对lap与lip之比例的控制制作方法

lap lip 比例 控制

本发明提供了控制细胞中LAP与LIP之比例的组合物和方法特别地，本发明提供了编码LAP(转录激活因子)活性的重组载体，其中LIP活性的表达被抑制，且其中LIP活性的表达被抑制到使得LIP不会下调LAP活性，以及提供了减少LIP活性表达的寡核苷酸和反义核酸本发明还提供了筛选一种试剂是否可调节由C/EBPβ基因表达的LAP与LIP表达水平之比例的方法人们也进行了为治疗癌症而在细胞或组织中导入细胞因子基因的尝试例如进行了下面的尝试在淋巴细胞(例如，淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL))中导入细胞因子基因，以及通过由转导细胞分泌的细胞因子而活化淋巴细胞以便提高被动免疫性；或通过在TILs中直接导入具有抗肿瘤活性的IFN或TNF基因来提高在肿瘤位点处的抗肿瘤活性Treisman J.等人(1994，Cell Immunol.156448-457)和Hwu等人(1993，J.Immumol.1504104-4115)此外，已经报告了一种通过逆转录病毒载体等等而在肿瘤细胞中导入细胞因子基因，和通过使用转导细胞作为肿瘤疫苗而使宿主的肿瘤-特异的免疫细胞被诱导的尝试Adris S.等人(2000，Cancer Res.606696-6703)和Hiroishi K等人(1999，Gen Ther.121988-1994)在许多开发的方法中已经涉及到CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)基因Hirai等人(2001，J.of Cell Biol.Vol.153785-794)在C/EBPβ基因的核苷酸序列中存在两个转录起始位点，且LAP(转录激活因子)和LIP(转录阻抑蛋白)是通过每个转录位点的翻译而产生的Descombes等人(1991，Cell，第67卷，569-579)另外报道说，当LAP/LIP比例提高时，靶基因的转录活性被提高，且在大鼠肝的分化中的最后阶段LAP/LIP比例提高了Descombes等人，上述文献Buck等人(1994，EMBO Journal Vol.13，No.4，第851-860页)公开了可以通过LAP/LIP比例来调节肝细胞的分化和静止状态Hiral等人，上述文献，报道了当用上皮形成素处理细胞时，C/EBPβ的表达提高了，而且改变了编码的LAP/LIP比例，上皮形成素为一种在乳腺的肌上皮细胞和成纤维细胞的表面上被表达、并与乳腺的形态形成有关的蛋白尽管在治疗癌症症状方面已经有所进展，但仍需要更好的筛选可以治疗和/或改善癌症症状的试剂的方法，以及治疗和/或改善癌症的症状的方法在此公开的全部专利和出版物在此以其整体引用作为参考本发明还提供包含用另一个密码子对LIP的起始密码子ATG进行的取代的变体LAP多肽，其中取代密码子不是TTG，且在某些例子中，不是翻译终止密码子在某些例子中，变体LAP多肽包含用编码Ala，Gly，Pro或Arg的密码子对LIP的起始密码子ATG进行的取代本发明还提供了编码这种多肽的被分离的核酸本发明还提供了包含邻近C/EBPβ基因的核苷酸序列中的LIP(转录抑制因子蛋白)的起始密码子ATG的长度为约10到约100个核苷酸的核苷酸序列，或它们的互补序列，其中所述寡核苷酸，或它们的互补序列能够减少LIP表达在某些例子，寡核苷酸的长度为约10到80个核苷酸在其它例子中，寡核苷酸的长度为约15到约50个核苷酸本发明还提供了包含本发明的重组载体，寡核苷酸或变体LAP多肽(或编码所述多肽的分离的核酸)的宿主细胞，组合物和试剂盒，以及获得诸如此类的方法本发明还提供了改进细胞中LAP(转录激活因子)与LIP(转录抑制因子蛋白)表达水平的比例的方法，包括使细胞与本发明的重组载体或本发明的寡核苷酸或本发明的变体LAP多肽在适宜条件下接触在某些例子中，细胞是癌细胞，例如乳腺或肝癌细胞本发明还提供了治疗和/或改善相关于个体中LAP(转录激活因子)与LIP(转录抑制因子蛋白)表达水平的异常比例有关的疾病和/或状况的症状的方法，该方法包括给予个体本发明的重组载体，或寡核苷酸，或变体LAP多肽在某些例子中，疾病或状况是癌症本发明还提供了筛选一种试剂是否可调节C/EBPβ基因表达的LAP(转录激活因子)与LIP(转录抑制因子蛋白)的表达水平的比例的方法，该方法包括使C/EBPβ基因与所述试剂接触以及测定LAP表达与LIP表达的比例的步骤在某些例子中，试剂是一种低分子量化合物；在其它例子中，试剂是一种天然存在的物质的提取物在其它例子中，所述比例是通过RNA印迹法测定的在某些例子中，哺乳动物细胞包含所述C/EBPβ基因在某些例子中，该方法进一步包括对可提高细胞中LAP的表达水平的试剂的鉴定，或对可降低细胞中LIP的表达水平的试剂的鉴定本发明还涉及本发明的重组载体在制造治疗和/或改善癌症症状的药物中的用途本发明还涉及本发明的变体LAP多肽在制造治疗和/或改善癌症的症状的药物中的用途本发明还涉及本发明的寡核苷酸在制造治疗和/或改善癌症症状的药物中的用途本发明提供了其中LIP活性表达被抑制的编码LAP(转录激活因子)活性的重组载体在某些例子中，本发明提供了编码LAP(转录激活因子)活性的重组载体，其中LIP活性表达被抑制，且其中LIP活性的表达被抑制到一定程度，以至于LIP活性不能下调LAP活性本发明提供了编码LAP变异形式的分离的核酸，其中LIP的起始密码子ATG已经被另一个密码子所取代，其中取代密码子不是TTG，且在某些例子中，不是终止密码子本发明提供了变体LAP多肽，其中LIP的起始密码子ATG已经被另一个密码子所取代，其中取代密码子不是TTG，且在某些例子中，不是终止密码子在某些例子中，这样的变体LAP多肽显示溶瘤活性特别地，本发明提供了包含部分或全部C/EBPβ基因的核酸的重组载体，其中所述核酸包含邻近C/EBPβ的核苷酸序列中的LIP的起始密码子的核苷酸序列中的突变在某些例子中，这种重组载体显示出溶瘤活性，并可用于基因治疗，即可用于对患有和LAP与LIP的比例有关的疾病或状况的细胞或个体给药或递送特别地，本发明的重组载体可用于向细胞给予或递送表达LAP活性的重组载体这种重组载体可被用于增加细胞中LAP与LIP活性的比例的方法；并可用于治疗和/或改善患有相关于LAP与LIP的比例的疾病和/或状况的个体中的相关于LAP与LIP的比例的疾病和/或状况的症状的方法；以及可用于筛选改进LAP与LIP的比例的试剂的方法本发明还提供了能够降低，减少或抑制LIP表达的寡核苷酸，反义核酸和干扰RNA在此公开的发明提供了改进细胞中LAP与LIP的表达水平的比例的方法，包括使细胞与能够降低、减少或抑制LIP的表达的本发明的重组载体，或本发明的寡核苷酸、反义核酸或干扰RNA接触在某些