专利名称：猪饲料添加剂的制作方法图1酵母细胞的激活和驯化。1酵母细胞培养物；2容器；3电磁场源；4电极。5.具体实施方案本发明涉及生物组合物，其能改善动物的免疫功能，和/或降低传染病发生率。本发明提供了生产所述生物组合物的方法以及所述生物组合物作为动物饲料添加剂的应用方法。本发明的生物组合物包含酵母。与作为饲料成分的酵母传统应用不同，本发明的酵母细胞不是动物营养素的主要来源。本发明的酵母细胞作为补充物代替或减少目前常规加入牲畜饲料中的抗生素。所述酵母细胞当由动物口服或与饲料一起被摄取时是活的。在动物胃肠道中，所述酵母细胞能刺激动物免疫系统并改善免疫功能，从而降低传染病发生率。应用本发明的生物组合物可以降低商业动物运作中保持动物健康的总成本，及使在饲料中最少应用抗生素或不用抗生素切实可行。尽管以下术语具有本领域中充分阐明的含义，以下仍阐述了所述术语在本文中的含义以便于解释本发明。本文所用术语“饲料”，广义上是指任何种类的液体或固体物质，其用于营养动物或维持动物正常生长或加速其生长，包括新生动物及幼小的发育中动物。优选地，所述饲料是猪饲料。本文所用术语“动物”是指未成年猪(pig)，猪(swine)或成年猪(hog)，并包括圈养猪的所有品种。本文所有术语“免疫功能”广泛涵盖了动物的特异性和非特异性免疫反应，包括体液和细胞介导的防御机制。动物的免疫功能能使动物免于病原体感染和/或从感染中康复，所述病原体如细菌，病毒，真菌，原生动物，蠕虫及其它寄生虫。动物的免疫功能还可以预防感染，特别是在动物初次暴露于病原体之后由相同病原体所致的未来感染。许多类型的免疫细胞参与提供免疫功能，包括淋巴细胞的各种亚型(B细胞，T细胞，K细胞，NK细胞)，不同类型的白细胞(巨噬细胞，中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞)，抗原呈递细胞(树状细胞，内皮细胞)及在具有免疫活性的特定器官和组织中发现的细胞(骨髓，淋巴结，胸腺，粘液囊，淋巴集结)。反刍动物免疫系统的详细阐述见于John E.Butler所著的反刍动物免疫系统，1981，Perseus Books，在此以其全文并入参考。
在一个实施方案中，本发明提供了生物组合物，其包含至少一种酵母细胞成分。每种酵母细胞成分包含一群活酵母细胞，其已经在特定条件下培养，由此所述酵母细胞能改善动物免疫功能。在优选实施方案中，本发明生物组合物包含多达4种酵母细胞成分。
根据本发明，在某些特定培养条件下，可使酵母代谢性激活，从而有效刺激及增强摄取该酵母的动物的免疫功能。不希望被任何理论或机制束缚，本发明人认为所述培养条件激活和/或增强酵母细胞中一个基因或一系列基因表达，由此所述酵母细胞变得能强力刺激动物免疫系统。预想某些酵母基因产物和动物免疫系统因子之间的相互作用由于所述酵母细胞在下述条件下培养后这些酵母基因产物水平提高而明显增强。据信这些相互作用涉及胃肠道内和淋巴结内排列的免疫细胞以及循环免疫细胞。这些相互作用的结果是动物的免疫功能改善，如对感染的应答及从感染中康复，及对疾病的抗性得以改善。保护所述动物免于许多类型的传染病，包括寄生虫疾病，例如但非限于由细菌，病毒，真菌，原生动物，蠕虫等所致那些疾病。应用所述生物组合物的益处通过得自动物的实验结果证实，示出对传染病抗性或从中迅速康复。
在一个实施方案中，本发明的生物组合物可以直接由动物摄取。在另一个实施方案中，所述生物组合物可以加入饲料中。如相关领域技术人员所已知的，可以使用许多方法和器具将本发明生物组合物与饲料混合。在一个特别的实施方案中，本发明酵母培养肉汤的混合物在喂食动物之前直接加入饲料中。也可以将酵母的干燥粉末在喂食动物之前直接加入饲料中。在本发明另一个实施方案中，将所述酵母细胞与饲料的生料混合，这样自然掺入所述酵母细胞。所述生物组合物可以通过任何自动机械化方式施加于饲料中和/或与饲料混合。
所用生物组合物的量部分取决于饲养方案，并可以根据经验确定。例如，生物组合物与动物饲料的比率范围在0.1％-1％干重，优选0.3％-0.8％，更优选大约0.5％。尽管非必需，本发明生物组合物还可以与其它类型补剂联合或轮流使用，这些补剂例如但非限于维生素，矿物质和疫苗。
以下5.1和5.2章节是本发明4种酵母细胞成分及其制备方法。5.3章节阐述了包含4种酵母细胞成分中至少一种成分的本发明生物组合物的生产。
5.1酵母细胞培养物的制备本发明提供了酵母细胞，其能改善摄取该酵母细胞的动物的免疫功能。可以组合多达4种不同的酵母细胞成分生产所述生物组合物。
所述生物组合物的一种酵母细胞成分通过在一个交变电磁场或一系列多个交变电磁场(multiple alternating electromagnetic fields inseries)下，在适当培养基中将大量酵母细胞培养一段时间而产生。所述培养程序使酵母孢子萌生，酵母细胞生长及分化，并可以进行分批培养或连续培养程序。本文所用术语“交变电磁场”或“电磁场”或“EM场”是同义的。本发明所用电磁场可以通过本领域熟知的各种方法产生。设备示意图如图1所示。所需频率和所需场强的电磁场由电磁波源(3)产生，其包含能产生电磁波的一或多个信号发生器，优选正弦波，优选频率范围为1500MHZ-15000MHz。本领域熟知这种信号发生器。也可以使用能产生较窄频率范围信号的信号发生器。如果需要，还可以使用信号放大器以增大信号输出，及因此增强EM场强。
可以通过各种方式将电磁场应用于所述培养中，包括将酵母细胞置于连接电磁波源的信号发射器邻近。在一个实施方案中，电磁场通过淹没于酵母细胞培养物中的电极形式的信号发射器(1)产生。在一个优选实施方案中，一个电极是金属板，其置于无导电性的容器(2)的底部，另一个电极包含多个导线或导管，它们配置在所述容器内部，由此电磁场的能量可以均匀分布于培养物中。对于垂直的培养器，导线或导管的顶端置于距容器底部3-30cm内(即从底部起大约2-10％容器高)。所用电极导线数根据培养物体积和导线直径而定。例如，培养物体积为10升或更少时，可以使用直径在0.5-2.0mm之间的两或三条电极导线。培养物体积为10-100升时，电极导线或导管的直径可以为3.0-5.0mm。培养物体积为100-1000升时，电极导线或导管的直径可以为6.0-15.0mm。培养物体积为1000升以上时，电极导线或导管的直径可以为20.0-25.0mm。
