专利名称：痢疾志贺氏菌的n-乙酰神经氨酸醛缩酶及编码基因与应用的制作方法唾液酸(Sialic acid)是一类神经氨酸的衍生物，目前已经发现的天然的唾液酸衍生物达40多种。其中最主要的是N-乙酰神经氨酸(N-acetyl-D-neuraminicacid, Neu5Ac)。Neu5Ac通常位于细胞表面糖蛋白和糖脂的糖链非还原末端,在许多与糖和蛋白相互作用有关的生理过程中起着很重要的作用如细胞的粘附、信号传递、糖蛋白的稳定性、细菌致病性、病毒侵染、炎症和肿瘤的转移等。N-乙酰神经氨酸的生物学功能多样化，在治疗流感、神经性疾病、炎症和肿瘤等方面具有重要的医药价值，特别是在流感(包括禽流感H5N1和2009年的H1N1)的预防和治疗方面有良好的效果。同时，N-乙酰神经氨酸可促进神经突触的发育，对婴幼儿脑部发育非常重要，因此也被用于婴幼儿奶粉添加剂。无论是药用前景还是作为食品添加剂，N-乙酰神经氨酸都具有较高的市场价值。N-乙酰神经氨酸可从以下几种途径获得天然产物提取、化学合成、化学酶法、酶法合成等。N-乙酰神经氨酸可从燕窝、牛奶或者禽蛋中提取，但由于量太少，提取纯化难，产量低(10-20%)，纯度低。化学合成法合成N-乙酰神经氨酸，由于产物结构的复杂性，需要繁多的保护和去保护步骤。使用化学法合成N-乙酰神经氨酸反应条件苛刻，需要铟等一些贵重金属作为催化剂，N-乙酰神经氨酸得率低。因此，化学法常常和酶法结合使用。N-乙酰神经氨酸可通过酶法合成，N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)和丙酮酸在N-乙酸神经氨酸醒缩酶(Neu5Ac aldolase or Neu5Ac lyase, NanA, EC4.1. 3· 3)作用下生成N-乙酰神经氨酸。但ManNAc对于工业生产而言成本较高。化学酶法是一种更经济有效的生产N-乙酰神经氨酸的方法，即在碱性条件下，使N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)异构化生成ManNAc ;然后米用N-乙酰神经氨酸醒缩酶催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神经氨酸。或用双酶法合成即用GlcNAc 2-异构酶(GlcNAc2_epimerase, AGE, EC5.1. 3. 8)催化GlcNAc异构成ManNAc，然后ManNAc和丙酮酸在N-乙酰神经氨酸醛缩酶的作用下缩合产生 Neu5Ac。在工业生产中多以GlcNAc为原料生产Neu5Ac，不论是采用化学酶法还是双酶法，都需要N-乙酰神经氨酸醛缩酶。虽然N-乙酰神经氨酸醛缩酶在高等动物及一些微生物中有存在，但是生物体中其含量极微，难以分离得到足够量的N-乙酰神经氨酸醛缩酶。因此如何获得性质优良的N-乙酰神经氨酸醛缩酶对N-乙酰神经氨酸的生产非常重要。
本发明的一个目的是提供一种N-乙酰神经氨酸醛缩酶。本发明所提供的N-乙酰神经氨酸醛缩酶，名称为SdNanA，来源于痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae),是如下 a)或 b)的蛋白质a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由a)衍生的蛋白质。其中，序列表中序列2由297个氨基酸残基组成。为了使上述(a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表I所示的标签。表I标签的序列本发明公开了N-乙酰神经氨酸醛缩酶及其编码基因与应用。本发明所提供的N-乙酰神经氨酸醛缩酶是如下a)或b)的蛋白质a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性的由a)衍生的蛋白质。本发明获得了一个编码N-乙酰神经氨酸醛缩酶的新基因SdNanA。将SdNanA基因克隆到原核表达载体6HisT-pRSET质粒上，在大肠杆菌中进行N-乙酰神经氨酸醛缩酶蛋白(SdNanA)的高效表达。本发明所获得的重组N-乙酰神经氨酸醛缩酶蛋白可以催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神经氨酸，具有较高的酶活性，具有较高的应用前景及开发价值。