例子中，使细胞和本发明的重组载体，或本发明的寡核苷酸，反义核苷酸或干扰RNA以及上皮形成素一起接触本发明还提供了治疗和/或改善相关于个体中LAP与LIP的表达水平的比例的疾病和/或状况的症状，例如癌症的方法，该方法包括对患有癌症的个体给予本发明的重组载体，或本发明的寡核苷酸、反义核酸或干扰RNA，它们单独或和其它治疗联合或与上皮形成素联合用药本发明还提供了筛选一种试剂是否调节C/EBPβ基因表达的LAP与LIP的表达水平的比例的方法本发明还提供了测定具体的癌症或恶性细胞对用本发明的重组载体，或本发明的寡核苷酸，反义核苷酸或干扰RNA治疗是否敏感的方法相应地，本发明还提供了包括本发明的重组载体，或本发明的寡核苷酸，反义核苷酸或干扰RNA的试剂盒在某些例子中，本发明的试剂盒包括用来试验所治疗的癌细胞的敏感性的重组载体本发明还提供了包含本发明的重组载体，或本发明的寡核苷酸，反义核苷酸或干扰RNA的组合物，以及获得本发明的重组载体或本发明的寡核苷酸，反义核酸或干扰RNA的方法除非另有陈述，本发明的实际应用中使用在本领域技术范围之内的常规的分子生物学，病毒学，微生物学，免疫学，和重组DNA技术这些技术全部在文献中说明见例如，Maniatis等人，Molecμlar CloningA LaboratoryManual(1982)；DNA CloningA Practical Approach，vols.I&II(D.Glover，编)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait，编(1984))；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins，编(1985))；Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins，编(1984))；Animal Cell Culture(R.Freshney，编(1986))；Perbal.A Practical Guide toMolecular Cloning(1984)；Ausubel，等人，Current Protocols In Molecular Biology，John Wiley&Sons(1987，1988，1989，1990，1991，1992，1993，1994，1995，1996)；和Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual(第二版)；第I，II和III卷(1989)I.CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)；LAP和LIPCCAAT/强子结合蛋白(“C/EBP”)包含一类增强子结合蛋白质(EBPs)，它的成员能够优先识别和结合CCAAT序列基元(例如在转铁蛋白和ApoB基因中所发现的)，增强子核心序列基元，或若干病毒启动子的增强子区(Landschultz，W.H.等人，Genes Dev.2786-800(1989)；Brunel，F.等人，J.Biol.Chem26310180-10185(1988)；Metzger，S.等人，J.Biol.Chem.2659978-9983(1990))来源于哺乳动物的C/EBPβ基因是已知的且公开在，例如，Descombes等人(1990，Genes Dev.Vol.4，pgs.1541-1551)和Akira等人(1990，EMBO J9，1897-1906)源自大鼠的C/EBPβ基因的核苷酸序列和氨基酸序列被分别描述为SEQ ID NOS1和2源自人的C/EBPβ基因的核苷酸序列和氨基酸序列被分别描述为SEQ ID NOS3和4C/EBPβ基因具有2个翻译产物，即LAP(转录激活因子)和LIP(转录阻抑蛋白)2种翻译产物的存在可归因于在C/EBPβ(CCAAT/增强子结合蛋白β)基因的核苷酸序列中存在2个或2个以上的转录起始位点LAP(转录激活因子)或LIP(转录阻抑蛋白)每一个都是通过从这些转录起始位点的任何一个开始转录/翻译而产生的LAP是一种具有转录控制位点和N-末端侧的DNA结合位点的蛋白，而LIP是一种仅仅具有LAP的DNA结合位点而没有转录控制位点的蛋白这两种蛋白质具有相同的构架，即LIP与LAP都具有C-末端的145个氨基酸(Buck等人，上文)不受理论的限制，Descombes等人(1991，Cell，vol.67569-579页)提出LAP和LIP是由相同的mRNAs通过渗漏核糖体扫描机理翻译的LIP(转录抑制因子蛋白)的起始密码子ATG相应于SEQ ID NO1的核苷酸序列中的第457到第459个核苷酸，并相应于SEQ ID NO3的核苷酸序列中的第595到597个核苷酸Buck等人，上文，报道了LAP表达和S-期在肝癌细胞中是互相排斥的他们发现LAP在G1/S界面前抑制肝癌细胞增殖并阻止细胞进入S-期Descombes等人(1991，Cell vol.67569-579)公开了LAP和LIP都具有包含碱性DNA结合域和亮氨酸拉链结构二聚螺旋的145个C-末端氨基酸Buck等人，上文，公开了阻止肝癌进入S-期要求LAP亮氨酸拉链结构的完整Buck等人，上文，还公开了LIP(缺少LAP的N-末端活化结构域)在阻断肝癌细胞增殖和中是无效的，并且拮抗LAP对细胞周期的抑制作用不受理论的限制，Buck等人，上文，提出LIP的145个氨基酸，包括亮氨酸拉链和碱性域，通过或者直接与DNA-结合位点竞争或间接地通过形成LIP/LAP二聚物而起LAP的拮抗剂的作用相应地，本发明提供了其中LIP表达被抑制的编码LAP(转录激活因子)活性的重组载体在另一个例子中，本发明提供了其中LIP的表达被抑制，且其中LIP的表达被抑制到使得LIP不能下调LAP活性的编码LAP(转录激活因子)活性的重组载体LAP活性可以通过在Buck等人，上文中所公开的试验中的LAP抑制肝癌细胞增殖的能力来测定，或通过在此文实施例中公开的体内模型中LAP抑制癌症形成的能力来测定Descombes等人，(1991，Cell，vol.67569-579)公开了LAP