在本发明的各种实施方案中，可以使用Saccharomyces，Candida，Crebrothecium，Geotrichum，Hansenula，Kloeckera，Lipomyces，Pichia，Rhodosporidium，Rhodotorula Torulopsis，Trichosporon，和Wickerhamia属酵母。
酵母菌株的非限制性实例包括Saccharomyces cerevisae Hansen，ACCC2034，ACCC2035，ACCC2036，ACCC2037，ACCC2038，ACCC2039，ACCC2040，ACCC2041，ACCC2042，AS2.1，AS2.4，AS2.11，AS2.14，AS2.16，AS2.56，AS2.69，AS2.70，AS2.93，AS2.98，AS2.101，AS2.109，AS2.110，AS2.112，AS2.139，AS2.173，AS2.174，AS2.182，AS2.196，AS2.242，AS2.336，AS2.346，AS2.369，AS2.374，AS2.375，AS2.379，AS2.380，AS2.382，AS2.390，AS2.393，AS2.395，AS2.396，AS2.397，AS2.398，AS2.399，AS2.400，AS2.406，AS2.408，AS2.409，AS2.413，AS2.414，AS2.415，AS2.416，AS2.422，AS2.423，AS2.430，AS2.431，AS2.432，AS2.451，AS2.452，AS2.453，AS2.458，AS2.460，AS2.463，AS2.467，AS2.486，AS2.501，AS2.502，AS2.503，AS2.504，AS2.516，AS2.535，AS2.536，AS2.558，AS2.560，AS2.561，AS2.562，AS2.576，AS2.593，AS2.594，AS2.614，AS2.620，AS2.628，AS2.631，AS2.666，AS2.982，AS2.1190，AS2.1364，AS2.1396，IFFI 1001，IFFI 1002，IFFI 1005，IFFI 1006，IFFI 1008，IFFI 1009，IFFI 1010，IFFI 1012，IFFI1021，IFFI 1027，IFFI 1037，IFFI 1042，IFFI 1043，IFFI 1045，IFFI 1048，IFFI 1049，IFFI 1050，IFFI 1052，IFFI 1059，IFFI 1060，IFFI 1063，IFFI1202，IFFI 1203，IFFI 1206，IFFI 1209，IFFI 1210，IFFI 1211，IFFI 1212，IFFI 1213，IFFI 1215，IFFI 1220，IFFI 1221，IFFI 1224，IFFI 1247，IFFI1248，IFFI 1251，IFFI 1270，IFFI 1277，IFFI 1287，IFFI 1289，IFFI 1290，IFFI 1291，IFFI 1292，IFFI 1293，IFFI 1297，IFFI 1300，IFFI 1301，IFFI1302，IFFI 1307，IFFI 1308，IFFI 1309，IFFI 1310，IFFI 1311，IFFI 1331，IFFI 1335，IFFI 1336，IFFI 1337，IFFI 1338，IFFI 1339，IFFI 1340，IFFI1345，IFFI 1348，IFFI 1396，IFFI 1397，IFFI 1399，IFFI 1411，IFFI 1413；Saccharomyces cerevisiae Hansen Var. ellipsoideus(Hansen)Dekker，ACCC2043，AS2.2，AS2.3，AS2.8，AS2.53，AS2.163，AS2.168，AS2.483，AS2.541，AS2.559，AS2.606，AS2.607，AS2.611，AS2.612；Saccharomyces chevalieri Guillermond，AS2.131，AS2.213；Saccharomyces delbrueckii，AS2.285；Saccharomyces delbrueckii Lindnervar. mongolicus Lodder et van Rij，AS2.209，AS2.1157；Saccharomycesexiguous Hansen，AS2.349，AS2.1158；Saccharomyces fermentati(Saito)Lodder et van Rij，AS2.286，AS2.343；Saccharomyces logos van laer etDenamur ex Jorgensen，AS2.156，AS2.327，AS2.335；Saccharomycesmellis Lodder et Kreger Van Rij，AS2.195；Saccharomycesmicroellipsoides Osterwalder，AS2.699；Saccharomyces oviformisOsterwalder，AS2.100；Saccharomyces rosei(Guilliermond)Lodder etkreger van Rij，AS2.287；Saccharomyces rouxii Boutroux，AS2.178，AS2.180，AS2.370，AS2.371；Saccharomyces sake Yabe，ACCC2045；Candida arborea，AS2.566；Candida Krusei(Castellani)Berkhout，AS2.1045；Candida lambica(Lindner et Genoud)van. Uden et Buckley，AS2.1182；Candida