小麦中导入异属抗白粉病基因的方法，包括以下步骤1)硬粒小麦与簇毛麦远缘杂交，幼胚或幼穗离体培养，再生得到硬粒小麦-簇毛麦异源双二倍体；2)硬粒小麦-簇毛麦双二倍体与普通小麦回交转育后，对杂交种子再生植株的花药进行培养，获得加倍单倍体植株；自交和定向选择，获得具有簇毛麦抗白粉病基因的小麦。所述远缘杂交过程中，对硬粒小麦-簇毛麦杂交种幼胚或幼穗离体培养获得的具有绿芽点愈伤组织进行秋水仙素处理，实现染色体加倍。所述秋水仙素浓度一般为100-200ppm，处理时间为6-10天。较优选的秋水仙素浓度为150ppm，处理时间为8天。为了使目的基因渐渗，所述硬粒小麦-簇毛麦双二倍体与普通小麦回交转育后，对杂交种子再生植株的花药进行培养之前，对杂交种子的幼胚进行继代培养。所述继代培养进行2-3次。再生植株进行花药培养的目的是快速纯和基因，缩短选育年限。花药培养过程中经过自然加倍，产生再生植株。这些再生植株的基因纯合，其自交后代不易发生显隐性基因分离的现象，遗传性状比较稳定。对本发明方法获得的抗白粉病小麦进行目标性状跟踪，同工酶、细胞遗传学分析，原位杂交和分子标记，确定已成功地将簇毛麦抗白粉病基因导入到普通小麦中，其遗传组成正确。
本发明方法利用有性杂交和幼胚、幼穗、花药培养技术，把簇毛麦的有益性状导入普通小麦，有效解决了常规远缘杂交中，杂交不亲和性、杂种后代疯狂分离及选育年限久远的难题。创造的双二倍体、异源代换系、易位系、端体系为小麦育种提供了可直接利用的种质，对促进农业的发展具有重要的理论研究和实际应用价值。


图1为硬粒小麦-簇毛麦双二倍体的构建流程2为6D/6V异代换系RW14和RW15的构建流程3为谷草转氨酶(GOT)电泳图谱图4-A及图4-B为RAPD分子标记电泳图谱图5为6DL/6VS易位系Pm97033的构建流程6为RAPD分子标记电泳图谱图7为6VS端体系的选育流程8为6VS端体系原位杂交9为醇溶蛋白电泳图谱图10为psr8/EcoR V RFLP图谱图11为psr546/Dra I RFLP图谱

实施例1、利用幼胚、幼穗培养技术创造硬粒小麦-簇毛麦双二倍体1、选育过程利用远缘杂交种幼胚和幼穗离体培养技术，加速扩大杂种群体，由一个杂种胚继代培养半年到一年的时间，获得百余株或千余株再生植株。
用不同浓度的秋水仙素处理硬粒小麦/簇毛麦杂种具绿芽点的愈伤组织，再生出染色体加倍了的异源双二倍体。平均加倍率(加倍成功株数/成活株数)达到78.8％，是组培过程中自然加倍率的6.3倍。其中D311/H.V的加倍率最高，为96.9％，秋水仙素浓度150ppm处理8天的效果最好。
硬粒小麦-簇毛麦双二倍体的构建过程如图1所示。
2、白粉病抗性鉴定簇毛麦对现有白粉病菌系都表现全生育期免疫或高抗。这种抗性在硬-簇双二倍体中也能很好地表达，尽管它们的母本硬粒小麦高度感染白粉病。硬粒小麦-簇毛麦双二倍体主要农艺特征如表1所示。
3、生化标记利用乙醇脱氢酶(ADH)生化标志检测双二倍体，发现双二倍体ADH酶谱除具有双亲谱带外，还有一条双亲ADH酶结构基因共同作用形成的谱带。酯酶(EST)同工酶谱中发现在负极有二条重组四倍体81081A和墨75的特征带，硬粒小麦D311没有这二条酶带，而且发现与颖壳上蜡粉相关的特异带，有蜡粉的TH1W、TH2W和TH3W均缺失此带。
4、染色体组成及农艺性状硬粒小麦-簇毛麦双二倍体TH1和TH1W(81086A/H.V)、TH2W(D311/H.V)、TH3和TH3W(墨75/H.V)体细胞染色体数2n＝42，染色体组为AABBVV。它们的株高、穗形都近似母本，而颖脊刚毛、叶鞘茸毛、穗轴易折等特性则为簇毛麦所特有。籽粒浅红，蛋白质含量19.3-22.6％，比相应母本高15-33％，对白粉病免疫。
表1 硬粒小麦-簇毛麦双二倍体主要农艺性状

实施例2、以硬粒小麦-簇毛麦双二倍体TH3为桥梁，向普通小麦导入簇毛麦抗白粉病基因。
硬粒小麦-簇毛麦双二倍体TH3具有簇毛麦抗白粉病、高蛋白质含量的优点，也携带有簇毛麦的不良性状穗轴易断，颖壳硬，不易脱粒，茎秆细软等，所以不能直接应用于生产或小麦育种计划。