mRNA具有三个符合读框的AUGsLAP起始于第一个符合读框的AUG处(39kd蛋白)；且LIP起始于第三个读框AUG(20kd蛋白)在某些例子中，重组载体包括N-末端LAP活化域和/或DNA结合域和/或亮氨酸拉链且表达LAP活性，其中LIP活性被抑制本发明提供了编码LAP活性的重组载体，包含编码变体LAP多肽的核酸，其中LIP的起始密码子被另一个密码子所取代，其中取代密码子不是TTG，且在某些例子中，不是终止密码子本发明还提供了编码变体LAP多肽的分离的核酸，其中LIP的起始密码子被另一个密码子所取代，其中取代密码子不是TTG，且在某些例子中，不是终止密码子本发明提供了LAP多肽的变体形式，其中LIP的起始密码子被另一个密码子所取代，其中取代密码子不是TTG，且在某些例子中，不是终止密码子在此使用的“变体LAP多肽”是一种包括LIP的起始ATG密码子的突变的多肽，以致在变体LAP多肽保留了至少一种LAP生理活性时，LIP活性被减低或抑制本发明提供了包含部分或全部C/EBPβ基因的重组基因载体，在某些例子中，为重组病毒载体，和在其它例子中，提供了病毒颗粒，其中部分或全部C/EBPβ基因包含邻近LIP的起始密码子ATG的区域，其中在邻近LIP(转录抑制因子蛋白)的起始密码子ATG的核苷酸序列中导入了突变在此所使用的术语“突变”包括核酸插入，缺失和取代物在某些例子中，突变是用另一个密码子取代LIP的起始密码子ATG在某些例子中，该突变降低，减少或抑制了LIP的转录/翻译在某些例子中，该突变降低、减少或抑制了LIP的转录/翻译，而没有在编码LAP的核酸中导入移码突变在其它例子中，该突变降低，减少或抑制了LIP的转录/翻译，同时保留了LAP的生理活性在其它例子中，重组载体包括C/EBPβ的核酸片段或部分，只要片段或部分编码了保留LAP活性的产物LAP活性可以通过本领域技术人员已知的方法和通过在此文中公开的方法测定在某些例子中，LIP的起始密码子ATG被编码另一个氨基酸的密码子所取代，其中取代密码子不是TTG，且在某些例子中，取代密码子不是终止密码子在某些例子中，取代密码子是保守密码子且不是TTG在某些例子中，密码子编码Ala，Gly或Pro在于此公开的其它例子中，LIP的起始密码子ATG被CGC取代在这种重组基因载体到细胞或组织的递送中，LIP的转录/翻译被降低，减少，停止或抑制在其它例子中，LIP的转录/翻译被降低，减少，停止或抑制，而没有影响来源于C/EBPβ基因的LAP(转录激活因子)的转录/翻译在某些例子中，LAP的至少一种生理活性被保留在某些例子中，在本发明的重组载体向细胞的递送中，LAP被优势地表达此外，如本说明书的实施例所证明，当向裸鼠IP注射包括导入C/EBPβ突变的基因的载体时，发现与对照组相比较，小鼠没有癌症形成和转移即，在本发明中已经揭示了通过仅仅LAP的占优势的表达可使体内癌细胞正常化可被用于本发明的C/EBPβ(CCAAT/增强子结合蛋白β)基因的来源是不受特别限制的，且可以使用来源于任何活生物体的任何一种基因本发明包括来源于任何来源的C/EBPβ在某些例子中，可以使用来源于哺乳动物的C/EBPβ基因术语“哺乳动物”是指哺乳动物物种的任何个体，且包括大的动物(牛，羊，马等等)，运动动物(包括狗和猫)，和灵长类(包括旧世界猴，新世界猴，猿，人，等等)在其它例子中，使用人的C/EBPβ基因特别地，源自人的C/EBPβ基因的核苷酸序列和氨基酸序列分别被称作SEQ ID NOS3和4用于本发明的C/EBPβ(CCAAT/增强子结合蛋白b)基因可以是由哺乳动物培养细胞等等通过使用本领域技术人员已知的技术，例如PCR而获得的cDNA可以得到C/EBPβ的哺乳动物培养细胞系的例子包括肝实质性细胞，乳房上皮细胞和脂肪细胞这种细胞系是可以从公共来源获得的做为选择，C/EBPβ基因或它们的片段或部分，例如包括LIP的起始密码子ATG的片段或部分，可以是根据本说明书的SEQ ID NOS1到4的核苷酸序列和氨基酸序列的信息化学合成的基因此外，当包含部分或全部C/EBPβ基因的本发明的重组基因载体被用作人的基因治疗试剂，即对人给药或递送时，优选使用人的基因以减少、最小化或抑制任何潜在的免疫排斥，并提高治疗的效果在邻近C/EBPβ基因的核苷酸序列中的LIP的起始密码子ATG的核苷酸序列中导入突变的方法是本领域技术人员已知的，它通过使用常用的重组技术例如通过使用PCR方法使用适当设计的引物进行PCR技术是本领域所熟知的在邻近LIP(转录抑制因子蛋白)的起始密码子ATG的核苷酸序列中进行或设计突变的导入以便降低、减少、停止或抑制LIP的转录/翻译，且在某些例子中，不影响LAP(转录激活因子)的转录/翻译措词“不影响LAP(转录激活因子)的转录/翻译”是指具有生物活性的LAP是在没有导入引起LAP的转录/翻译中发生移码的突变的情况下被表达的LAP调节各种蛋白质，包括FGF受体和IL-8的转录已经显示LAP将停滞HepG2细胞的增殖并降低由c-jun启动子的转录见Buck等人，1994，The EMBO J.vol 13851-860本领域技术人员将能确定邻近LIP中的起始密码子ATG导入的突变是否影响LAP的生物活性，通过例如，Buck等人所公开的由始于c-jum启动子的HepG2增殖或转录的方法测定另外，措词“降低，减少，停止或抑制LIP的转录/翻译”是指具有生理活性的LIP是在与对照组相比较较低的水平下被表达的，或LIP表达水平是不可检测出的或LIP不是由突变型C/EBPβ基因表达的试验LAP和LIP的转录/翻译的方法是本领域技术人员已知的，且包括RNA印迹和PCR法此外，在此使用的措词“邻近LIP的起始密码子ATG的核苷酸序列”，包括由LIP的起始ATG(相应于SEQ ID NO1的核苷酸序列中的第457和第459个核苷酸)的正向(3′)和反向(5′)的在约100个核苷酸范围内的核苷酸序列；且在某些例子中，为ATG正向和反向的约90个核苷酸；且在某些例子中，为ATG正向和反向的80个核苷酸；且在某些例子中，为ATG正向和反向的70个核苷酸，ATG正向和反向的60个核苷酸；且在某些例子中，为ATG正向和反向的50个核苷酸；且在某些例子中，为ATG正向和反向的40个核苷酸；在某些例子中，为ATG正向和反向的30个核苷酸；且在某些例子中，为ATG正向和反向的20个核苷酸；在某些例子中，为ATG正向和反向的10或5个核苷酸；且在某些例子中，ATG被另外的氨基酸密码子取代在其它例子中，ATG保持完整，而邻近ATG的核酸，在某些例子中ATG的3′端，是突变的以致不能发生由LIP的转录和/或翻译举例来说，LIP(转录抑制因子蛋白)的起始密码子ATG可以被另一个密码子取代，其中密码子不是TTG，且在某些例子中，不是终止密码子用来取代ATG的密码子的种类没有特别限制，只要密码子取代物是一种非终止密码子的密码子，且不能导致LAP的翻译的移码Buck等人，上文，公开了要求LAP亮氨酸拉链(在C-末端145个氨基酸中被发现)的完整以阻止肝癌细胞进入S-期优选编码不会使被编码蛋白的性质受影响的氨基酸的密码子这种氨基酸的例子包括丙氨酸，甘氨酸和脯氨酸在此公开的说明性的实施方案中，LIP的起始密码子被编码Arg的密码子取代如实施例中所示，当g6乳腺癌细胞用包括此取代物的载体转染，且被导入到裸鼠内时，与对照组比较裸鼠失去癌症形成能力本发明的重组基因载体是包括具有以上描述的在其中导入的突变的部分或全部C/EBPβ基因的载体本发明的重组基因载体是在适宜的载体中通过向启动子的下游导入，例如通过连接导入具有导入其中的突变的核苷酸序列的C/EBPβ基因而构建的在基因序列中导入突变和构建重组载体的技术是本领域技术人员已知的在某些例子中，当重组基因载体被导入细胞时，它也是能够表达作为细胞中的基因产物的部分或全部LAP的表达载体在某些例子中，部分或全部LAP保留了至少一种LAP活性上皮形成素已知可增加C/EBPβ的表达(Hirai等人，2001，J.of