专利名称:用ns1糖蛋白对黄病毒进行早期检测的制作方法图1所述的那些电泳或层析技术证实所述NS1蛋白质的六聚体形式,它与所述蛋白质的诸如单体形式或二聚体形式之类其它形式不同。为了本发明的目的,短语“针对黄病毒NS1蛋白质的多克隆和单克隆抗体”意指通过免疫非人哺乳动物获得的抗体,- 其中或用六聚体形式的NS1蛋白质进行免疫,- 或用活的或灭活的黄病毒进行免疫,所述的多克隆抗体因其对六聚体形式NS1蛋白质的亲和力而被选择并经一步纯化,所述单克隆抗体因其对六聚体形式NS1蛋白质的高亲和力而被预选择且随后用常规技术进行纯化,尤其是用离子交换或亲和层析进行纯化。为了本发明的目的,短语“单克隆抗体对六聚体形式NS1蛋白质的亲和力”意指饱和抗体50%位点所需的该蛋白质的浓度;这是按实施例5所述流程用该抗体的亲和常数进行检验的。为了本发明的目的,术语“高亲和力”指常数小于10-8M的亲和力。令人惊奇的是,利用通过在六聚体形式NS1蛋白质上免疫捕捉而选择和纯化的多克隆抗体,或用对六聚体形式NS1蛋白质具高亲和力并被纯化的单克隆抗体,代替超免疫的兔全血清,而检测生物学样品中的NS1蛋白质,有可能显著提高该方法的灵敏度并可能检测感染早期阶段病人血液中循环的NS1蛋白质,包括初级感染和二级感染。本发明的方法具有相当多的优点- 可早期进行在临床阶段抗体应答可检测前,显示NS1糖蛋白的存在,- 是灵敏的可能检测少于1ng蛋白质/ml血清的量,从而使其可能检测初级感染早期的循环NS1蛋白质,- 是快速的可在一天内得到结果,- 相对便宜,因而可用于高风险的国家,- 有可能将最近感染黄病毒的个体与接种了疫苗的个体区分开,因为在接种了疫苗的个体中NS1蛋白质是缺乏的,而其中的抗体仍可能是可检测的。依照所述方法的一有利实施方案,黄病毒感染是登革病毒的感染。依照所述方法的另一有利实施方案,一抗优选附着于合适的固相支持物上,而二抗任选地与合适的标记缀合。
依照所述方法的另一有利实施方案,当二抗未缀合标记时,此时用缀合合适标记的三抗(third antibody)检测二抗与附着于固相支持物上的NS1蛋白质的结合,所说的三抗是常规使用的抗体,例如针对二抗的IgG,尤其是羊、猪或驴产生的IgG。
在所用的标记中,举例说来可提到的有荧光标记、生物素/链霉亲和素系统、非同位素标记或酶,例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
依照所述方法的另一有利实施方案,所述三抗与酶缀合。
依照所述方法的另一有利实施方案,- 一抗,或捕捉抗体,包括在登革病毒NS1蛋白质上进行免疫捕捉选择得到的小鼠多克隆抗体,所说的蛋白质是六聚体形式的,及- 二抗,或检测待分析生物样品中NS1存在的抗体,包括来自登革病毒NS1蛋白免疫的兔的多克隆抗体,所说的蛋白质是六聚体形式的,用三抗显示所说二抗的附着,该三抗包括与过氧化物酶缀合并针对二抗的抗体。
依照所述方法的另一更有利的实施方案,通过在登革病毒血清型1六聚体NS1蛋白质上的免疫捕捉纯化小鼠多克隆抗体。
本发明还有一主题是用于诊断黄病毒感染的试剂盒或盒装置,其特征在于,它包含- 至少一种捕捉抗体和至少一种如上所述的显示抗体,- 至少一种阳性对照,由黄病毒的NS1蛋白质和/或多种黄病毒血清型组成,所述蛋白质是六聚体形式的,和- 至少一种阴性对照,由正常人血清组成。
依照本发明用于诊断的盒装置的有利实施方案,所述六聚体NS1蛋白质获自被感染哺乳动物细胞培养物上清液或以含NS1蛋白基因或该基因片段或黄病毒基因组片段之重组质粒转染的哺乳动物细胞培养物上清液,所述片段能表达所有或部分NS1蛋白质。
依照本发明用于诊断的盒装置的有利实施方案,NS1蛋白质是登革病毒的NS1蛋白。
依照本发明用于诊断的盒装置的有利实施方案,质粒是pCIneo-NS1.FGA质粒,该质粒于1999年6月7日保藏于巴斯德研究院所建立的国家培养物和微生物保藏中心,编号I-2220。
本发明还有一主题是从被感染哺乳动物细胞培养物上清液或以含黄病毒NS1蛋白基因或该基因片段或黄病毒基因组片段之重组质粒转染的哺乳动物细胞培养物上清液中纯化六聚体形式黄病毒NS1蛋白质的方法,所述片段能表达六聚体NS1蛋白质,其特征在于,在用诸如亲和层析之类常规技术纯化NS1蛋白质之前,通过用沉淀剂处理及随后的离心分离NS1蛋白质的可溶形式和微粒形式。
例如,在大于或等于10000g的速度下进行离心。
为了本发明的目的,术语“沉淀剂”指能特异沉淀微粒蛋白质或细胞碎片的物质,例如聚乙二醇,所述试剂在可能分离可溶蛋白质和微粒蛋白质或细胞碎片的常规条件下使用。