1、通过回交转育和幼胚、花药培养创造6D/6V异代换系RW14和RW151)选育过程用宛7107、陕7859(河南省大面积栽培品种)和冀麦30(河北省栽培品种)进行回交转育，逐代选育2n＝42，抗病及结实率高(每穗粒数大于20粒)的单株进行回交，在TH3/宛7107//2×冀麦30/3/陕7859组合中获得杂交种子5粒(来自同一杂交穗)。
对5粒杂交种子进行幼胚继代培养2-3次，5个幼胚均生长出愈伤组织，但是仅两个幼胚的愈伤组织(HV90940和HV90941)分化出绿苗，其中HV90940获得29株再生植株，HV90941获得19株再生植株，所有再生植株皆对白粉病表现免疫。
对HV90940的SC2代中农艺性状表现较好的HV90940-G1-N2进行花药培养，获得加倍单倍体8株。经连续3年自交后代的抗性鉴定，对白粉病都表现免疫。在DH3代定名为RW14(包括94G22-1，94G25-1等)。
对HV90941的19株抗病株继续进行自交和定向选择，从SC5代选育出94G32-1、94G33-1，定名为RW15。
6D/6V异代换系RW14和RW15的构建过程如图2所示。
2)白粉病抗性鉴定用北京地区的白粉病混合菌种进行鉴定，RW14和RW15及与感病品种杂交F1均表现免疫，其F2代抗∶感比例为3∶1，说明它们的抗性是由一对显性基因控制的。
用84个来自美国、德国、中国的小麦白粉病菌菌系进行苗期接种鉴定，发现簇毛麦、TH3及RW14、RW15对所有参试的白粉病菌系表现免疫和高抗，其中表现免疫的有63个小种，占83％；表现高抗的有21个，占17％，是目前已知抗性基因中抗性最强、抗谱最广的。该基因在硬粒小麦、普通小麦遗传背景中均能很好表达，呈显性遗传。
3)细胞遗传学和生化鉴定染色体数与染色体构型RW14和RW15根尖细胞染色体数为42，花粉母细胞PMCMI的染色体构型为21个二价体，与感病品种测交F1PMC MI的染色体构型为20II+2I。
原位杂交用荧光标记的簇毛麦基因组总DNA作探针，进行根尖细胞染色体原位杂交，RW14和RW15均能显现出2条簇毛麦染色体。染色体C-分带结果表明，这2条染色体都是6V染色体，其特征是短臂有较强的端带和着丝粒带；长臂有较强的中间带和次端带，并有一条较弱的端带。
重双端体测交用中国春6A、6B、6D重双端体对RW14进行测交，杂种F1PMC MI染色体构型的观察结果表明，CS6ADDT/RW14和CS6BDDT/RW14为19II+1III+2I，而CS 6D DDT/RW14为20II+1I+2t，由此证明RW14为6D/6V异代换系。
谷草转氨酶(GOT)电泳分析Hart(1975)指出，GOT是由第6部份同源群染色体6A、6B和6D上的GOT结构基因编码形成的。本发明电泳图表明，在COT-2区，簇毛麦有一条带，RW14和RW15有三条带其中一条与簇毛麦相同，一条与普通小麦相同，第三条带迁移率居中，由普通小麦、簇毛麦GOT结构基因共同编码形成的。由此，进一步证明RW14和RW15为6D/6V异代换系。谷草转氨酶(GOT)电泳结果如图3所示，其中，1.苏联簇毛麦；2.TH3；3.RW15；4.6V附加系；5.Pm97033；6.Pm97034；7.Pm97035；8.C.S；9.Wan7107；10.RW15。
4)RAPD分子标记对RW14等6D/6V异代换系的抗白粉病基因进行RAPD分子标记检测，发现OPAN031700、OPAI01700、OPAL03750等均可作为RW14的分子标记。标记结果如表2所示，标记电泳结果如图4-A及图-4B所示。
表2 RW14及其亲本的RAPD分子标记NO.Wheat lineOPAN031700OPAI01700OPAL03750OPAD17480OPAG156001 H.villosumM+ M+ M+ M+ M+2 M75 - - - - -3 Wan7107 - - - - -4 Shan7859 - - - - -5 Jimai30 - - - - -6 TH3 M+ M+ M+ M+ M+7 RW14 M+ M+ M+ M+ M+5)农艺性状RW14和RW15是首例通过组织培养获得的普通小麦-簇毛麦6D/6V异代换系，它们起源于同一杂交组合同一穗。前者早熟、秆较高、纺形穗、白粒；后者中熟、秆较矮、分蘖较多、方形穗、红粒。它们的抗性和农艺性状均能稳定遗传。