Cell Biol.Vol.153pg.785-794)因此，在本发明的某些例子中，还在细胞中导入了编码部分或全部上皮形成素的核酸，以及本发明的重组载体，特别地为能够表达具有至少一种LAP活性的部分或全部LAP基因产物的重组载体这些具有上皮形成素活性的蛋白质或肽的例子包括上皮形成素本身(即全长蛋白)、包含上皮形成素的部分氨基酸序列和具有上皮形成素活性的肽，以及它们的修饰肽上皮形成素和它们的部分肽详细地公开在欧洲专利公开EP0698666，美国专利U.S.5,726,298，美国专利US5,837,239和国际专利公开WO 98/22505和WO 01/94382中；且还可以使用其中描述的这些上皮形成素和部分肽编码上皮形成素的核酸是在本发明的重组载体之前、之后或同时被导入细胞的，且可在相同的重组载体或不同的载体上被导入如上所述，本发明提供了一种C/EBPβ基因，其中包括用掺入本发明的重组载体中的另一个密码子(只要密码子不是TTG)对LIP(转录抑制因子蛋白)的起始密码子ATG进行的取代本发明包括在宿主细胞中导入本发明的重组载体的方法在某些实施方案中，载体是重组病毒载体且宿主细胞被病毒载体感染因此本发明包括本发明的重组载体，其特征在于通过用载体感染细胞而在细胞中导入基因，并且使基因在细胞中表达在细胞中导入基因构建物，例如，本发明的重组载体可以使用本领域任何已知的技术实现，包括磷酸钙-介导的转染，电穿孔法，脂质体-介导的转染，裸DNA掺，电穿孔，以及病毒(DNA病毒和逆转录病毒两者介导的)转染实现在细胞中导入基因的方法是本领域所熟知的II.病毒载体可以使用动物，即哺乳动物例如人的表达质粒在某些例子中，载体是一种病毒载体用于本发明中的载体的例子包括病毒载体例如逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺伴随病毒载体，杆状病毒载体，以及牛痘病毒载体病毒载体中，特别优选使用逆转录病毒载体，因为在细胞被逆转录病毒载体感染之后，病毒基因组将插入宿主染色体中且载体使外源基因整合到载体中以被稳定地和长期地表达逆转录病毒重组载体的结构以及它们体外或体内的用途已经在文献中被广泛地描述特别见Breakfield等人，New Biologist 3(1991)203；EP453242，EP 178220，Bemstein等人，Genet Eng.7(1985)235；McCormick，BioTechnology 3(1985)689，等等使用不能复制的逆转录病毒进行逆转录病毒介导的标记基因的基因转移方法是早已确认的(Correll，et al.(1989)PNAS USA868912；Bordignon(1989).PNAS USA 866748-52；Cμlver，K.(1990)，PNAS USA883155；and Ri]1，D.IL(1991)Blood79(10)2694-700. 腺病毒具有实现高效率转导的优点且不要求对于细胞的有效转导的细胞增殖有关腺病毒和腺病毒载体体系的发展情况的一般背景参考文献见Graham等人(1973)Virology 52456-467；Takiff等人(1981)Lancet 11832-834；Berkner等人(1983)Nucleic Acid Research 116003-6020；Graham(1984)EMBO J32917-2922；Bett等人(1993)J.Virology 675911-5921；和Bett等人(1994)Proc.Natl Acad Sci.USA 918802-8806腺病毒载体已经被用于基因的体外克隆和表达(Gluzman等人，Cold Spring Harbor，N.Y.11724.第187页)，转基因动物的产生(WO95/22616)，将基因回体转移到细胞中(WO95/14785；WO95/06120)或体内将基因转移到细胞中(特别见WO93/19191，WO94/24297，WO94/08026)腺伴随病毒(AAV)是一种细小病毒，其是一种大约5kb的单链线状DNA病毒，其病毒复制要求辅助病毒(腺病毒等等)(见B.J.Carter，在″Handbook ofParvoviruses″中，P.Tijsser.编CRC出版社，第155-168页)来源于AAVs的载体在体外和体内基因转移中的用途已经在文献中被描述(具体见WO91/18088；WO93/09239；U.S.Pat.Nos.4,797,368，5,139,941.和EP 488 528)人们知道腺伴随病毒是通过ITRs(反向末端重复序列)整合到宿主细胞的染色体的特异部位，ITRs存在于病毒基因组的两端且具有T形发夹结构至于病毒蛋白质，基因组的左半边编码非结构蛋白(调节蛋白)的Rep，而基因组的右半边编码衣壳蛋白的Cap，衣壳蛋白为一种结构蛋白质为了制造AAV载体，构建了包括在AAV两端的ITRs的AAV，且将具有目的基因的质粒(AAV载体质粒)或包括目的基因的核酸插入到ITRs之间病毒复制或病毒颗粒的形成所需的病毒蛋白质是由其它辅助细胞质粒提供的将以上两种质粒例如通过转染导入到HEK293细胞中，而后将得到的细胞用腺病毒(辅助病毒)感染，由此制备非增殖的重组体AAV(AAV载体)做为选择，宿主细胞包含编码辅助病毒功能的核酸此AAV载体存在于细胞核中，因此在冻融和收集细胞之后，通过加热将沾污的腺病毒灭活或通过例如CsCl梯度从AAV中除去此外，载体是通过氯化铯密度-梯度超速离心法纯化的杆状病毒已经被用来在哺乳动物细胞中表达蛋白质，见例如U.S.Pat.No.5,731,182杆状病毒的基因组可以通过配体DNA的嵌入物而被改进，嵌入物包括编码哺乳动物受体特殊蛋白质的基因，可使杆状病毒结合并进入哺乳动物细胞在US专利No.6,103,244中描述了牛痘病毒Panicali和Paoletti描述了包括外源基因的重组牛痘病毒的构建(1982，Proc.Nat′l Acad Sci.U.S.A.794927-4931；Mackett等人(1982，Proc.Nat′l Acad.Sci.U.S.A.79.7415-7419；和U.S.