lipolytica(Harrison)Diddens et Lodder，AS2.1207，AS2.1216，AS2.1220，AS2.1379，AS2.1398，AS2.1399，AS2.1400；Candida parapsilosis (Ashford) Langeron et Talice，AS2.590；Candidaparapsilosis(Ashford)et Talice Var. intermedia Van Rij et Verona，AS2.491；Candida pulcherriman(Lindner)Windisch，AS2.492；Candidarugousa(Anderson)Diddens et Loddeer，AS2.511，AS2.1367，AS2.1369，AS2.1372，AS2.1373，AS2.1377，AS2.1378，AS2.1384；Candida tropicalis(Castellani)Berkout，ACCC2004，ACCC2005，ACCC2006，AS2.164，AS2.402，AS2.564，AS2.565，AS2.567，AS2.568，AS2.617，AS2.1387；Candida utilis Henneberg Lodder et Kreger Van Rij，AS2.120，AS2.281，AS2.1180；Crebrothecium ashbyii(Guillermond)Routein，AS2.481，AS2.482，AS2.1197；Geotrichum candidum Link，ACCC2016，AS2.361，AS2.498，AS2.616，AS2.1035，AS2.1062，AS2.1080，AS2.1132，AS2.1175，AS2.1183；Hansenula anomala(Hansen)H et P sydow，ACCC2018，AS2.294，AS2.295，AS2.296，AS2.297，AS2.298，AS2.299，AS2.300，AS2.302，AS2.338，AS2.339，AS2.340，AS2.341，AS2.470，AS2.592，AS2.641，AS2.642，AS2.635，AS2.782，AS2.794；Hansenula arabitolgensFang，AS2.887；Hansenula jadinii Wickerham，ACCC2019；Hansenulasaturnus(Klocker)H et P sydow，ACCC2020；Hansenula schneggii(Weber)Dekker，AS2.304；Hansenula subpelliculosa Bedford，AS2.738，AS2.740，AS2.760，AS2.761，AS2.770，AS2.783，AS2.790，AS2.798，AS2.866；Kloeckera apiculata(Reess emend. Klocker)Janke，ACCC2021，ACCC2022，ACCC2023，AS2.197，AS2.496，AS2.711，AS2.714；Lipomyces starkeyi Lodder et van Rij，ACCC2024，AS2.1390；Pichiafarinosa(Lindner)Hansen，ACCC2025，ACCC2026，AS2.86，AS2.87，AS2.705，AS2.803；Pichia membranaefaciens Hansen，ACCC2027，AS2.89，AS2.661，AS2.1039；Rhodosporidium toruloides Banno，ACCC2028；Rhodotorula glutinis(Fresenius)Harrison，ACCC2029，AS2.280，ACCC2030，AS2.102，AS2.107，AS2.278，AS2.499，AS2.694，AS2.703，AS2.704，AS2.1146；Rhodotorula minuta(Saito)Harrison，AS2.277；Rhodotorula rubar(Demme)Lodder，ACCC2031，AS2.21，AS2.22，AS2.103，AS2.105，AS2.108，AS2.140，AS2.166，AS2.167，AS2.272，AS2.279，AS2.282；Saccharomyces carlsbergensis Hansen，AS2.113，ACCC2032，ACCC2033，AS2.312，AS2.116，AS2.118，AS2.121，AS2.132，AS2.162，AS2.189，AS2.200，AS2.216，AS2.265，AS2.377，AS2.417，AS2.420，AS2.440，AS2.441，AS2.443，AS2.444，AS2.459，AS2.595，AS2.605，AS2.638，AS2.742，AS2.745，AS2.748，AS2.1042；Saccharomycas uvarum Beijer，IFFI 1023，IFFI 1032，IFFI 1036，IFFI1044，IFFI 1072，IFFI 1205，IFFI 1207；Saccharomyces willianusSaccardo，AS2.5，AS2.7，AS2.119，AS2.152，AS2.293，AS2.381，AS2.392，AS2.434，AS2.614，AS2.1189；Saccharomyces sp.