2、通过回交转育和幼胚、花药培养创造6DL/6VS易位系Pm97033、P97034和Pm97035。
1)选育过程以河南省推广品种宛7107为回交亲本，对TH3/宛7107×4代的杂交种子进行幼胚培养，在SC5代获得抗性不再分离的株系Pm931069-2、Pm931069-3。然后进行花药培养，加速农艺性状纯合。在DH3代获得抗性和农艺性状不再分离的Pm97033、Pm97034和Pm97035。6DL/6VS易位系Pm97033的构建过程如图5所示。
2)抗白粉病性鉴定三个易位系白粉病菌15号小种和北京地区混合菌种均表现全生育期免疫，与感病品种测交F1也表现全生育期免疫，呈显性遗传。
3)细胞遗传学分析上述三个系的体细胞染色体数为2n＝42，均能见到4个具有随体的完整染色体，表明易位与1B、6B染色体无关。花粉母细胞减数分裂中期I，染色体基本构型为21II。用中国春重双端体进行测交，发现CS 6A DDT/Pm97033、C.S 6BDDT/Pm97033的F1PMC MI染色体基本构型为20II+tIt，而CS 6D DDT/Pm97033 F1PMCMI染色体基本构型为20II+It+t，说明Pm97033是与6D有关的易位系。
4)原位杂交用生物素标记的簇毛麦基因组DNA作探针与Pm97033、Pm97034和Pm97035染色体进行原位杂交，表明它们均为罗伯逊式易位，易位断点在着丝点附近。
5)同工酶分析谷草转氨酶(GOT)分析表明Pm97033、Pm97034和Pm97035均缺少由6VL染色体上GOT-2结构基因所编码的特征带，而具有6AL、6BL和6DL染色体上GOT-2结构基因所编码的特征带，说明这三个易位系含有6AL、6BL和6DL染色体臂，缺少6VL染色体臂。
籽粒醇溶蛋白(Gli-2)电泳图谱表明，三个易位系均具有6VS上结构基因编码的特征带，缺少6DS上结构基因编码的特征带。说明它们均缺少6DS染色体臂，而含有6VS染色体臂。
6)RAPD标记以OPAN03为引物进行扩增，簇毛麦和易位系均能扩增出OPAN031700的特征带。RAPD分析图谱如图6所示，自左向右，1)分子量标样，2)墨75，3)Wan7107，4)Pm97033，5)Pm97034，6)Pm97035，7)H.V.，8)TH3，9)抗病代换系，10)抗病附加系。特征带为OPAN031700。
7)农艺性状易位系在株型、穗形和籽粒性状上与轮回亲本宛7107相近，不表现簇毛麦及双二倍体的任何野生性状，也没有南京农大选育的6AL/6VS易位系的黑芒性状。株高73-78cm，每穗39-43粒，棒形穗，长芒、红粒、千粒重42-44克，半角质。
3.从普通小麦CA9211与6D/6V异代换系RW15杂种幼胚培养后代中选育6DL/6VS抗病易位系和端体系1)选育过程以普通小麦CA9211为母本与6D/6V异代换系RW15进行杂交，28个杂种幼胚在SD2培养基上诱导愈伤组织，SD1培养基上继代培养两次，1/2MS培养基上分化绿苗。共获得再生植株117株，平均每个幼胚产生4.2株。共移栽成活77株，经抗病性鉴定，SC1代抗∶感株比例为32∶45；抗病株顺序编码为T240-1到T240-32，选育过程如图7所示。
2)抗病性与生化鉴定在SC2代对21个株系579株进行抗病性鉴定，抗∶感＝221∶358。然后对抗病单株进行谷草转氨酶(GOT-2)电泳分析。结果表明21个SC2代株系中有9个株系(42.9％)的35个单株(16.1％)发生GOT-V2的特征带的缺失，即缺少6VL染色体臂。其中T240-6、T240-7及T240-25 3个株系的所有抗病单株均缺失GOT-V2特征带，即说明它们是臂间易位系或6VS端体系。
表3、T240组合SC2代株系的抗病性及GOT-V2鉴定结果