专利No.4,769,330当使用逆转录病毒载体时，逆转录病毒的例子包括来源于肿瘤病毒例如Moloney鼠白血病病毒(MoMLV)和来源于慢病毒属例如人类免疫缺陷性病毒(HIV)的那些病毒通常使用的逆转录病毒载体是利用鼠白血病病毒(MoMLV)的基本结构的逆转录病毒载体，鼠白血病病毒是RNA病毒，且它具有宽的宿主范围和比较高的基因导入效率制备逆转录病毒载体的方法是本领域已知的简要地，为了制备逆转录病毒载体，首先由病毒基因组中删除LTR(长末端重复序列)之中的大部分的gag，pol，和env，并将目的基因代替它们插入其中当在为表达基因产物即病毒蛋白(gag，pol和env)而制备的包装细胞系中导入此载体质粒时，表达基因产物(逆转录病毒载体)的重组体逆转录病毒在培养物上清液中被制备，所述细胞系为包含gag，pol，和env的核酸的细胞系通常，克隆了高效价逆转录病毒载体产生系，且可在长时期使用该细胞系通常使用以上描述的病毒载体制备细胞的培养物上清液来感染靶细胞腺病毒是一种具有大约36kb的大小的线状双链DNA病毒制备腺病毒载体的方法是本领域已知的，且在下面简要地描述在某些例子中，使用复制缺损型腺病毒，例如缺乏部分或全部重要的E1功能的腺病毒腺病毒载体的制备方法如下简述简要地，从腺病毒上删掉E1基因区域，并构建具有插入到该区域中的目的基因的粘粒这些粘粒连同其中E1基因区域已经被切除的亲代病毒DNA(使用具有与其连接的末端蛋白的那些)一起被导入到HEK293细胞中然后，在细胞中发生同源重组，引起非增殖的腺病毒载体的产生通过冻融细胞收集这些病毒载体，并通过氯化铯密度-梯度超速离心法纯化腺病毒载体的特征是该载体可以制备高效价的载体，可以在大量细胞中有效地导入基因，且可以在非分裂的细胞中导入基因当基因被导入癌细胞中时，少量细胞毒性无关紧要见Horowitz J.1999，Curr.Opin.Mol.Ther.4500-509此外，还有其中的瞬时基因表达可以获得治疗效果的一些例子，而且因此腺病毒载体特别适合于癌症的基因治疗因为动物细胞用作宿主，故可以使用启动子例如来源于SV40的启动子，逆转录病毒启动子，金属硫蛋白启动子或β肌动蛋白启动子此外，如果必要的话可以使用增强子细胞或组织的特异表达可以通过使用细胞特异性增强子和/或启动子实现通常见Huber等人(1995)Adv.Drug Delivery Reviews 17279-292包括本发明的重组载体的表达载体还可以包含肿瘤-标记蛋白质的一或多个启动子和/或增强子，或肿瘤中的可以将载体导向肿瘤细胞的其它被上调的因子例如，ErbB2的启动子(在乳腺肿瘤细胞中发现其表达增强)可以被用于将本发明的重组载体导向乳腺肿瘤细胞作为在动物中表达的质粒载体的宿主，可使用大肠杆菌K12-HB101株，DH5a株等等这种株是可以从公共来源获得的转化大肠杆菌的方法是本领域技术人员已知的(见例如，Maniatis等人)至于病毒载体的宿主，可使用具有制备病毒的能力的动物细胞，例如COS-7细胞，CHO细胞，BALB/3T3细胞以及希拉细胞病毒载体可以是具有复制能力的或复制缺陷的复制缺陷型病毒载体是在合适的辅助细胞系中生长的，辅助细胞系就是包含编码对复制是不可缺少的病毒功能的核酸的细胞系至于逆转录病毒载体的宿主，可以使用ψCRE，ψCRIP，MLV等等至于腺病毒载体和腺伴随病毒载体的宿主，可以使用来源于人胚肾的HEK293细胞等等在动物细胞中导入病毒载体可以通过磷酸钙方法，或为本领域技术人员所知的其它方法进行如下培养得到的转化体以制备重组基因载体大肠杆菌转化体的培养可以使用pH值为5到8的液体培养基进行，液体培养基包含碳源，氮源，无机物质及其它为其生长所需的物质培养通常在15到43℃进行大约8到24小时培养之后，可以通过常规的DNA分离以及纯化方法得到本发明的重组基因载体动物细胞转化体的培养可以使用诸如199培养基，MEM培养基，以及DMEM培养基之类的培养基来进行，这种培养基包含大约5到20％胎牛血清优选培养基的pH值为大约6到8培养通常在30到40℃下进行大约18到60小时包含本发明的重组基因载体的病毒颗粒被释放到培养物的上清液中通过本领域技术人员已知的方法例如氯化铯离心方法，聚乙二醇沉淀法，以及过滤浓缩法，进行病毒颗粒的浓缩和纯化，由此得到本发明的重组基因载体III.LIP的控制本发明提供了降低，减少或抑制宿主细胞中LIP的转录和/或翻译的组合物和方法这种组合物包括能够降低、减少或抑制宿主细胞中LIP的转录的反义核酸，寡核苷酸，即寡核苷酸引诱物(decoy)，核酶，以及干扰RNAs(iRNAs)相应地本发明提供了用于降低或抑制细胞中LIP的转录和/或翻译的方法，包括使细胞与能够降低、减少或抑制细胞中LIP的转录的反义核酸，寡核苷酸，核酶和/或干扰RNAs(iRNAs)接触LIP的转录和翻译是通过本领域技术人员已知的方法，包括PCR和RNA印迹技术测定的本发明提供了约10到约100核苷酸长度的寡核苷酸，包括邻近C/EBPβ(CCAAT/增强子结合蛋白β)基因的核苷酸序列中的LIP(转录抑制因子蛋白)的起始密码子ATG的核苷酸序列，或它们的互补序列在某些例子中，寡核苷酸能够降低，减少或抑制细胞中的LIP功能在某些例子，寡核苷酸的长度为约10到80个核苷酸，在其它例子中，寡核苷酸的长度为约15到约50个核苷酸；在其它例子中，寡核苷酸的长度为约20到约80个核苷酸；在其它例子中，寡核苷酸的长度为约15到约40个核苷酸；在其它例子中，寡核苷酸的长度为约15到约30个核苷酸；在其它例子中，寡核苷酸的长度为约15到约25个核苷酸在其它例子中，寡核苷酸为至少约10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或至少约20个核苷酸的长度在其它例子中，寡核苷酸为至多约30，40，50，60，70，或80个核苷酸的长度包括邻近LIP(转录抑制因子蛋白)的起始密码子ATG的核苷酸序列的寡核苷酸被用作引诱物寡核苷酸以降低，减少或抑制LIP表达此外，具有与以上核苷酸序列互补的序列的寡核苷酸被用作反义寡核苷酸，以降低，减少或抑制LIP表达例如，包括SEQ ID NO.1的第427个核酸G到第489个核酸C(63个碱基)的序列的核酸，或其互补链，以及包括SEQ ID NO3第565个核酸G到第627个核酸(63个碱基)的序列的核酸，或其互补链，是可以从其上设计寡核苷酸引诱物和/或反义核酸的区域将作为寡核苷酸引诱物或反义核酸的寡核苷酸(DNA或RNA)插入到载体中，并转染到细胞中以降低或减少细胞中LIP的表达水平在没有理论限制的情况下，LIP的启动子或其类似物与寡核苷酸结合本发明的寡核苷酸可单独使用，或与本发明的重组体一起使用，或与其它治疗物一起使用在如上所述的两种情况中，LIP的表达被降低、减少或抑制，结果提高了LAP(转录激活因子)与LIP(转录抑制因子蛋白)的表达水平的比例，两者都是从C/EBPβ(CCAAT/增强子结合蛋白β)基因表达的如本文的实施例所证明，在癌症的体内模型中降低了LIP的表达，由此增加LAP与LIP的表达的比例，可得到与对照组相比较减少了癌症形成和转移的结果因此，对细胞给予或导入能够降低、减少或抑制LIP表达的寡核苷酸或反义核酸或iRNA，是与减少与癌症有关的症状包括例如，癌症形成和/或转移以及减缓肿瘤生长有相互关系的干扰RNA(iRNA)具有序列特异的，转录后基因沉默的机制，转录后的基因沉默由与该基因同源的双链RNAs(dsRNA)被抑制而产生见Sharp，P.