专利名称：一种具有抗氧化能力的纳米胶原制备方法和用途的制作方法胶原蛋白是由三条肽链拧成的螺旋形纤维状蛋白质，是一种糖蛋白，分子含糖、及大量甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等，存在所有多细胞动物体内，是体内含量最多的一类蛋白质。在人体中约占总蛋白质含量的四分之一，存在于几乎所有组织中，是一种细胞外蛋白质，以不溶纤维形式存在，对动物和人体皮肤、血管、骨骼、筋骨、软骨的形成十分重要，是结缔组织的重要物质，是决定结缔组织韧性的主要因素，在动物细胞中扮演结合组织的角色。 随着年龄的增长，人体在25岁之后，体内的胶原蛋白就开始逐渐流失，尤其是女性。因此维持骨骼健康及皮肤弹性就需要及时地补充胶原蛋白。胶原蛋白中蕴藏着多种生物活性肽， 如抑制血管紧张素转化酶活性、抑制血小板凝集活性、抗氧化活性、抗肿瘤活性等。目前我国禽爪深加工企业较少，大部分企业都是进行初级加工就上市销售，有的企业甚至不加工就上市销售，存在着深加工滞后，科技含量少，现代化程度低下等突出问题，已严重制约禽爪产品附加值的提升。目前，国外很多文献报道了关于禽爪胶原的生理功能一些研究，初步认识到了其在提高人体骨骼强度、保护胃粘膜、抑制血压上升、抗衰老和促进皮肤胶原代谢等方面的作用，报道了禽爪胶原不仅在食品、化妆品上有广泛的应用前景，而且还具有预防高血压，防治风湿性关节炎等医学上的应用。因此，利用禽爪提取胶原蛋白作为原料应用到食品、化妆品、药品上，具有重要的科学意义和巨大的应用与开发价值。现有技术的酶解工艺制备胶原蛋白肽的方法中，主要缺点是酶解过程难以控制， 制备的胶原蛋白肽的分子量分布较广且分子量较大，不易被吸收；活性不高，且产品呈明显的苦味。因此，本领域迫切需要提供一种分子量主要分布在小分子量范围的胶原蛋白肽， 并且需要提供活性高，滋味易被接受的胶原蛋白。
本发明旨在提供一种纳米胶原及其制备方法和用途。在本发明的第一方面，提供了一种纳米胶原的制备方法，所述的方法包括步骤(1)预处理将禽爪料和水在70_90°C混合10-30分钟，得到禽爪料液；(2)酶解将40_50°C的禽爪料液和蛋白酶I混合1-2小时后，在50_60°C再与风味蛋白酶混合2-4小时，得到酶解液；(3)后处理将酶解液经三相离心、微滤、超滤、和大孔吸附树脂脱盐，得到纳米胶原原料；和(4)将纳米胶原原料用环状糊精包埋，得到纳米胶原。在另一优选例中，步骤(1)中使用的水的重量是禽爪料的3-5倍。在另一优选例中，步骤(2)中所述蛋白酶I由木瓜蛋白酶和复合蛋白酶组成，所述蛋白酶I的用量是禽爪料的重量的0. 2%-0. 8%;更佳地，所使用的木瓜蛋白酶与复合蛋白酶的量相同。在另一优选例中，步骤(2)中所述风味蛋白酶的用量是禽爪料的重量的 0. 2% -0. 8%。在本发明的一个优选例中，所述的方法包括步骤(1)预处理将绞碎的禽爪和水在70-90°C混合10-30分钟，得到禽爪料液；使用的水的重量是绞碎的禽爪的3-5倍；(2)酶解将40_50°C的禽爪料液和蛋白酶I混合1_2小时后，在50_60°C再与风味蛋白酶混合2-4小时，得到酶解液；所述蛋白酶I由木瓜蛋白酶和复合蛋白酶组成，所述蛋白酶I的用量是绞碎的禽爪的重量的0. 2% -0. 8% ；所述风味蛋白酶的用量是绞碎的禽爪的重量的0.2% -0.8% ；(3)后处理将酶解液经三相离心、微滤、超滤、和大孔吸附树脂脱盐，得到纳米胶原原料；和(4)将纳米胶原原料用β -⑶包埋，得到纳米胶原。在本发明的第二方面，提供了一种通过如上所述的本发明提供的制备方法制备得到的纳米胶原；以所述纳米胶原的总量计，其中分子量< IOOODa的纳米胶原的占80% ；所述纳米胶原的粒径为1. 