3)细胞遗传学和原位杂交分析T240-7抗病株的根尖细胞染色体数2n＝42。用生物素标记的簇毛麦基因组DNA作探针，进行原位杂交，发现T240-7的抗病株均是杂合的臂间易位系。
T240-6-1和T240-6-12根尖细胞染色体数为2n＝41+t，原位杂交证明“t”端体是6VS，它们是单端体异代换系。对T240-6-12自交后代SC4代进行抗病性鉴定，抗∶感为118∶2。到SC5代鉴定出双端体异代换系T240-6-12-2-6，其28株全部抗病，根尖细胞染色体数2n＝41+2t，如图8所示，原位杂交图中可以清晰看到两个簇毛麦端体6VS。
T240-6-2根尖细胞染色体数为2n＝41+2t，原位杂交证明它是簇毛麦双端体异代换系。
4)农艺性状端体系农艺性状良好，株高82.2±5.8cm，穗长9.5±1.0cm，每穗小穗数20.3±1.4，每株穗数4.7±1.6，每穗可育小穗数17±1.1，结实87％±2％，千粒重40.4克。对白粉病免疫。其抗病基因取名为Pm-v。
实施例3、以小麦-簇毛麦异源易位系Pm97034和6VS端体材料T240-6-12和T240-6-12-2-6为材料，进行Pm-v抗白粉病相关基因的克隆1、采用玻璃针显微切割、单管技术体系及LA-PCR，构建了6VS DNA特异质粒文库。
1)文库含有17000个重组克隆，插入片段长度为100-1500bp，平均600bp。其中63％的插入序列克隆为单/低拷贝，37％为多拷贝。
2)从文库中筛选到5个簇毛麦专化多拷贝插入序列pHVMK134、pHVMK137、pHVMK125、pHVMK130和pHVMK67。3个簇毛麦专化单拷贝序列pHVMK22、pHVMK15和pHVMK129。其中pHVMK22可以作为探针，检测小麦遗传背景下的Pm-v抗白粉病基因，6VS特征带的大小为2Kb。
3)pHVMK 22的序列为252bp，GenBank登录号为AF358923，同源性比较结果说明基因库中没有较高同源性的序列或基因，为一新序列。
2、根据抗病基因的保守序列设计引物进行扩增，获得Pm-v抗病基因类似序列，为Pm-v抗白粉病基因克隆提供切入点或直接的探针。
1)利用己克隆抗病基因的保守域合成了7对引物Kina-HD、NLP、Xa21、RLK、S-AS、Pto、Pk。
从6VS端体DNA中扩增出10类抗病基因同源片段HvrgakI-Hvrgak10(GenBank登录号为AF387113-AF387120，AY040671，AY040672)。
2)上述10类抗病基因同源片段与己知抗病基因之间的同源性为5-20％。在Intenet上进行BLASTN分析，序列Hvrgakl与山羊草(Aegilopsv ventricosa)抗病类似基因Partial rae 7 gene及Partial rae 6 gene同源性分别为82％和81％。序列Hvrgak3与Avena strigosa抗病基因部分序列有90％同源性，与水稻NBS-LRR类蛋白NBA2 gene有86％的同源性。
3)利用获得的10类抗病基因相似序列(RGA)为探针，对小麦-簇毛麦易位系、代换系及其双亲的DNA，进行RFLP分析，发现Hvrgak2、Hvrgak9和Hvrgak5可能与Pm-v抗白粉病基因连锁。
实施例4、6DL/6VS易位系Pm97633、Pm97034、Pm97035与6AL/6VS易位系92R179的异同分析6DL/6VS易位系Pm97633、Pm97034、Pm97035与6AL/6VS易位系92R179的异同分析6DL/6VS易位系的簇毛麦来自苏联，为冬性，6AL/6VS易位系的簇毛麦引自英国剑桥，为春性。前者6VS上的抗病基因暂取名为Pm-v，后者已定名为Pm-21。
经检测，来自苏联及剑桥的簇毛麦麦谷蛋白Glu-V1控制形成的HMW-Glutenin亚基不同，前者是2个亚基，后者为1个亚基；6VS染色体臂上的醇溶蛋白Gli-V1控制形成的特征带也不相同，前者有1条特异带，而且在双二倍体、6D/6V代换系、6DL/6VS易位系中均能表达，后者没有，如图9所示；前者特有的RAPD分子标记OPAL03750、OPAD17480和OPAG15600在其衍生系中均能显现，而后者没有此特征带，RAPD标记的结果如表4所示。