(2001，Genes&Development，15485490)由mRNA加上其互补链组成的dsRNA形成RNA-RNA双链体此双链体区域通过类RNAseIII的酶降解，且mRNA不能被翻译当在细胞中导入时，短dsRNA(小干扰RNA或siRNA)在降解包含短dsRNA序列的mRNAs中也是有效的在没有理论的限制的情况下，有证据表明在细胞中存在细胞RNA降解体系，可能受dsRNA刺激，作为防止病毒或转座子RNAs侵入的一种手段本发明包括干扰RNA序列，该序列包含邻近LIP的起始密码子ATG的，且能够降低、减少和/或抑制LIP表达的核苷酸序列在某些例子中，iRNA被设计成能导向于LIP的起始ATG，其相应于核苷酸序列SEQ ID NOl中第457到459个核苷酸，以及相应于核苷酸序列SEQ ID NO3中的第595到597个核苷酸设计iRNAs的方法是本领域已知的本发明的iRNA可单独使用，或与本发明的重组载体一起使用，和/或与具有LAP活性的突变型LAP多肽一起使用，和/或与其它治疗一起使用做为选择，本发明包括能降低、减少、停止或抑制LIP转录，以及在某些例子中，使LAP不能有效表达的核酶的用途能够降低，减少或抑制LIP的核酶可单独使用，或与本发明的重组载体一起使用，和/或与具有LAP活性的突变型LAP多肽一起使用，和/或与其它治疗一起使用用于筛选能够降低、减少和/或抑制LIP表达的特定寡核苷酸，反义核酸以及iRNAs的试验是本领域已知的和在此描述的简要地，在此的实施例中公开的试验中，使g6乳腺癌细胞系与试样例如本发明的重组载体、寡核苷酸、反义或iRNA接触，并组织学检验形态和细胞粘着在与能够降低、减少和/或抑制LIP表达的重组载体，寡核苷酸，反义或干扰RNAs(iRNAs)接触的细胞中，其形态将类似于正常的非癌的细胞还可以将这种细胞导入到先天裸鼠中，测定癌症形成能力和癌症的转移可使用重组载体，例如包含部分或全部CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)基因的核苷酸序列的病毒载体作为对照组，其中所述部分或全部C/EBPβ基因包含邻近LIP转录抑制因子蛋白的起始密码子ATG的核酸，且其中核苷酸序列包含邻近所述LIP转录抑制因子蛋白的起始密码子ATG的突变在本文的实施例中描述的重组载体可在筛选试验中作为对照组使用组合物以及其用途本发明包括包含本发明的重组载体，重组病毒载体或病毒颗粒，寡核苷酸，反义RNA或或iRNA的组合物在某些例子中，组合物也可以进一步地包含药学可接受的赋形剂或载体，或缓冲液在某些例子中，这种组合物用于治疗和/或改善相关于细胞或个体中LAP与LIP的比例的疾病或状况，例如癌症和/或肿瘤生长的症状的方法在某些例子中，在此公开的组合物显示出溶瘤活性在此使用的术语“治疗”是指改善，提高，减少，或稳定化一或多种疾病或不希望的状况例如癌症的症状，以及减缓一或多种疾病或不希望的状况的症状的进展本发明的组合物可以或不能与其它治疗程式结合使用，包括但不局限于本领域已知的化疗剂，辐射和/或抗体在某些例子中，本发明的组合物是与部分或全部上皮形成素联合用药的在此使用的术语“恶性的”，“恶性的细胞“，“肿瘤”，“肿瘤细胞”，“癌症”以及“癌细胞”，(可互换地使用)指的是显示相对自发生长的细胞，以致这些细胞显示出以细胞增殖显著失控为特征的异常的生长表现型术语“肿瘤”包括转移性的以及非转移性肿瘤在此使用的“溶瘤活性”是指对肿瘤和/或恶性的和/或癌细胞生长的抑制作用或压制作用；肿瘤和/或恶性的和/或癌细胞生长的退行作用；肿瘤和/或恶性的和/或癌细胞的细胞死亡，或预防其它肿瘤和/或恶性的和/或癌细胞的产生在此使用的“抑制或压制肿瘤生长”是指在给予包含VSV的组合物、或本发明的方法的情况下减少肿瘤的生长速度，使肿瘤生长完全停止，导致已存在的肿瘤的大小的退行作用，根除肿瘤的存在和/或阻止其它肿瘤的发生“抑制”肿瘤生长表示当与没有与本发明的组合物接触的生长相比较时生长的状态被衰减肿瘤细胞生长可以通过本领域已知的任何方法评价，包括但不限于测定肿瘤大小，使用3H-胸苷掺入试验确定肿瘤细胞是否增殖，或肿瘤细胞计数“抑制”肿瘤和/或恶性的和/或癌细胞生长是指下面的任何一种或所有状态减缓，延迟，以及停止肿瘤生长，以及肿瘤收缩肿瘤和/或恶性的和/或癌性的细胞的“延迟进展”是指推迟，阻碍，减缓，延迟，稳定化，和/或延缓疾病的进展该延迟根据疾病的历史和/或被治疗的个体可以是持续时间本发明包括使用本发明的重组载体或能够降低、减少和/或抑制LIP表达，特别是与在此描述的恶性细胞和/或肿瘤细胞有关的LIP表达的寡核苷酸、反义核酸或iRNA来增加LAP对LIP的比例的组合物和方法适于该治疗的个体是被认为具有发生癌症、肿瘤或恶性细胞的危险的个体，例如先前有过包括癌症、恶性的细胞或肿瘤细胞的疾病的那些个体，或有过这种癌症、肿瘤细胞或恶性的细胞家族史的那些个体将根据可估计的临床参数例如血清学指征和细胞、组织或肿瘤活检物的组织学检查来确定给予本发明的组合物的适合性通常，可以给予在药学可接受的赋形剂中的组合物相应地，本发明提供了抑制癌症或肿瘤生长的方法，包括使癌症或肿瘤细胞与本发明的重组载体或突变型LAP多肽，或核酸构建物，例如寡核苷酸或反义核酸或iRNA接触的步骤，从而增加肿瘤或细胞中的LAP与LIP的比例在其它例子中，这种组合物被用于筛选调节宿主细胞中LAP与LIP的比例的试剂的方法在某些例子中，用筛选方法来确定降低，减少或抑制宿主细胞中LIP表达的试剂在其它例子中，用筛选方法来确定增加宿主细胞中LAP的表达或增加宿主细胞中LAP的生物活性的试剂在其它例子中，试剂或重组载体或核酸构建物具有溶瘤活性，如在此处公开的筛选试验中所测定然而在其它例子中，本发明提供了确定癌细胞，恶性的细胞或肿瘤细胞是否对用本发明的组合物治疗敏感的方法，该方法包括(a)将包含癌，恶性的或肿瘤细胞样品分成第一部分和第二部分；(b)用组合物，例如病毒载体或包含部分或全部CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)基因的核苷酸序列的重组载体，或能够减少LIP转录的寡核苷酸或反义核酸或iRNA，或一种通过此处公开的筛选法确定的试剂处理第一部分，其中所述部分或全部C/EBPβ基因包含邻近LIP转录抑制因子蛋白的起始密码子ATG的