在所述纯化方法的优选实施方案中,六聚体NS1蛋白质是登革病毒的NS1蛋白质,尤其是登革病毒血清型1的。
本发明还有一主题是免疫原性组合物,其特征在于,它包含六聚体形式黄病毒NS1蛋白质作为活性成分,以及至少一种药用可接受载体,所述蛋白质任选地结合其它蛋白质。
在本发明免疫原性组合物的优选实施方案中,免疫原性组合物包括至少一种相应于多种登革病毒血清型的六聚体NS1蛋白质混合物。
本发明还有一主题也是免疫原性组合物,其特征在于它包含选自下组的活性组分- 能表达所有或部分登革病毒NS1蛋白的多核苷酸,无论该病毒是何血清型的,- 包含至少一个在其所注入的宿主内能表达的启动子和编码登革病毒(无论该病毒是何血清型的)NS1蛋白的DNA的表达系统,所述DNA表达所说的蛋白质,并且与至少一种药用可接受载体联合。
用核酸进行接种的流程在国际专利申请WO 90/11092中特别进行了描述。
本发明的另一主题是使用六聚体黄病毒NS1蛋白质或表达该蛋白质的系统制备能体内诱导抗体产生的免疫原性组合物的用途。
在所述用途的优选方法中,NS1蛋白质是登革病毒,尤其是登革病毒血清型1的蛋白质。
本发明还有一主题也是利用至少一种对六聚体形式NS1蛋白质具高亲和力的单克隆抗NS1抗体制备能诱发被动免疫的医药产品的用途,所述单克隆抗体是经纯化和修饰的。
对抗体进行的有利修饰特别有Fab片段的选择或抗体的人源化。
本发明还有一主题是利用六聚体形式的NS1蛋白质体外选择特异于所述NS1蛋白质,能早期诊断黄病毒感染的抗体的用途。
在所述用途的优势实施方案中,抗体是多克隆抗体。
在所述用途的另一优势实施方案中,抗体是单克隆抗体。
在所述用途的另一优势实施方案中,蛋白质是登革病毒,尤其是登革病毒血清型1的NS1蛋白质。
通过将来自六聚体形式NS1蛋白质免疫小鼠的脾细胞与合适的骨髓瘤细胞融合而方便地获得抗NS1的单克隆抗体。
本发明还有一主题是表达编码登革病毒NS1蛋白质之多核苷酸的方法,其特征在于它包括序列SEQ ID NO.1所限定的多核苷酸在合适真核细胞中的表达,所述多核苷酸与启动子相联。
本发明的其它特性和优势可见以下描述及图示实施例中,其中- 图1显示分子排阻层析后获得的纯化六聚体胞外NS1蛋白质。A)分子排阻层析后,超滤浓缩蛋白质至0.5mg/ml并用0、0.5、5和50mMdimethyl suberimidate(DMS)处理。获得的产物置于非还原性Laemmli缓冲液中,在4-20%的梯度丙烯酰胺凝胶上分离并用考马斯兰染色。电泳前将50mM DMS处理后的样品在95℃加热3分钟以解离非共价结合的寡聚体。B)用0.5%或1%的正辛基葡糖苷(nOG)在37℃处理纯化的NS蛋白质过夜并任选地用25mM DMS处理1小时。蛋白质无需热变性即可于4-20%的梯度丙烯酰胺凝胶上分离,通过用文献或如上所述单克隆抗NS1抗体进行免疫印迹来检测。
- 图2表示用以下实施例2之克隆4C获得的登革病毒血清型1 NS1蛋白质序列及其相应编码序列。
- 图3说明了用捕捉ELISA的检测方法检验预先被登革病毒感染的病人的循环NS1蛋白质所获得的结果,病人血清取自其急性发作期和恢复期,并且将这些结果与本领域原来的技术IHA(登革病毒血清型1、2、3或4的血细胞凝集抑制)和MAC ELISA(免疫球蛋白M抗体捕捉酶联免疫吸附试验)获得的结果进行比较;D1相应于登革病毒血清型1;p2相应于登革病毒血清型2;D3相应于登革病毒血清型3;D4相应于登革病毒血清型4;ID=病人的身份;1相当于疾病急性期的第一个样品,2相当于恢复期的第二个样品(在第一个样品2-4周后取样);在捕捉ELISA试验中,检验值表示为同一血清稀释10、30或90倍后得到的光密度。
- 图4显示了用捕捉ELISA试验对被来自法国Guiana地区被登革病毒血清型1所感染的病人血清中NS1蛋白质的检测。所显示的数字表示每一种类(用捕捉ELISA法显示阳性或阴性结果的以及对IgM显示阳性或阴性结果的)的病人数目。
- 图5显示了从来自法国Guiana地区被登革病毒1所感染的4个病人中获得的结果,在发病的临床阶段从D1至D5每天取样。每条曲线相应于一个病人每天取样,用改进的捕捉ELISA试验检测NS1蛋白质的结果以及RT-PCR的结果和用MAC-ELISA技术获得的结果。所报道的O.D.值用背景值校正一次。阳性界限用断线显示。
- 图6显示了抗NS1单克隆抗体F22和G18的特性。
- 图7将用单克隆方法进行捕捉ELISA试验检测NS1蛋白质与用实施例3所述多克隆方法进行捕捉ELISA试验检测的结果进行了比较。得到的结果以待分析血清各稀释度(10倍、30倍或90倍)所检测到的光密度值减去阴性对照平均值的形式进行报道。