利用小麦第六部分同源群短臂上探针psr8、psr106、psr113、psr312、psr627、psr964和长臂上探针psr546、psr371，对EcoRI、HindIII、Dra I和EcoR V等限制酶切供试样品基因组DNA进行Southern杂交，结果表明这些探针均能检测出这两个不同来源簇毛麦及6AL/6VS、6DL/6VS易位系的多态性。用小麦第六部分同源群短臂上探针psr8/EcoR V组合进行RFLP分析，如图10所示，图中，1分子量标样；2中国春；3宛7107；4苏联簇毛麦(S)；5TH3；6苏联簇毛麦6V附加系；76D/6V代换系；8Pm97033；9Pm97034；10Pm97035；1197R179；126A/6V代换系；13剑桥簇毛麦(J)；14扬麦5号。从图中可以看出，苏联的簇毛麦有两条特征带，剑桥簇毛麦仅有一条特征带，而且它们的大小、位置不同。用小麦第六部分同源群长臂上探针psr546/Dra I组合进行RFLP分析，如图11所示，图中，1
表4、Pm与Pm-v基因的RAPD标记品系 基因OPAI01700OPAN031700OPAL03750OPAD17480OPAG1560092-R149 Pm21M+ M+92-R137 Pm21M+ M+Pm941181 Pm21M+ M+Pm930640 Pm-vM+ M+M+ M+ M+RW14 Pm-vM+ M+M+ M+ M+RW15 Pm-vM+ M+M+ M+ M+TH1 Pm-vM+ M+M+ M+ M+TH1W Pm-vM+ M+M+ M+ M+TH2W Pm-vM+ M+M+ M+ M+TH3 Pm-vM+ M+M+ M+ M+TH3W Pm-vM+ M+M+ M+ M+簇毛麦(原苏联)Pm-vM+ M+M+ M+ M+墨75 感病-- ---Wan7107 感病-- ---冀麦30感病-- ---陕7859感病-- ---中国春；2宛7107；3TH3；4苏联簇毛麦6V附加系；56D/6V代换系；6Pm97033；7Pm97034；8Pm97035；9苏联簇毛麦；10剑桥簇毛麦；1197R179；12剑桥簇毛麦6V附加系；136A/6V代换系；14扬麦5号。从图中可以看出，苏联的簇毛麦有两条特征带，剑桥簇毛麦仅有一条特征带，这些特征带均能在附加系、代换系中显现，而在易位系和普通小麦中没有。上述结果说明这两个不同来源的簇毛麦具有遗传多样性。
本发明把这两个易位系杂交，F1对白粉病免疫，F2和F3抗性发生分离。Pm97033/92R179杂种F1、F2和F3抗病株人工接种鉴定的抗病分离结果如表5所示由此表可以看出，F2代抗性比例为R∶S＝21.8∶1，F3杂合抗病株系125个，感病株1366株，抗病株1360株，抗∶感比为1∶1。
表5 Pm97033/92R179杂种F1、F2和F3代抗白粉病性分离世代总株系总株数抗病株感 病纯合抗病杂合抗病株数 ％株系株系感病株/每株系F1180 180 0F2481164 1113 51 4.37 18 30 1.77F3210 4579 3213 1366 29.8 85 125 10.91∶1
6D/6V代换系和6DL/6VS易位系经国内外鉴定，对美国、德国、中国等80多个白粉病菌系均表现免疫和高抗，是已知抗性基因中抗性最强、抗谱最广的。6AL/6VS易位系尚未见到有如此多菌系的鉴定报告。


本发明公开了一种向小麦中导入异属抗白粉病基因的方法，本发明向小麦中导入异属抗白粉病基因的方法，包括以下步骤1)硬粒小麦与簇毛麦远缘杂交，幼胚或幼穗离体培养，再生得到硬粒小麦一簇毛麦异源双二倍体；2)硬粒小麦一簇毛麦双二倍体与普通小麦回交转育后，对杂交种子再生植株的花药进行培养，获得加倍单倍体植株；自交和定向选择，获得具有簇毛麦抗白粉病基因的小麦。本发明方法对促进我国农业的发展具有重要的理论研究和实际应用价值。