区域，且其中核苷酸序列包含LIP转录抑制因子蛋白的起始密码子ATG中的突变；以及(c)确定第一部分中的死细胞百分比是否高于第二部分，其中如果第一部分的死细胞百分比高于第二部分，则癌，恶性或肿瘤细胞对用组合物治疗是敏感的在某些例子中，本发明进一步涉及用于基因治疗的试剂，即涉及向细胞中给予或递送的试剂，其中该试剂包含重组基因载体，该重组基因载体包含部分或全部CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)基因，其中C/EBPβ(CCAAT/增强子结合蛋白β)的核苷酸序列中的LIP(转录抑制因子蛋白)的起始密码子ATG被另一个密码子所取代，其中取代密码子不是TTG，或该试剂包含本发明的寡核苷酸或反义核酸或iRNA这种组合物可被用于治疗和/或改善癌症的症状的方法，例如，抑制或减缓肿瘤生长在某些例子中，当局部地给予肿瘤细胞或恶性的细胞时，以及当给予肿瘤或恶性的细胞远端时，例如通过静脉内给药或通过其它途径给药，这样的试剂将具有溶瘤活性在一些例子中，本发明的重组载体或突变型LAP多肽，或核酸构建物，例如寡核苷酸或反义核酸或iRNA是离体进行，被处理的细胞在处理后返回到个体中要被治疗的癌症的例子包括，但不局限于，恶性黑色素瘤，恶性淋巴瘤，消化器官癌，肺癌，食道癌，胃癌，大肠癌，直肠癌，结肠癌，输尿管肿瘤，胆囊癌，胆管癌，胆道癌，乳腺癌，肝癌，胰腺癌，睾丸肿瘤，上颌癌，舌癌，唇癌，口腔癌，咽癌，喉癌，卵巢癌，子宫癌，前列腺癌，甲状腺癌，脑肿瘤，卡波西肉瘤，血管瘤，白血病，瓦凯氏病，成神经细胞瘤，成视网膜细胞瘤，骨髓瘤，膀胱肿瘤，肉瘤，骨肉瘤，肌肉肿瘤，皮肤癌，基细胞癌，皮肤附器癌，转移皮肤癌，以及皮肤黑素瘤优选被治疗的癌症的例子包括乳腺癌和肝癌用于本发明的方法的本发明的组合物可以通过将重组基因载体，例如病毒载体，(或寡核苷酸或反义核酸或iRNA)作为活性组分与基体材料混合制备此外，当重组载体被整合到病毒载体中时，用于基因治疗的组合物，即递送至细胞中的试剂可以通过制备包含重组体DNAs的病毒颗粒以及将它们与基体材料混合制备用于注射的任何通常的基体材料可被用作基因治疗用试剂的基体材料，且它们的例子包括蒸馏水，盐溶液例如氯化钠或氯化钠和无机盐的混合物，甘露糖醇、乳糖、右旋糖酐、葡萄糖溶液等等，甘氨酸、精氨酸等的氨基酸溶液，葡萄糖溶液与有机酸溶液或盐溶液的混合溶液做为选择，除这些基体材料之外，根据本领域技术人员所知的常规方法，注射剂可以通过使用佐剂例如渗透压调节剂、酸碱度调节剂、植物油或表面活性剂制成溶液、悬浮液、或分散液形式这些注射剂还可以通过例如粉末化和冷冻干燥等操作制备，以作为在使用之前被溶解的制剂此外，本发明的试剂是被包封在脂质体或其它物质中的，如果必要的话，仅仅在给药前被包封，且因此该试剂可被用于治疗和/或改善癌症的症状作为在活生物体中导入本发明的组合物的方法，下面的方法是已知的基因的化学或物理导入法(转染法)；以及使用病毒的方法(转导法)用物理手段将基因导入活生物体的方法(转染法)的例子包括体内电穿孔法方法以及基因枪方法体内电穿孔法是一种通过对活体组织直接施加电压脉冲而在活体组织中导入DNAs的方法将DNAs溶解到适宜的缓冲溶液(例如1mM Tris，25uM EDTA，150mM NaCl)中，并将得到的溶液使用玻璃电极注入到组织中在基因枪方法中，将与金颗粒连接的DNAs加速并导入到细胞中在大气压下，Biorad研制的手持型Helios枪能够以简单的方法通过体内方法高效率地将基因直接导入到个体中见Kuo C.F等人2002，Methods of Mol.Med.69137-147基因枪方法具有下面的优点DNA分解体系例如核内体是无效的，基因可以被导入到任何类型的组织中，且基因可以被导入到特异性部位用化学手段将基因导入活生物体的方法的例子包括脂质体方法，膜融合蛋白-脂质体方法，以及脂转染方法Nidome T和Huang L，2002，Gene Ther241647-1652脂质体是一种由极性脂类例如磷脂在水相中形成的泡囊在形成脂质体的过程中，导入进脂质体的基因被包装在膜中此外，可以进行投射治疗，其中将一种特异性蛋白质化学结合到脂质体中，并将得到的产物在目的细胞上浓缩，即靶向递送到目的细胞中在膜融合蛋白-脂质体方法中，将一种病毒被膜与脂质体结合，该病毒被膜是各种病毒进入细胞中的一种进入手段例如，可使用仙台病毒的膜融合蛋白，其具有在中性条件下的高融合能力，且通过细胞融合可制备多核细胞脂转染方法是一种使用阳离子脂类的方法人们认为阳离子脂类可中和被导入的基因的负电荷，且阳离子类脂将同时中和质膜表面的负电荷，并由于脂类的疏水性而与膜溶合，由此缠绕DNAs阳离子脂类的具体商业产品的例子包括脂质转染蛋白，脂转染胺，和转染胺(transfectam)这些阳离子脂类被认为具有类脂质体结构，且导入的基因被结合在脂质体表面转导是一种使用病毒在活生物体中导入基因的方法，该方法能够高效率地导入基因具体地，可使用逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺伴随病毒载体等等药学可接受的载体是本领域熟知的，包括但不局限于盐水，缓冲盐水，葡萄糖，水，甘油，无菌等渗缓冲水溶液，以及它们的组合这样的一种可接受的载体的例子是包含一或多种稳定剂例如稳定化的水解蛋白质、乳糖等等的一种生理学平衡培养基载体优选是无菌的制剂将适合给药的方式如果需要，组合物还可以包含少量的湿润或乳化剂，或pH缓冲剂组合物可以是液体溶液，悬浮液，乳剂，片剂，药丸，胶囊，持续释放制剂，或粉剂口服制剂可以包括标准载体例如药物级的甘露糖醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁，等等通常，组分是单独地或在单位剂型中混合地提供的，例如以在标明活性剂的量的密闭容器例如安瓿或sachette中的干燥冻干粉剂或无水的浓缩物被提供的当组合物通过注射给药时，可以提供无菌稀释剂的安瓿，以使组分可以在给药之前混合应用于制剂中的组合物或组合物中试剂的准确剂量将取决于给药途径，和将被治疗的细胞或个体例如人的性质，且应该根据医师的判断和根据标准临床技术的环境而决定在特定制剂中使用的试剂的精确的量不是关键的，条件是给出为产生所需要的活性，例如溶瘤活性所必需的组合物的最低量预期的剂量范围为少至约10毫克，多至1毫克或以上的量本发明的载体或病毒颗粒或核酸组合物的有效剂量还可以由动物模型测试系统得到的剂量反应曲线外推得到用于本发明的基因治疗的试剂剂量可根据患者的年龄，性别，或患者健康状况，或给药的途径或时间，药剂的剂型而改变通常，用于成年人的重组载体的日剂量在约1μg/kg到1000mg/kg的范围，且在其它例子中，为约10μg/kg到100mg/kg的范围给药的时间没有特别限制如果以病毒的形式给药，为约102直到约107p.f.u.