- 图8说明了用特异于黄发热病毒的捕捉ELISA试验对黄发热病毒感染病人血清中NS1蛋白质的证实。对于各被测血清来说,图中报道了用改进试验检验的光密度值减去阴性对照平均值,在可能的情况下,还报道了用特异于黄发热IgM的MAC-ELISA试验检测的光密度值和病毒分离的结果。
实施例1-登革病毒血清型1 NS1蛋白质的纯化1.材料和方法在适应于A.K.I.Falconar等人所述方法(病毒学方法杂志(J.Virol.Meth),(1990),30,323-332)的条件下,于被登革病毒血清型1 FGA/89株(P.Despres等,病毒学(1993),196,209-219)所感染的Vero细胞产生蛋白质。
感染5天后收获培养物并1500g离心去除细胞碎片。离心后的上清液中调至20mM Tris-HCl、1mM叠氮化钠,并通过冷超滤6次进行浓缩,4℃沉淀2小时去除病毒颗粒,加入终浓度7.5%的聚乙二醇(PEG),然后10000g离心30分钟。含7.5%PEG的澄清后上清液用0.05%吐温20和1mg/ml的抑肽酶处理,然后过附着有抗NS1单克隆抗体的免疫亲和柱。按Falconar等人(上述)所述的二乙胺技术洗脱蛋白质,超滤浓缩,以含1mM叠氮化钠的10mM Tris-HCl缓冲液交换洗脱液。
2.结果结果如图1所述。
图1a显示NS1蛋白质确实是六聚体形式的。六聚体形式所占比例随DMS的浓度增加而增长(图1a)。
在非离子型去垢剂正辛基葡糖苷(nOG)存在下细胞外NS1蛋白质可由六聚体形式转变为二聚体亚单位(图1b)。在存在或缺乏正辛基葡糖苷(nOG)的条件下37℃温育过夜并用25mM DM8处理后,观察到,缺乏nOG时,出现了相应于二聚体、四聚体和六聚体的条带,存在nOG时,六聚体部分或全部解离,这取决于nOG的浓度(图1b)。
实施例2用Vero细胞表达登革病毒血清型1的NS1蛋白质1.材料和方法
pCIneo-NS1.FGA质粒(由巴斯德研究院的培养物和微生物国家保藏中心保存于1999年6月7日,编号I-2220)含NS1蛋白质的基因,其中包括编码其信号肽的基因,前面是翻译起始密码子,后面是翻译终止密码子,此质粒被引入感受态大肠杆菌(来自Stratagene的epicurian SURE)。此质粒在细胞培养物中扩增并按制备质粒DNA的常规技术进行纯化。纯化后的DNA用于测定多个克隆的序列(克隆4C的序列如图2所示)及或用诸如DOTAP(Boehringer Mammheim)之类的阳离子脂质体或与诸如FuGENE(Boehringer Mammheim)之类的非脂质体物质一起转染Vero细胞。FuGENE和DNA在无血清培养基中预温育15分钟,然后将混合物与一层Vero细胞接触24小时。然后用PBS(磷酸缓冲盐水)洗细胞,用含3%多聚甲醛的PBS溶液室温固定20分钟,用含0.5%Triton X-100的PBS浸泡5分钟。然后用特异抗体显示NS1抗原的存在,所述抗体可被荧光素标记的缀合抗体所识别。
2.结果因此在大约20%的转染细胞中可能证实有特异于NS1病毒抗原的强荧光信号。
因而证明了NS1的表达,且可在新霉素存在下建立稳定的细胞系,新霉素是转染细胞的选择标记。
图2显示了由此获得的登革病毒血清型1的NS1蛋白质序列以及相应的编码序列。
实施例3在登革病毒血清型1感染中按本发明执行捕捉-ELISA技术并与本领域现有技术方法相比较1.捕捉-ELISA技术的原理用事先通过免疫捕捉在纯化登革病毒血清型1六聚体NS1蛋白质上而纯化的单特异性小鼠多克隆抗体捕捉NS1病毒抗原。
用来自经纯化六聚体NS1蛋白质所免疫兔的抗体显示NS1的存在,所述抗体自身被缀合辣根过氧化物酶的抗体识别。
2.材料和方法a-针对NS1蛋白质的小鼠多克隆抗体的纯化
a1-NS1蛋白质附着到膜上通过吸附将纯化后的NS1蛋白质附着到两性尼龙膜(Nytran,Schleicher&Schuell)上。然后用含浓度3%牛白蛋白的磷酸缓冲盐溶液(PBS;10mM磷酸;pH7.2;150mM NaCl)饱和膜的表面。PBS洗两次后,用含0.25%戊二醛的PBS室温处理膜15分钟。PBS洗3次后,用含3%牛白蛋白的100mM甘氨酸缓冲液中和膜,PBS洗两次,然后4℃保存于含1mM叠氮化钠的PBS中。
A2-小鼠单一特异性的多克隆抗体(捕捉抗体)的纯化- 多克隆腹水的产生将以登革病毒感染且濒死的年轻瑞士小鼠的脑在9ml PBS缓冲液中研磨。将产物在4℃10000g离心10分钟。