，AS2.311；Saccharomyces ludwigii Hansen，ACCC2044，AS2.243，AS2.508；Saccharomyces sinenses Yue，AS2.1395；SchizoSaccharomycesoctosporus Beijerinck，ACCC 2046，AS2.1148；SchizoSaccharomycespombe Linder，ACCC2047，ACCC2048，AS2.248，AS2.249，AS2.255，AS2.257，AS2.259，AS2.260，AS2.274，AS2.994，AS2.1043，AS2.1149，AS2.1178，IFFI 1056；Sporobolomyces roseus Kluyver et van Niel，ACCC2049，ACCC 2050，AS2.619，AS2.962，AS2.1036，ACCC2051，AS2.261，AS2.262；Torulopsis candida(Saito)Lodder，ACCC2052，AS2.270；Torulopsis famta(Harrison)Lodder et van Rij，ACCC2053，AS2.685；Torulopsis globosa(Olson et Hammer)Lodder et van Rij，ACCC2054，AS2.202；Torulopsis inconspicua Lodder et van Rij，AS2.75；Trichosporonbehrendii Lodder et Kreger van Rij，ACCC2055，AS2.1193；Trichosporoncapitatum Diddens et Lodder，ACCC2056，AS2.1385；Trichosporoncutaneum(de Beurm et al.)Ota，ACCC2057，AS2.25，AS2.570，AS2.571，AS2.1374；Wickerhamia fluoresens(Soneda)Soneda，ACCC2058，AS2.1388。通常优选糖酵母属(Saccharomyces)酵母。在Saccharomycescerevisiae酵母株中，优选Saccharomyces cerevisiae Hansen。
通常地，本发明所用酵母菌株可以得自私立或公立实验室培养物，或可公开获得的培养物保藏物，如美国典型培养物保藏中心，10801弗吉尼亚州马纳萨斯大学道，VA 20110-2209，和中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，，中国科学院微生物所，中国北京海淀区2714信箱，邮编100080。
尽管是优选的，本发明酵母细胞成分的制备不限于用纯化的酵母菌株起始。每种酵母细胞成分可以通过培养不同菌种或菌株的酵母细胞混合物而产生。酵母细胞成分的组成可以通过本领域熟知的标准酵母鉴别方法确定。
在本发明的不同实施方案中，使用处理、转移及保存酵母的标准方法。尽管非必需，但当进行本发明生产过程时，需要无菌条件或清洁环境。也可以使用处理动物血液和免疫细胞及研究动物免疫功能的标准方法。这种方法的详细阐述见实验室方法进展普通血液学2000，Assendelft等编辑，Arnold，Edward(出版人)；脊椎动物免疫学手册1998，Pastoret等编辑，学术出版社，及免疫学通用方法1991，Coligan等编辑，John Wiley & Sons公司，在此均以其全文并入参考。
在一个实施方案中，将第一种酵母细胞成分的酵母细胞在存在至少一个可变电磁(EM)场的情况下培养，频率范围为7715MHz-7728MHz。可以施加一个单一EM场或一系列EM场，每个电磁场具有在一定范围内的不同频率，或一定范围内的不同场强，或一定范围内的不同频率和场强。尽管可以使用任何实用数量的EM场，但优选将酵母培养物暴露于一系列的2，3，4，5，6，7，8，9或10种不同EM场中。可以通过本领域已知方式施加的EM场的各自频率可以为7715，7716，7717，7718，7719，7720，7721，7722，7723，7724，7725，7726，7727或7728MHz。
EM场的场强在3.5-230mV/cm内。在一个优选实施方案中，系列中开始的EM场比后来的EM场的场强低，由此酵母细胞培养物暴露于场强逐渐提高的EM场中。因此，可以将酵母细胞在较低场强(例如50-85mV/cm)培养10-64小时，然后在较高EM场强(例如85-230mV/cm)再培养10-64小时。当从一个EM场至另一个EM场转换时，所述酵母细胞培养物可以保持在相同容器中，使用同一套的电磁波发生器和发射器。
所述培养程序可以通过用细胞密度为大约105个细胞/ml的1ml选定的酵母菌株接种物接种100ml培养基起始。将起始培养基在35℃-37℃保持24-48小时，之后暴露于EM场中。所述培养程序优选在溶解氧浓度在0.025-0.08mol/m3的条件下进行，优选0.04mol/m3。氧的水平可以通过本领域已知的任何常规方法控制，包括但非限于搅拌和/或吹气。
所述培养最优选在液体培养基中进行，所述培养基中含有动物血清和酵母细胞可同化的营养素来源。表1提供了培养本发明第一种酵母细胞成分的培养基实例。
表1
通常地，碳水化合物如糖，例如蔗糖，葡萄糖，果糖，右旋糖，麦芽糖，木糖等及淀粉，可以单独或组合使用作为培养基中可同化碳源。培养基中利用的碳水化合物来源的精确数量部分依赖于培养基中的其它配料，但碳水化合物的数量通常在培养基重量的大约0.1％-5％之间变化，优选大约0.5％和2％，最优选大约0.8％。在培养基中这些碳源可以单独使用，或可以组合使用这样的一些碳源。可以掺入培养基中的无机盐是能产生钠，钙，磷酸根，硫酸根，碳酸根等离子的常规盐。营养性无机盐的非限制性实例是(NH4)2HPO4，CaCO3，MgSO4，NaCl，和CaSO4。
动物血清是包含白细胞的一种血液组分，可以通过本领域已知的标准方法如密度梯度离心从全血(100-500ml)中制备。例如使用牛血清，优选猪血清。分离出红细胞并弃去。在将培养基高压灭菌并冷却至大约45℃之后，将血清加入培养基中。
应注意表1提供的培养基成分是非限制性的。可根据需要按比例增加或减少。本领域技术人员根据实际及经济利益可以对所述培养基进行各种修改，如培养规模和培养基成分的当地供应。
尽管酵母细胞在EM场中培养仅几小时后就被激活，但所述酵母细胞可以在EM场中长期培养(例如一或多周)。在培养程序结束时，通过本领域已知的各种方法从培养物中回收组成本发明第一种酵母细胞成分的酵母细胞，并在大约0℃-4℃温度下贮存。回收的酵母细胞也可以干燥并以粉末形式贮存。