，在其它例子中，为约103直到约106p.f.u.，以及在其它例子中，可以给予约104直到约105p.f.u.如果以多核苷酸构建物，例如，重组载体(即不是包装为病毒)给药，可以给予约0.01μg到约100μg的本发明的构建物，在其它例子中，给予0.1μg到约500μg，以及在其它例子中，可以给予约0.5μg到约200μg可以同时或依次给予一种以上的组合物在某些例子中，本发明组合物是与部分或全部上皮形成素联合给药的给药是典型地在监测反应下周期地给药给药可以是例如，肿瘤内，静脉内或腹膜内给药许多方法可能用来在个体中给予或导入本发明的组合物，例如病毒载体或病毒颗粒，这些方法包括但不局限于口服，皮内，肌肉内，腹膜内，静脉内，肿瘤内，皮下，以及鼻内的途径组合物所给予的个体为灵长类，或在其它例子中，为哺乳动物，或在其它例子中为人，但还可以是非人的哺乳动物且包括但不局限于牛，马，羊，猪，猫，狗，仓鼠，小鼠以及大鼠对于本发明的试剂的给药形式，可以使用常规的全身性给药例如静脉内或动脉内给药，或可以使用对致癌病变或潜在的转移位点的局部给药例如局部注射或口服此外，对于本发明的试剂的给药，还可以使用与导管技术，基因导入技术，外科手术技术等等相结合的给药形式而且，上皮形成素已知具有增加C/EBPβ的表达的功能(Hirai等人，Journalof Cell Biology，Vol.153，No.4，2001，785-794)因此，本发明的基因治疗剂可以进一步通过其与具有上皮形成素活性的蛋白或肽联合使用来提高其治疗的效果用途改进LAP(转录激活因子)/LIP(转录抑制因子蛋白)的表达水平的比例通过使用本发明的组合物，例如包含在此描述的重组基因载体或能够降低、减少和/或抑制LIP表达、或能够增加LAP表达的寡核苷酸或反义核酸或iRNA的药物组合物，在细胞中表达的LAP(转录激活因子)活性与LIP(转录抑制因子蛋白)活性的表达水平的比例可以被改变相应地，本发明提供了改进细胞中LAP(转录激活因子)与LIP(转录抑制因子蛋白)表达水平的比例的方法，包含使细胞与在此描述的重组载体或在此描述的寡核苷酸或反义核酸或iRNA在适宜条件下接触该方法也将包括在本发明的范围内特别地，根据本发明，本发明的组合物的抗癌活性，或溶瘤活性，或例如，肿瘤抑制活性可以随LAP(转录激活因子)与LIP(转录抑制因子蛋白)表达水平的比例而改变，以便增加LAP(转录激活因子)与LIP(转录抑制因子蛋白)的比例(LAP表达/LIP表达)即，本发明范围包括治疗和/或改善与癌症有关的症状的方法，例如抑制肿瘤生长，该方法包括在癌症患者中将异常的LAP(转录激活因子)/LIP(转录抑制因子蛋白)表达水平的比例调回至正常比值的步骤筛选抗癌剂的方法本发明进一步涉及使用LAP和LIP的表达水平的比例作为指标筛选试剂的方法，LAP(转录激活因子)和LIP(转录抑制因子蛋白)都是由C/EBPβ(CCAAT/增强子结合蛋白β)基因表达的通过本发明的筛选方法，可以选择出可以将癌症患者中的异常的LAP(转录激活因子)/LIP(转录抑制因子蛋白)的表达水平比例调回至正常比值的物质这样选择出的可以将癌症患者中的异常的LAP(转录激活因子)/LIP(转录抑制因子蛋白)的表达水平比例调回至正常比值的物质可有效用于治疗和/或改善癌症的症状，例如，减缓肿瘤的生长可以通过本领域技术人员已知的常规方法，例如RNA印迹方法，RT-PCR方法，或蛋白印迹法确定LAP(转录激活因子)和LIP(转录抑制因子蛋白)的表达水平的比例，LAP和LIP都是由C/EBPβ(CCAAT/增强子结合蛋白β)基因表达的用于在这些方法中检测LAP和LIP的探针，引物或抗体可以由本领域技术人员根据常规方法使用在本说明书中描述的LAP和LIP的核苷酸序列和氨基酸序列得到或制备用于本发明的筛选方法的试验物质的种类没有特别限制，且可使用任何物质试验物质可以为寡核苷酸，反义核酸，iRNA，低分子量合成化合物或存在于天然存在的物质的提取物中的化合物，或可能为化合物库，噬菌体展示库，或组合库在某些例子中，试验物质是低分子量化合物，且优选低分子量化合物的化合物库化合物库的构建物是本领域技术人员已知的，还可以使用可商购的化合物库本发明将提供下面的实施例详细描述，但本发明的范围不限制在这些实施例用Nhe I和Bam HI处理Promegap TARGET(PROMEGA)载体，并将上述(a)制备的cDNA使用连接试剂盒(TAKARA)插入到该载体中用PtetLAP作为模板，并使用下面的引物(引物3ATA TGC TAG CGG CCGGCT TCC CGT TCG CCC TGC GCG(SEQ ID NO7)；和引物4ATA TGC TAGCAG TGA CCC GCC GAG GCC AGC AGC GGC(SEQ ID NO8))和LATag(TAKARA)来构建LIP区域cDNA，接着用Nhe I处理，以使它们的末端变成Nhe I位点将先前在大肠杆菌中增殖和纯化的以上(b)的质粒，用Nhe I裂解，并将末端用碱性磷酸酶(TAKARA BAP)去磷酸化使用Takara连接试剂盒将以上的(c)的DNA插入到其中通过测定序列，证实在质粒LAP内的LIP翻译起始密码子ATG被CGC取代(导入突变的LAP的证实)切下pTet-接头载体(GBCO BRL)的Eco RI位点并用BAP处理之后，将由以上(e)的DNA中切除的包括导入突变的LAP的Eco RI切割片段插入到其中(pTet-接头突变的导入型LAP的构建)实施例2细胞培养和基因导入将g6细胞(乳腺癌细胞系)(Desprez等人，1993，Mol.Cell Differ.199-110Roskelley等人，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91，12378-12382；Hirai等人，1998，J.Cell.Biol.140159-169)在生长培养基(加入5％FBS[Hyclone]，5μg/ml胰岛素[Sigma-Aldrich]和50μg/ml庆大霉素的DME/F12[GIBCO BRL])中维持用实施例1中得到的载体(5μg)，pTet.tTAK载体(Life Technologies)(5μg)，和pSV40neo(Schmidhauser等人，1992，Mol.Biol.Cell.3699-709)(0.5μg)使用质转染胺(Life Technologies)根据该厂家提供的说明转染g6细胞(5×105)在连续存在的四环素中，选择耐新霉素的克隆，而后在有或没有5μg/ml四环素的存在下通过蛋白质印迹法分析LAP的表达通过此方法分离g6LAP，g6LAP′，和g6LAP″细胞系实施例3由导入突变的LAP引起的细胞的形态改变g6细胞和g6LAP细胞的形态见