0-1. 5nm。在本发明的第三方面，提供了一种如上所述的本发明提供的纳米胶原的用途，用作或用于制备抗氧化的组合物；所述的组合物包括药物组合物和食品组合物。据此，本发明提供了一种分子量主要分布在小分子量范围的胶原蛋白肽，并且需要提供活性高，滋味易被接受的胶原蛋白。图1是实施例1提供的纳米胶原寡肽分子量分布图。图2是实施例1提供的纳米胶原寡肽粒径分布图。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。本发明的主要优点在于1、首次获得纳米级的胶原。2、本发明提供的纳米胶原活性高，无明显苦味。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按
重量计。本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在 100毫升的溶液中溶质的重量。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。下述实施例中采用的禽爪购自国内禽肉加工厂，蛋白酶均购于丹麦诺维信生物技术有限公司。下述实施例中涉及的测定方法如下(1)清除DPPH自由基方法取2mL样品溶液，加入2mL 1 X 10、ol/LDPPH ·溶液， 混勻后在室温下避光反应20min，4000r/min离心lOmin，以95 %乙醇调零，在517nm处测其吸光度Ai ；同时测定2mL 95%乙醇与2mL样品溶液混合后的吸光度Aj以及2mL DPPH溶液与2mL去离子水混合后的吸光度AO。以维生素E作阳性对照。清除率(%) = [I-(Ai-Aj)/AO] X 100%(2)清除超氧阴离子方法在20ml试管中加入9ml pH值为8. 2Tris_HCl缓冲液，于251恒温水浴中放置201^11，用微量注射器注入4(^1 25°C预热的邻苯三酚溶液 G5mmol/L邻苯三酚加入lOmmol/L HCl中)，立即混勻并倒入Icm比色杯中，于温度25°C下每隔30s测定一次A420nm，自氧化速率控制在0. 06mg/(ml · min)。邻苯三酚自氧化3mi η 后，迅速滴加1滴Vc，立即混勻，室温下放置5min后测定A420nm，即AO，可表示邻苯三酚自氧化速率。加入抑制剂后，它们可以清除邻苯三酚自氧化产生的超氧阴离子，从而使邻苯三酚自氧化速率降低。在上述Tris-HCl缓冲液中预先加入样品和0.2mg/ml Vc 1ml，再按上述方法测定邻苯三酚的自氧化速率，得到Al，同时不加邻苯三酚溶液测得A2。清除率(％) = (A空白一 A样品)/A空白X 100%(3)清除羟基自由基方法取5. 6m ITri s-HCL缓冲液，加入0. 2ml样品液混勻后，在25°C水浴锅中保温lOmin，取出后立即加入在25°C预热过的连苯三酚(某一浓度)0. 2ml (调零用0. Olmol/LHCL代替连苯三酚溶液)，迅速摇勻，倒入比色皿(光径Icm)， 每隔30s测A信一次.平行实验三次，得三组数据取平均值，根据所测数值绘制t-A值曲线， 计算清除率(空白值用相应溶剂代替样品)清除率(％) = [1-(A1-A2)/A0] X100%