按以下日程表将病毒悬浮液注射入瑞士小鼠中-D0将0.5ml抗原在大腿处皮下注射,-D3将0.4ml抗原和0.1ml完全弗氏佐剂腹膜内注射,-D25将0.5ml抗原腹膜内注射,-D26将0.5mlTG180小鼠腹水腹膜内注射,和-D28将0.5ml抗原腹膜内注射。
在第42天收获腹水。
收集腹水后,在室温1小时形成凝结物,然后1500g至少离心30分钟。上清液留待4℃过夜。用2M乙酸将上清的pH调至4.8,然后在同一条件下再次离心上清。然后加入2N氢氧化钠将上清的pH调至7.0-7.2。上清液可保存于-20℃。
- 特异于登革病毒血清型1的小鼠抗体的纯化在如上所述制备的针对4种登革病毒血清型的多克隆腹水混合物中将膜室温放置1小时。
PBS洗膜3次后,用pH11.4的二乙胺溶液(加了含100mM二乙胺之Iscove改性的Dubelco培养基(Gibco))洗脱附着于NS1蛋白质的抗体。超滤浓缩抗体并回复至含1mM叠氮化钠的PBS缓冲液中。
b- 针对NS1蛋白质的兔多克隆抗体(显示抗体)的制备在第0、7和21天,以及任选地第49天,用30μg按实施例1方法纯化的六聚体NS1蛋白质连续注射3或4次从而免疫兔子,然后在第83天放血。通过与含有文献所述或如上所述制备之单克隆抗体的Sepharose珠保温去除血清中的非特异信号。
C-捕捉-ELISA方法C1-标准曲线对于待测人血清的各捕捉-ELISA平板来说,自按第一点所述方法纯化的NS1蛋白质溶液制备一个校准范围,起始浓度是0.5μg/ml,并以3倍的系列稀释度稀释。
C2-急性期循环NS1蛋白质的检测将按上述方法获得的纯化小鼠多克隆抗体(捕捉抗体)附着至平板上,用PBS溶液稀释,4℃放置过夜。用PBS/0.05%吐温溶液洗3次,5分钟/次,然后用PBS、0.05%吐温和3%牛奶混合物室温饱和平板30分钟。用PBS/0.05%吐温溶液洗3次后,加入稀释或未稀释的待测血清并留待室温反应1小时。用PBS/0.05%吐温溶液制备1/10、1/30和1/90的稀释液。洗3次后,加入特异于NS1的二抗(上述第三点获得的显示抗体,已在PBS/0.05%吐温和3%牛奶的混合物中稀释),37℃保温45分钟。洗3次后,加入针对二抗并用过氧化物酶标记的抗IgG抗体,37℃保温45分钟,所述抗体是在本领域技术熟练人员已知的常规条件下制备的。洗3次后,用TMB(3,3’,5,5’-四甲联苯胺,Kierkegaard&Perry实验室)溶液显色10分钟。用硫酸终止色度反应。
3.结果如图3所示。
本发明的捕捉-ELISA技术使检测疾病急性期的NS1蛋白质存在成为可能,此检测不依赖于病人是初次感染还是二次感染。
结果证实了NS1蛋白质的存在是瞬时的,因为在恢复期的样品中未检测到此蛋白质(图3)。
用MAC ELISA试验证实了93%取自急性期的样品是阴性的,而在此同一试验中,100%取自恢复期的样品是阳性的(图3)。
同样的,血细胞凝集抑制试验(IHA)并未能检测出80%疾病急性期情况中登革病毒血清型1的感染,但此试验证实了在100%取自恢复期的样品中是阳性的(图3)。按照WHO的标准,恢复期血清中IHA水平低于1280可诊断为初级登革热感染,此水平大于1280可诊断为二级登革热感染。因此此研究中阳性血清的一半相应于初级登革热的案例,而另一半相应于二级登革热的案例。这样一来,本发明的捕捉-ELISA技术使检测初级和二级登革热情况中的NS1蛋白质成为可能。
实施例4检测窗的测定1.材料和方法a- 在感染了登革病毒1的法国Guiana地区病人群中进行的研究样品取自感染了登革病毒血清型1的病人,取样时间点在标志临床症状(开始是同样的发热)出现第0天和相应于恢复期结束的第66天之间。
按实施例3所述捕捉-ELISA方法搜寻患者血清中循环NS1的存在,在数据可获得的情况下,将所获结果与用MAC-ELISA检验对特异IgM呈阳性的结果相比较。
b- 感染了登革病毒1的4个病人的日监测在临床期第1-5天每天从4个病人体内取样。对各血液样品进行显示病毒RNA的RT-PCR反应、检测特异于登革病毒之IgM的MAC-ELISA试验及按上述捕捉-ELISA方法对登革热NS1抗原进行搜寻。
2.结果a- 检测窗的测定结果如图4所示。
在第1-6天,被感染病人中检测到循环NS1蛋白质的可能性在64%(第2天)-100%(第5天)之间浮动。第十天后,再也检测不到循环NS1蛋白质,而此时抗体应答变成主要的。
循环NS1蛋白质的检测似乎不依赖于总IgM(特异于病毒抗原)的存在(在某些情况下IgM出现于第3天,从第5天起达到顶点),对于某些病人,循环NS1蛋白质的检测甚至也不依赖于可能出现于第2天的总IgG的存在。另一方面,特异性针对NS1的IgG的存在可能解释临床期血清中为何未检测到NS1抗原。