用Candida utilis Henneberg Lodder et Kreger Van Rij菌株AS2.281生产本发明第一种酵母细胞成分的一个非限制性实例见于下文第6章所述。
在另一个实施方案中，将第二种酵母细胞成分的酵母细胞在至少一个可变电磁(EM)场中培养，频率范围是6825MHZ-6860MHz。可以施加一个单一EM场或一系列EM场，每个电磁场具有在一定范围内的不同频率，或一定范围内的不同场强，或一定范围内的不同频率和场强。尽管可以使用任何实用数量的EM场，但优选将酵母培养物暴露于一系列的2，3，4，5，6，7，8，9或10种不同EM场中。可以通过本领域已知方式施加的EM场的各自频率可以为6825，6826，6827，6828，6829，6830，6831，6832，6833，6834，6835，6836，6837，6838，6839，6840，6841，6842，6843，6844，6845，6846，6847，6848，6849，6850，6851，6852，6853，6854，6855，6856，6857，6858，6859，或6860MHz。
EM场强范围是6.5-260mV/cm。在一个优选实施方案中，系列中开始的EM场比后来的EM场的场强低，由此酵母细胞培养物暴露于场强逐渐提高的EM场中。因此，可以将酵母细胞在较低场强(例如50-130mV/cm)培养8-88小时，然后在较高EM场强(例如130-260mV/cm)再培养8-88小时。当从一个EM场至另一个EM场转换时，所述酵母细胞培养物可以保持在相同容器中，使用同一套的电磁波发生器和发射器。
所述培养程序可以通过用细胞密度为大约105个细胞/ml的1ml选定的酵母菌株接种物接种100ml培养基起始。将起始培养基在35℃-37℃保持24-48小时，之后暴露于EM场中。所述培养程序优选在溶解氧浓度在0.025-0.08mol/m3的条件下进行，优选0.04mol/m3。氧的水平可以通过本领域已知的任何常规方法控制，包括但非限于搅拌和/或吹气。
所述培养最优选在液体培养基中进行，所述培养基中含有动物血清和酵母细胞可同化的营养素来源。表2提供了培养本发明第二种酵母细胞成分的培养基实例。
表2
通常地，碳水化合物如糖，例如蔗糖，葡萄糖，果糖，右旋糖，麦芽糖，木糖等及淀粉，可以单独或组合使用作为培养基中可同化碳源。培养基中利用的碳水化合物来源的精确数量部分依赖于培养基中的其它配料，但碳水化合物的数量通常在培养基重量的大约0.1％-5％之间变化，优选大约0.5％和2％，最优选大约0.8％。在培养基中这些碳源可以单独使用，或可以组合使用这样的一些碳源。可以掺入培养基中的无机盐是能产生钠，钙，磷酸根，硫酸根，碳酸根等离子的常规盐。营养性无机盐的非限制性实例是(NH4)2HPO4，CaCO3，MgSO4，NaCl，和CaSO4。
动物血清是包含白细胞的一种血液组分，可以通过本领域已知的标准方法如密度梯度离心从全血(100-500ml)中制备。例如使用牛血清，优选猪血清。分离出红细胞并弃去。在将培养基高压灭菌并冷却至大约45℃之后，将血清加入培养基中。
应注意表2提供的培养基成分是非限制性的。可根据需要按比例增加或减少。本领域技术人员根据实际及经济利益可以对所述培养基进行各种修改，如培养规模和培养基成分的当地供应。
尽管酵母细胞在EM场中培养仅几小时后就被激活，但所述酵母细胞可以在EM场中长期培养(例如一或多周)。在培养程序结束时，通过本领域已知的各种方法从培养物中回收组成本发明第二种酵母细胞成分的酵母细胞，并在大约0℃-4℃温度下贮存。回收的酵母细胞也可以干燥并以粉末形式贮存。
用Saccharomyces cerevisiae酵母菌株AS2.502生产本发明第二种酵母细胞成分的一个非限制性实例见于下文第6章所述。
在另一个实施方案中，将第三种酵母细胞成分的酵母细胞在至少一个可变电磁(EM)场中培养，频率范围是8120MHz-8135MHz。可以施加一个单一EM场或一系列EM场，每个电磁场具有在一定范围内的不同频率，或一定范围内的不同场强，或一定范围内的不同频率和场强。尽管可以使用任何实用数量的EM场，但优选将酵母培养暴露于一系列的2，3，4，5，6，7，8，9或10种不同EM场中。可以通过本领域已知方式施加的EM场的各自频率可以为8120，8121，8122，8123，8124，8125，8126，8127，8128，8129，8130，8131，8132，8133，8134，或8135MHz。
EM场强范围是10.5-290mV/cm。在一个优选实施方案中，串连开始的EM场比后来的EM场的场强低，由此酵母细胞培养物暴露于场强逐渐提高的EM场中。因此，可以将酵母细胞在较低场强(例如10-180mV/cm)培养8-66小时，然后在较高EM场强(例如170-290mV/cm)再培养8-66小时。当从一个EM场至另一个EM场转换时，所述酵母细胞培养物可以保持在相同容器中，使用相同系列的电磁波发生器和发射器。
所述培养程序可以通过用细胞密度为大约105个细胞/ml的1ml选定的酵母菌株接种物接种100ml培养基起始。将起始培养基在35℃-37℃保持24-48小时，之后暴露于EM场中。所述培养程序优选在溶解氧浓度在0.025-0.08mol/m3的条件下进行，优选0.04mol/m3。氧的水平可以通过本领域已知的任何常规方法控制，包括但非限于搅拌和/或吹气。
所述培养最优选在液体培养基中进行，所述培养基中含有动物血清和酵母细胞可同化的营养素来源。表3提供了培养本发明第三种酵母细胞成分的培养基实例。
表3
通常地，碳水化合物如糖，例如蔗糖，葡萄糖，果糖，右旋糖，麦芽糖，木糖等及淀粉，可以单独或组合使用作为培养基中可同化碳源。培养基中利用的碳水化合物来源的精确数量部分依赖于培养基中的其它配料，但碳水化合物的数量通常在培养基重量的大约0.1％-5％之间变化，优选大约0.5％和2％，最优选大约0.8％。在培养基中这些碳源可以单独使用，或可以组合使用这样的一些碳源。可以掺入培养基中的无机盐是能产生钠，钙，磷酸根，硫酸根，碳酸根等离子的常规盐。营养性无机盐的非限制性实例是(NH4)2HPO4，CaCO3，MgSO4，NaCl，和CaSO4。