(4)测定纳米胶原粒径分布的方法见参考文献“马尔文激光粒度分析仪粒度检测方法及其优化研究”中国粉体技术，2002年10月第8卷第5期》实施例11)将出冷库的冷冻禽爪进行融冰解冻，用清水将禽爪清洗干净，浙干。用温水将禽爪漂洗干净，清洗后的禽爪用组织捣碎机进行捣碎。捣碎后的禽爪料移入酶解罐。2)加入3倍量的水至酶解罐，升温至70°C保持10分钟3)冷却至40_50°C，调节pH至6，加入禽爪量0. 1 %的papain木瓜蛋白酶和 0. 的protamex复合蛋白酶；水解1小时后，调节温度至50-60°C ；再按禽爪量0. 2%加入Flavourzyme风味蛋白酶，继续水解1小时结束，水解时缓慢搅拌，水解结束后升温至 75-10(TC保持10-30分钟，酶解液经过三相离心机离心去除上层油脂、下层骨渣后得到粗提液。4)经离心过滤后的酶解液降温至35_40°C加入1 % (以酶解液中固形物重量计) 活性炭进行脱色，搅拌30分钟，然后再分别利用1. 2 μ m，0. 45 μ m微孔滤膜进行板框过滤， 得到澄清透明精滤液。5)将精滤液通过分子量3000Da的超滤膜对胶原寡肽溶液进行过滤，操作压力 0. 1 IMPa，操作温度25°C，得到超滤液。6)将超滤液采用食品级DA201-CII大孔吸附树脂对滤液进行脱盐，步骤在150r/ min转速下，加入超滤液，搅拌2小时后，加入去离子水，洗至电导率小于30 μ s/cm,加入 70%乙醇洗脱。静态脱盐，树脂吸附量300mg/g干树脂，脱盐率为85. 3%。7)测定步骤(6)所得的纳米胶原的清除DPPH自由基、超氧阴离子和羟基自由基的能力，其 IC50 分别为 14. 26mg/ml,20. 52mg/ml,30. 16mg/ml。实施例21)将出冷库的冷冻禽爪进行融冰解冻，用清水将禽爪清洗干净，浙干。用温水将禽爪漂洗干净，清洗后的禽爪用组织捣碎机进行捣碎。捣碎后的禽爪料移入酶解罐。2)加入4倍量的水至酶解罐，升温至80°C保持20分钟3)冷却至40_50°C，调节pH至6. 5，加入禽爪量0.2%的papain木瓜蛋白酶和 0. 2%的protamex复合蛋白酶；水解2小时后，调节温度至50_60°C ；再按禽爪量0. 3%加入Flavourzyme风味蛋白酶，继续水解2小时结束，水解时缓慢搅拌，水解结束后升温至 75-10(TC保持10-30分钟，酶解液经过三相离心机离心去除上层油脂、下层骨渣后得到粗提液。4)经离心过滤后的酶解液降温至35-40°C加入2% (以酶解液中固形物的重量计)活性炭进行脱色，搅拌60分钟，然后再分别利用1. 2 μ m，0. 45 μ m微孔滤膜进行板框过滤，得到澄清透明精滤液。5)将精滤液通过分子量3000Da的超滤膜对胶原寡肽溶液进行过滤，操作压力 0. 1 IMPa，操作温度25°C，得到超滤液。6)将超滤液采用食品级DA201 CII大孔吸附树脂对滤液进行脱盐，步骤在 200r/min转速下，加入超滤液，搅拌3小时后，加入去离子水，洗至电导率小于30 μ s/cm,加入70%乙醇洗脱。静态脱盐，树脂吸附量300mg/g干树脂，脱盐率为87. 1%。7)测定步骤(6)所得的纳米胶原的清除DPPH自由基、超氧阴离子和羟基自由基的能力，其 IC5O 分别为 I3· 52mg/ml,21. 32mg/ml,28. 13mg/mL·实施例1、2得到的纳米胶原寡肽粉末通过凝胶渗透色谱来测定禽爪胶原寡肽的分子量分布相似，具体的分子量分布如表1所示表1纳米胶原分子量分布表


本发明公开了一种纳米胶原及其制备方法和用途。所述的纳米胶原的制备方法包括步骤(1)预处理将禽爪料和水在70-90℃混合10-30分钟，得到禽爪料液；(2)酶解将40-50℃的禽爪料液和蛋白酶I混合1-2小时后，在50-60℃再与风味蛋白酶混合2-4小时，得到酶解液；(3)后处理将酶解液经三相离心、微滤、超滤、和大孔吸附树脂脱盐，得到纳米胶原原料；和(4)将纳米胶原原料用β-CD包埋，得到纳米胶原。