因此,按本发明用捕捉-ELISA技术进行血清中NS1抗原的检测优选于临床症状出现后第1和第6天之间进行。
b- 感染了登革病毒的4个病人的日监测结果如图5所示。
在4个被研究病人中,不管样品取自相对于症状起始的第几天,持续可检测到NS1蛋白质直至第5天。对于某些病人来说,蛋白质的检测窗较用RT-PCR检测的病毒血症期范围宽。
实施例5在登革病毒血清型1感染中用单克隆工具执行捕捉-ELISA技术并与上述捕捉-ELISA技术相比较1.材料和方法a- 针对登革病毒血清型1NS1蛋白质的小鼠单克隆抗体的产生和特性a1- 针对NS1蛋白质的小鼠单克隆抗体的产生用按实施例1方法纯化的登革病毒血清型1六聚体NS1蛋白质10μg注射7次免疫雌性Balb/C小鼠。第一次注射用完全弗氏佐剂,随后的5次注射用不完全弗氏佐剂,每隔15天皮下注射一次。在杀死动物3天前在腹膜内进行最后一次注射,使用了不完全弗氏佐剂。
按标准流程将来自免疫小鼠脾的细胞与鼠骨髓瘤融合并培养至克隆出现。
A2- 分泌抗NS1抗体的杂交瘤的鉴定用常规ELISA技术或捕捉-ELISA技术检测特异于NS1蛋白质的抗体。
- 常规ELISA技术通过吸附将按实施例1的方法纯化的六聚体NS1蛋白质附着于平板上,以1μg/ml的浓度在PBS中4℃过夜。用PBS/0.1%吐温(PT)溶液洗3次后,将蛋白质与用含0.5%明胶的PT溶液(PTG)稀释2倍的多种杂交瘤上清一起在37℃保温1小时。用PT洗3次后,加入稀释于PTG中的过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体并37℃保温1小时。洗3次后,在邻苯二胺存在下用过氧化氢溶液进行显示。
- 捕捉-ELISA技术用实施例3所述技术(参见,急性期中循环NS1蛋白质的检测),但用样品稀释于PTG溶液中的1/10稀释液替代其中待测的血清稀释液,所述样品是未感染Vero细胞或用登革病毒血清型1感染5天后的Vero细胞的培养物上清,用7%聚乙二醇沉淀(参见,实施例1登革病毒血清型1NS1蛋白质的纯化)。来自多种杂交瘤的上清的相应于来自未感染Vero细胞的培养物上清的反应用作非特异信号的对照。
A3- 用间接的免疫荧光法检测抗NS1单克隆抗体对4种登革病毒血清型之一感染的Vero细胞的反应用4种登革病毒血清型之一感染Vero细胞40小时血清型1菌株FGA/89血清型2菌株NG血清型3菌株H87血清型4菌株H241用PBS溶液洗1次后,用含3%多聚甲醛的PBS溶液于室温固定细胞30分钟。用PBS洗细胞,然后用含0.5%Triton X-100的PBS溶液透化10分钟。再用PBS洗涤后,将细胞与用ELISA呈阳性反应的多种杂交瘤上清一起保温1小时。PBS洗3次后,加入荧光标记的抗小鼠IgG抗体并保温1小时。用PBS洗3次后,用盖玻片覆盖载玻片并在荧光显微镜下观察。
A4- 小鼠单克隆腹水的制备于Balb/C小鼠中产生单克隆腹水。在用分泌单克隆抗体的杂交瘤克隆腹膜内注射一周前用0.5ml姥鲛烷(2,6,10,14-四甲基十五烷,Sigma)腹膜内注射小鼠。腹水形成时即取出,于1500rpm离心20分钟,并保存于-20℃。
A5- 同种型抗NS1单克隆抗体的测定用针对多种小鼠免疫球蛋白亚类IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3的抗体通过ELISA测定同种型抗NS1抗体。按同样的方法学测定免疫球蛋白轻链。
A6- 抗NS1单克隆抗体亲和常数的测定(B Friguet等,免疫学杂志(1985),77,305-319)抗体亲和力相应于饱和50%抗体位点所需抗原的浓度。在液体培养基中,将恒定浓度的抗体和浓度渐减的抗原于4℃保温过夜,以达到反应的平衡。平衡后用ELISA试验测定游离抗体的浓度混合物放置于用抗原预温育的平板上。4℃保温20分钟后(为了避免平衡的改变),用β-半乳糖苷酶偶联的抗小鼠IgG进行ELISA,然后进行酶促反应。然后测定解离常数KD。
A7- 多种抗NS1单克隆抗体的竞争性反应此反应有可能测定具相同表位或不同表位的单克隆抗体的特异性。表位确定能够测定未标记的单克隆抗体和与生物素偶联的第二单克隆抗体与抗原的反应性。
将未标记的第一单克隆抗体以饱和浓度(预先用ELISA测定)放于已预先附着有抗原的平板上,37℃保温2小时。在PT溶液中4℃洗4次后,加入偶联生物素的第二单克隆抗体并于4℃保温20分钟。用PT溶液在4℃洗4次后,加入过氧化物酶标记的链霉亲和素缀合物溶液并于37℃保温1小时。用PT溶液洗4次后,邻苯二胺存在下用过氧化氢溶液对复合物进行显示。如果在分光光度计上读取后得到信号,这就说明两种抗体识别的表位是不同的。若情况相反,则两种单克隆抗体针对的是抗原的同一表位。