动物血清是包含白细胞的一种血液组分，可以通过本领域已知的标准方法如密度梯度离心从全血(100-500ml)中制备。例如使用牛血清，优选猪血清。分离出红细胞并弃去。在将培养基高压灭菌并冷却至大约45℃之后，将血清加入培养基中。
应注意表3提供的培养基成分是非限制性的。可根据需要按比例增加或减少。本领域技术人员根据实际及经济利益可以对所述培养基进行各种修改，如培养规模和培养基成分的当地供应。
尽管酵母细胞在EM场中培养仅几小时后就被激活，但所述酵母细胞可以在EM场中长期培养(例如一或多周)。在培养程序结束时，通过本领域已知的各种方法从培养物中回收组成本发明第三种酵母细胞成分的酵母细胞，并在大约0℃-4℃温度下贮存。回收的酵母细胞也可以干燥并以粉末形式贮存。
用Saccharomyces cerevisiae酵母菌株IFFI1277生产本发明第三种酵母细胞成分的一个非限制性实例见于下文第6章所述。
在另一个实施方案中，将第四种酵母细胞成分的酵母细胞在至少一个可变电磁(EM)场中培养，频率范围是8524MHz-8554MHz。可以施加一个单一EM场或一系列EM场，每个电磁场具有在一定范围内的不同频率，或一定范围内的不同场强，或一定范围内的不同频率和场强。尽管可以使用任何实用数量的EM场，但优选将酵母培养物暴露于一系列的2，3，4，5，6，7，8，9或10种不同EM场中。可以通过本领域已知方式施加的EM场的各自频率可以为8524，8411，8412，8413，8414，8415，8416，8417，8418，8419，8420，8421，8422，8423，8424，8425，8426，8427，8428，8429或8554MHz。
EM场强范围是15-320mV/cm。在一个优选实施方案中，系列中开始的EM场比后来的EM场的场强低，由此酵母细胞培养物暴露于场强逐渐提高的EM场中。因此，可以将酵母细胞在较低场强(例如100-180mV/cm)培养10-60小时，然后在较高EM场强(例如200-320mV/cm)再培养10-60小时。当从一个EM场至另一个EM场转换时，所述酵母细胞培养物可以保持在相同容器中，使用同一套电磁波发生器和发射器。
所述培养程序可以通过用细胞密度为大约105个细胞/ml的1ml选定的酵母菌株接种物接种100ml培养基起始。将起始培养基在35℃-37℃保持24-48小时，之后暴露于EM场中。所述培养程序优选在溶解氧浓度在0.025-0.08mol/m3的条件下进行，优选0.04mol/m3。氧的水平可以通过本领域已知的任何常规方法控制，包括但非限于搅拌和/或吹气。
所述培养最优选在液体培养基中进行，所述培养基中含有动物血清和酵母细胞可同化的营养素来源。表4提供了培养本发明第四种酵母细胞成分的培养基实例。
表4
通常地，碳水化合物如糖，例如蔗糖，葡萄糖，果糖，右旋糖，麦芽糖，木糖等及淀粉，可以单独或组合使用作为培养基中可同化碳源。培养基中利用的碳水化合物来源的精确数量部分依赖于培养基中的其它配料，但碳水化合物的数量通常在培养基重量的大约0.1％-5％之间变化，优选大约0.5％和2％，最优选大约0.8％。在培养基中这些碳源可以单独使用，或可以组合使用这样的一些碳源。可以掺入培养基中的无机盐是能产生钠，钙，磷酸根，硫酸根，碳酸根等离子的常规盐。营养性无机盐的非限制性实例是(NH4)2HPO4，CaCO3，MgSO4，NaCl，和CaSO4。
动物血清是包含白细胞的一种血液组分，可以通过本领域已知的标准方法如密度梯度离心从全血(100-500ml)中制备。例如使用牛血清，优选猪血清。分离出红细胞并弃去。在将培养基高压灭菌并冷却至大约45℃之后，将血清加入培养基中。
应注意表3提供的培养基成分是非限制性的。可根据需要按比例增加或减少。本领域技术人员根据实际及经济利益可以对所述培养基进行各种修改，如培养规模和培养基成分的当地供应。
尽管酵母细胞在EM场中培养仅几小时后就被激活，但所述酵母细胞可以在EM场中长期培养(例如一或多周)。在培养程序结束时，通过本领域已知的各种方法从培养物中回收组成本发明第四种酵母细胞成分的酵母细胞，并在大约0℃-4℃温度下贮存。回收的酵母细胞也可以干燥并以粉末形式贮存。
用Geotrichum candidum Link酵母菌株AS2.361生产本发明第四种酵母细胞成分的一个非限制性实例见于下文第6章所述。5.2.酵母细胞的驯化在另一个实施方案中，激活的酵母细胞的性能可以如下最佳化在存在取自待喂食所述生物组合物的动物类型的胃肠道中的物质的情况下培养激活的酵母细胞。包含这个驯化过程使激活的酵母细胞适应并耐受动物胃中的酸性环境。
根据本发明，如5.1章节所述制备的激活的酵母细胞可以在具有表5所示成分的培养基中进一步培养。
表5 (/1000ml培养基)
该过程可以根据需要按比例增加或减少。
动物例如猪的胃液，可以得自新鲜屠宰动物胃内容物的液体部分。将胃内容物在无菌条件下过滤，以获得清澈液体，在使用前可在4℃贮存。
野枣汁是将每克碾碎的野枣与5ml水混合经过滤而制备。野山楂汁是将每克碾碎的野山楂与5ml水混合经过滤而制备。
将酵母细胞混合物在系列电磁场中培养大约48-96小时。根据所包括的酵母菌株，每个电磁场频率相应于5.1章节所述4种频率范围之一。如果四种酵母成分均存在，可以使用以下4种频带组合7700-7730MHz；6825-6860MHz；8110-8140MHz；8524-8554MHz。所述EM场可以相继或同时施加。在此程序中通常将所述酵母细胞置于30mV/cm-320mV/cm范围的EM场强中。
在酵母细胞培养物暴露于EM场时，所述培养物在大约5℃-38℃之间循环的温度下温育。例如在一个典型循环中，起始培养温度为大约37℃，逐渐降低至大约5℃，然后逐渐升高至大约38℃进行再次循环。每个完整循环持续大约3小时。在循环结束时，可以通过在大约3500rpm离心回收激活和驯化的酵母细胞，并贮存于4℃。5.3生物组合物的生产本发明还提供了一种生产包含本发明酵母细胞的生物组合物的方法。优选地，本发明生物组合物包含通过5.1章节所述方法激活并通过5.2章节所述方法驯化的酵母细胞。最优选地，所述生物组合物包含所有4种酵母细胞成分。