b- 单克隆抗体G18和F22的纯化用实施例3所述的免疫亲和法纯化抗体G18和F22。
c- 利用单克隆抗体经捕捉-ELISA试验检测循环NS1蛋白质在给定的稀释度将纯化的单克隆抗体G18和F22混合于PBS溶液中并4℃保温过夜。此ELISA的随后步骤与前述实施例相同。
d- 用单克隆方法进行的捕捉-ELISA试验与用多克隆方法进行的此试验的比较在同一天以用单克隆方法进行的捕捉-ELISA试验与用多克隆方法进行的此试验检测来自法国Guiana地区的血清系列。血清于多种稀释度检测1/10、1/30和1/90。
2.结果a- 单克隆抗体的特性结果如图6所示。
检测抗体G18和F22以高亲和力结合NS1蛋白质不同表位的能力。抗体F22特异于登革病毒血清型1,而G18特异于登革病毒血清型1和3。
b- 将单克隆抗体用于NS1抗原的捕捉结果如图7所示。
所选的单克隆抗体不仅重现了用多克隆抗体所获得的结果,它们还呈现了比多克隆抗体更显著的反应性。因此开发的单克隆方法显得尤其适用于必须使用它的诊断用途。
实施例6另一登革病毒血清型或其它黄病毒感染中执行本发明捕捉-ELISA技术1.材料和方法a- 培养物上清的制备用登革病毒2或日本脑炎病毒或黄发热病毒感染Vero细胞。然后按实施例1所述方法制备培养物上清。
b- 纯化针对黄发热病毒NS1蛋白质和日本脑炎病毒NS1蛋白质的单克隆抗体在蛋白A琼脂糖CL-4B珠(Pharmacia Biotech)上纯化针对黄发热病毒NS1蛋白质的抗体8G4、1A5和2D10的单克隆腹水(J.J.Schlesinger等,病毒学,(1983),125,8-17)和针对日本脑炎病毒NS1蛋白质的抗体171-2-2和70-14-20的单克隆腹水。将这些单克隆腹水在蛋白A磁珠上4℃放置过夜。用PBS/0.05%吐温将磁珠洗3次后,用pH3的甘氨酸缓冲液洗脱附着于蛋白A磁珠上的抗体。然后超滤浓缩并还原于含1mM叠氮化钠的PBS缓冲液中。
c- 登革病毒2培养物上清中NS1蛋白质的检测c1- 所用的抗体用单克隆抗体3D1.4和1A12的腹水混合物进行捕捉步骤(A.K.I.Falconar等,Arch.Virology,(1994),137,315-326)。然后用两种兔抗体的混合物识别蛋白质用实施例3中所述纯化蛋白质免疫后获得的血清以及用4种登革热血清型病毒免疫后获得的兔血清。
C2- 捕捉-ELISA方法所用技术与实施例3所述相同。
d- 在日本脑炎病毒培养物上清中NS1蛋白质的检测d1- 所用的抗体纯化的单克隆抗体171-2-2和70-14-20用于捕捉步骤中。然后用已预先以日本脑炎病毒NS1蛋白质重组蛋白免疫的两种兔血清混合物识别该蛋白质。
d2- 捕捉-ELISA方法所用技术与实施例3所述相同。
e- 黄发热病毒培养物上清中以及用此病毒感染的病人血清中NS1蛋白质的检测e1- 所用的抗体在给定的稀释度将纯化的单克隆抗体8G4、1A5和2D10混合于PBS溶液中并用作捕捉抗体。所用的特异于黄发热病毒NS1的二抗来源于事先免疫黄发热17D病毒NS1蛋白质的兔血清(J.J.Schlesinger等,免疫学杂志(1985),135,2805-2809)。
e2- 捕捉-ELISA方法所用技术与实施例3所述相同。
2.结果有关NS1蛋白质的分泌过去已在多种黄病毒感染的体外细胞培养物中有报导,如DEN2病毒(Winkler等,病毒学(1988),162,187-196,Pryor等,病毒学(1993)194,769-780)、由蜱所携带或传播的脑炎病毒(Lee等,普通病毒学杂志(1989),70,335-343,Crooks等,J.Chrom.(1990),502,59-68,Crooks等,普通病毒学杂志(1994),75,3453-3460)、日本脑炎病毒(Mason,病毒学(1989),169,354364,Fan等,病毒学(1990),177,470-476)、默里峡谷脑炎病毒(Murray valley encephalitis virus)(Hall等,病毒学方法杂志(1991),32,11-20)和黄发热病毒(Post等,病毒研究(Vir.Res.)(1990),18,291-302)。由于这些结果是用不同的ELISA技术获得的,我们用本发明的捕捉-ELISA技术证实被感染哺乳动物细胞上清中的该蛋白质。
NS1蛋白质在用DEN2病毒、日本脑炎病毒或黄发热病毒感染的Vero细胞培养物上清中是可检测的。
用此技术还可能证实用黄发热病毒感染的病人血清中的该蛋白质,如图8给出的结果所示。在Ch.Mathiot(Dakar的巴斯德研究院)所提供的18个血清中,7个是NS1抗原血症阳性的,而对于DEN1病毒来说,循环NS1蛋白质的检测显示出与特异于黄发热病毒的IgM的存在与否无关。
按照本发明进行的捕捉-ELISA试验有可能检测用各种黄病毒感染的细胞培养物上清中以及用黄发热病毒感染的病人血清中的NS1蛋白质。因此,它可能具有检测除DEN1病毒之外其它黄病毒感染的诊断用途。
序列表<110> INSTITUT PASTEURFLAMAND MarieMEGRET FrancoiseALCON SophieTALARMIN AntoineDESPRES PhilippeDEUBEL Vincent<120>黄病毒感染早期检测方法<130>S228FR78B<140><141><150>FR9907290<151>1999-06-09<160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1137<212>ADN<213>登革病毒1型NS1蛋白<400>1atgaggagcg cgtcgctttc gatgacgtgc attgcagttg gcatggttac actgtaccta 60ggagtcatgg ttcaagcgga ctcgggatgt gtaatcaact ggaagggcag agaactcaaa 120tgtggaagtg gcatttttgt cactaatgaa gtccacactt ggacagagca atacaaattc 180caggctgact ccccaaaaag actgtcagca gccattggga aggcatggga ggagggcgtg 240tgtggaattc gatcagccac gcgtcttgag aacatcatgt ggaagcaaat atcaaatgaa 300ttgaaccaca ttctacttga aaatgacatg aaattcacag tggttgtagg agatgctaat 360ggaattttgg cccaggggaa aaaaatgatc aggccacaac ccatggaaca caaatactca 420tggaaaagct ggggaaaagc caagatcata ggagcagaca cacagaatac caccttcatc 480atcgacggcc cagacactcc agaatgcccc gatgaccaaa gagcgtggaa catttgggaa 540gttgaggact atgggtttgg aattttcacg acaaacatat ggctgaaatt gcgtgactcc 600tacacccaaa tgtgtgacca ccggctaatg tcagctgccg tcaaggacag caaggcagtc 660catgctgaca tggggtactg gatagaaagt gaaaagaacg agacctggaa gctagcgaga 720gcctccttca tagaagtcaa gacatgcatt tggccgaaat cccacactct atggagtaat 780ggagttttgg aaagtgaaat gataatccca aagatatatg gaggaccaat atctcagcac 840aattacagac cagggtattt cacacaaaca gcagggccat ggcacctagg taagttggaa 900ttggattttg acttgtgtga aggcaccaca gttgttgtgg atgaacattg tggaaatcga 960ggtccatctc tcagaactac aacagtcaca ggaaagataa tccatgaatg gtgttgcaga 1020tcctgcacgt tacccccctt acgcttcaga ggagaagacg gatgttggta tggcatggaa 1080atcagaccag ttaaggagaa ggaggagaac ctagttaggt caatggtctc tgcataa1137<210>2<211>378<212>PRT<213>登革病毒1型NS1蛋白<400>2Met Arg Ser Ala Ser Leu Ser Met Thr Cys Ile Ala Val Gly Met Val1 5 10 15Thr Leu Tyr Leu Gly Val