为大量生产本发明的生物组合物，可以按比例扩大培养程序。为举例示出按比例扩大程序，以下阐述了生产1000kg所述生物组合物的方法将4种酵母细胞成分的每一种贮存培养物均加入培养基中，所述培养基包含250升水中100kg淀粉。然后将酵母细胞在各自频率和120-450mV/cm场强的电磁场中，在35°-38℃培养。将培养程序进行大约48-96小时，或者酵母细胞数目达到大约2×1010/ml。此时，酵母细胞必须贮存在大约15°-20℃，而且如果不立即使用，在24小时内干燥贮存。对4种酵母细胞的每一种重复该程序。为生产包含所有4种酵母细胞组成分的生物组合物，将4种中每一种酵母细胞成分的250升培养基(即共1000升)混合并组合600kg淀粉。
由于酵母细胞和生物组合物不是必需立即使用，因此制备的酵母细胞和生物组合物可以在两阶段干燥程序中干燥。在第一个干燥阶段，将酵母细胞在第一个干燥器中在不超过65℃，不超过10分钟的条件下干燥，以便酵母细胞迅速静止。然后将酵母细胞置入第二个干燥器中，并在不超过70℃，不超过30分钟的条件下干燥，以进一步除去水分。在这两个阶段后，水含量应低于5％。优选在这两个干燥阶段遵守温度和干燥时间，以便酵母细胞不丧失其活力和功能。然后将干燥的酵母细胞冷却至室温。干燥的酵母细胞还可以在离析器中筛选以选择优选大小的颗粒。干燥的细胞然后可以置于散装装袋机中包装。6.实施例以下实施例例证了可以用作动物饲养添加剂的一种生物组合物的生产。
所述生物组合物包括以下四种酵母成分Candida utilis HennebergLodder et Kreger Van Rij AS2.281，Saccharomyces cerevisiae AS2.502，Saccharomyces cerevisiae IFFI1277和Geotrichum candidum LinkAS2.361。每种酵母细胞成分均能抑制Serpulina hyodysenteriae感染的发生及降低受感染的猪的死亡率。制备4种酵母细胞成分，如下分别测试将含有大约105细胞/ml的AS2.281的一种起始培养物置于如图1所示的容器(2)中，其中含有表1所示成分的培养基。最初，在无电磁场的情况下将酵母细胞在36±1℃培养约24个小时。然后，在相同培养基中，在36±1℃，将酵母细胞按指定顺序在一系列的八个电磁场中培养7715MHz，75mV/cm，10小时；7717MHz，75mV/cm，10小时；7720MHz，75mV/cm，24小时；7724MHz，75mV/cm，48小时；7715MHz，225mV/cm，10小时；7717MHz，225mV/cm，10小时；7720MHz，225mV/cm，12小时；及7724MHz，225mV/cm，24小时。如5.2章节所述，将酵母细胞在下述两个电磁场中，通过在猪胃液和山楂汁中进一步培养以驯化7720MHz，225mV/cm，12小时；7724MHz，225mV/cm，24小时。在最后培养阶段之后，酵母细胞既可以在24小时内使用以生产所述生物组合物，也可以如5.3章节所述干燥贮存。
如下测试该第一种酵母细胞成分对动物的有益作用用360头猪进行测试(Yu-No.3品种)，所有猪均大约4月龄，体重在≤10％内。将动物分成四组，每组90头猪。将所有四组动物均注射导致猪痢疾的5×106Serpulina hyodysenteriae。第一组动物(A组)喂食表6所示包含抗生素混合物的饮食。
表6含抗生素的动物饲料成分
B组动物喂食包含激活的AS2.281酵母细胞的饲料。所述激活的酵母细胞存在于一种添加剂中，所述添加剂是将所述干燥的细胞与沸石粉(小于200目)以大约109个酵母细胞/g沸石粉的比率混合制备。针对每995kg基本饲料，加入5kg所述饲料添加剂，产生含有0.5％重添加剂或5×1012个酵母细胞的改良饲料。第三组动物(C组)喂食含有添加剂的饲料，所述添加剂与B组所用添加剂相同制备，除了AS2.281酵母细胞未被激活。D组动物喂食既无抗生素又无酵母添加剂的基本饮食。10周后，各组动物的健康状况示于下表7。
表7用不同饮食喂养的动物健康状况
为制备第二种成分，将含有大约105细胞/ml的AS2.502的一种起始培养物置于如图1所示的容器(2)中，其中含有表2所示成分的培养基。最初，在无电磁场的情况下将酵母细胞在36±1℃培养约22个小时。然后，在相同培养基中，在36±1℃，将酵母细胞按指定顺序在一系列的八个电磁场中培养6833MHz，87mV/cm，24小时；6835MHz，87mV/cm，24小时；6842MHz，87mV/cm，10小时；6846MHz，87mV/cm，10小时；6833MHz，232mV/cm，12小时；6835MHz，232mV/cm，12小时；6842MHz，232mV/cm，12小时；及6846MHz，232mV/cm，12小时。如5.2章节所述，将酵母细胞在下述两个电磁场中，通过在猪胃液和山楂汁中进一步培养以驯化6833MHz，232mV/cm，12小时；6835MHz，232mV/cm，12小时。在最后培养阶段之后，酵母细胞既可以在24小时内使用以生产所述生物组合物，也可以如5.3章节所述干燥贮存。
如下测试该第二种酵母细胞成分对动物的有益作用用360头猪进行测试(Yu-No.3品种)，所有猪均大约4月龄。体重在≤10％内。将动物分成四组，每组90头猪。将所有四组动物均注射导致猪痢疾的5×106Serpulina hyodysenteriae。第一组动物(A组)喂食表8所示包含抗生素混合物的饮食。
表8含有抗生素的动物饲料成分
B组动物喂食包含激活的AS2.502酵母细胞的饲料。所述激活的酵母细胞存在于一种添加剂中，所述添加剂是将所述干燥的细胞与沸石粉(小于200目)以大约109个酵母细胞/g沸石粉的比率混合制备。每995kg基本饲料加入5kg所述饲料添加剂，产生含有0.5％重添加剂的改良饲料。第三组动物(C组)喂食含有添加剂的饲料，所述添加剂与B组所用添加剂相同制备，除了AS2.502酵母细胞未被激活。D组动物喂食既无抗生素又无酵母添加剂的基本饮食。10周后，各组动物的健康状况示于下表9.