Met Val Gln Ala Asp Ser Gly Cys Val Ile20 25 30Asn Trp Lys Gly Arg Glu Leu Lys Cys Gly Ser Gly Ile Phe Val Thr35 40 45Asn Glu Val His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr Lys Phe Gln Ala Asp Ser50 55 60Pro Lys Arg Leu Ser Ala Ala Ile Gly Lys Ala Trp Glu Glu Gly Val65 70 75 80Cys Gly Ile Arg Ser Ala Thr Arg Leu Glu Asn Ile Met Trp Lys Gln85 90 95Ile Ser Asn Glu Leu Asn His Ile Leu Leu Glu Asn Asp Met Lys Phe100 105 110Thr Val Val Val Gly Asp Ala Asn Gly Ile Leu Ala Gln Gly Lys Lys115 120 125Met Ile Arg Pro Gln Pro Met Glu His Lys Tyr Ser Trp Lys Ser Trp130 135 140Gly Lys Ala Lys Ile Ile Gly Ala Asp Thr Gln Asn Thr Thr Phe Ile145 150 155 160Ile Asp Gly Pro Asp Thr Pro Glu Cys Pro Asp Asp Gln Arg Ala Trp165 170 175Asn Ile Trp Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe Gly Ile Phe Thr Thr Asn180 185 190Ile Trp Leu Lys Leu Arg Asp Ser Tyr Thr Gln Met Cys Asp His Arg195 200 205Leu Met Ser Ala Ala Val Lys Asp Ser Lys Ala Val His Ala Asp Met210 215 220Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Glu Lys Asn Glu Thr Trp Lys Leu Ala Arg225 230 235 240Ala Ser Phe Ile Glu Val Lys Thr Cys Ile Trp Pro Lys Ser His Thr245 250 255Leu Trp Ser Asn Gly Val Leu Glu Ser Glu Met Ile Ile Pro Lys Ile260 265 270Tyr Gly Gly Pro Ile Ser Gln His Asn Tyr Arg Pro Gly Tyr Phe Thr275 280 285Gln Thr Ala Gly Pro Trp His Leu Gly Lys Leu Glu Leu Asp Phe Asp290 295 300Leu Cys Glu Gly Thr Thr Val Val Val Asp Glu His Cys Gly Asn Arg305 310 315 320Gly Pro Ser Leu Arg Thr Thr Thr Val Thr Gly Lys Ile Ile His Glu325 330 335Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro Leu Arg Phe Arg Gly Glu340 345 350Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg Pro Val Lys Glu Lys Glu355 360 365Glu Asn Leu Val Arg Ser Met Val Ser Ala370 37
本发明涉及了黄病毒所诱发感染的早期检测方法,包括在感染的临床阶段对生物学样品中黄病毒的非结构糖蛋白NS1的检测,所用的免疫学方法至少使用了两种相同或不同的抗体,第一种抗体由经预选择对所说六聚体NS1蛋白质具高亲和力的多克隆或单克隆抗体组成。
用ns1糖蛋白对黄病毒进行早期检测制作方法
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