表9用不同饮食喂养的动物健康状况
为制备第三种成分，将含有大约105细胞/ml的IFFI1277的一种起始培养物置于如图1所示的容器(2)中，其中含有表3所示成分的培养基。最初，在无电磁场的情况下将酵母细胞在36±1℃培养约33个小时。然后，在相同培养基中，在36±1℃，将酵母细胞按指定顺序在一系列的八个电磁场中培养8120MHz，102mV/cm，10小时；8122MHz，102mV/cm，10小时；8126MHz，102mV/cm，18小时；8132MHz，102mV/cm，18小时；8120MHz，235mV/cm，10小时；8122MHz，235mV/cm，10小时；8126MHz，235mV/cm，22小时；及8132MHz，235mV/cm，22小时。如5.2章节所述，将酵母细胞在下述两个电磁场中，通过在猪胃液和山楂汁中进一步培养以驯化8126MHz，235mV/cm，22小时；8132MHz，235mV/cm,22小时。在最后培养阶段之后，酵母细胞既可以在24小时内使用以生产所述生物组合物，也可以如5.3章节所述干燥贮存。
如下测试该第三种酵母细胞成分对动物的有益作用用360头猪进行测试(Yu-No.3品种)，均大约4月龄。体重在≤10％内。将动物分成四组，每组90头猪。将所有四组动物均注射导致猪痢疾的5×106Serpulina hyodysenteriae。第一组动物(A组)喂食表10所示包含抗生素混合物的饮食。
表10含有抗生素的动物饲料成分
B组动物喂食包含激活的IFFI1277酵母细胞的饲料。所述激活的酵母细胞存在于一种添加剂中，所述添加剂是将所述干燥的细胞与沸石粉(小于200目)以大约109个酵母细胞/g沸石粉的比率混合制备。每995kg基本饲料加入5kg所述饲料添加剂，产生含有0.5％重添加剂的改良饲料。第三组动物(C组)喂食含有添加剂的饲料，所述添加剂与B组所用添加剂相同制备，除了IFFI1277酵母细胞未被激活。D组动物喂食既无抗生素又无酵母添加剂的基本饮食。10周后，各组动物的健康状况示于下表11。
表11用不同饮食喂养的动物健康状况
为制备第四种成分，将含有大约105细胞/ml的AS2.361的一种起始培养物置于如图1所示的容器(2)中，其中含有表4所示成分的培养基。最初，在无电磁场的情况下将酵母细胞在36±1℃培养约35个小时。然后，在相同培养基中，在36±1℃，将酵母细胞按指定顺序在一系列的八个电磁场中培养8528MHz，98mV/cm，32小时；8534MHz，98mV/cm，32小时；8539MHz，98mV/cm，10小时；8544MHz，98mV/cm，10小时；8528MHz，235mV/cm，16小时；8534MHz，235mV/cm，16小时；8539MHz，235mV/cm，10小时；及8544MHz，235mV/cm，10小时。如5.2章节所述，将酵母细胞在下述两个电磁场中，通过在猪胃液和山楂汁中进一步培养以驯化8528MHz，235mV/cm，16小时；8534MHz，235mV/cm，16小时。在最后培养阶段之后，酵母细胞既可以在24小时内使用以生产所述生物组合物，也可以如5.3章节所述干燥贮存。
如下测试该第四种酵母细胞成分对动物的有益作用用360头猪进行测试(Yu-No.3品种)，均大约4月龄。体重在≤10％内。将动物分成四组，每组90头猪。将所有四组动物均注射导致猪痢疾的5×106Serpulina hyodysenteriae。第一组动物(A组)喂食表12所示包含抗生素混合物的饮食。
表12含有抗生素的动物饲料成分
B组动物喂食包含激活的AS2.361酵母细胞的饲料。所述激活的酵母细胞存在于一种添加剂中，所述添加剂是将所述干燥的细胞与沸石粉(小于200目)以大约109个酵母细胞/g沸石粉的比率混合制备。每995kg基本饲料加入5kg所述饲料添加剂，产生含有0.5％重添加剂的改良饲料。第三组动物(C组)喂食含有添加剂的饲料，所述添加剂与B组所用添加剂相同制备，除了AS2.361酵母细胞未被激活。D组动物喂食既无抗生素又无酵母添加剂的基本饮食。10周后，各组动物的健康状况示于下表13。
表13用不同饮食喂养的动物健康状况
包含所有4种酵母细胞成分的生物饲料添加剂通过将每种成分的干燥细胞与沸石粉(小于200目)以大约1×109个酵母细胞/g沸石粉的比率混合制备。每995kg基本饲料加入5kg酵母和沸石粉的混合物，产生含有0.5％重酵母和沸石粉的一种添加剂。用360头猪(Yu-No.3品种)测试其对动物的有益作用，所有动物均大约4月龄。体重在≤10％内。将动物分成四组，每组90头猪。将所有四组动物均注射导致猪痢疾的5×106Serpulina hyodysenteriae。第一组动物(A组)喂食表14所示包含抗生素混合物的饮食。
表14含有抗生素的动物饲料成分
B组动物喂食包含如上述制备的生物饲料添加剂的饲料。第三组动物(C组)喂食含有添加剂的饲料，所述添加剂与B组所用添加剂相同制备，除了所述酵母细胞未被激活。D组动物喂食既无抗生素又无生物饲料添加剂的基本饮食。10周后，各组动物的健康状况示于下表15。
表15用不同饮食喂养的动物健康状况
以上结果表明本发明生物组合物是一种有价值的动物饲料添加剂，其可以用于保持动物健康，及帮助动物从感染中康复。
本发明不限于具体的实施方案的范围，所述实施方案只是举例示出了本发明的各个方面，其功能等价方法和成分包含在本发明范围内。本领域技术人员通过前述教导和所附权利要求书，可以对本发明加以各种修改。这种修改应在所附权利要求范围内。


本发明涉及包含酵母细胞的生物组合物，其可以改善猪的免疫功能。本发明还涉及生产所述生物组合物的方法，及所述生物组合物作为猪饲料添加剂的应用方法。