专利名称：一种酸性耐热异淀粉酶基因工程菌及其应用的制作方法异淀粉酶(E. C. 3. 2. 1. 68)是一类能够水解α _1，6葡萄糖苷键的淀粉脱支酶，该酶能够水解糖原、支链淀粉、α-极限糊精和β-极限糊精，水解产物为线性麦芽寡糖。尽管植物和微生物都能够产生异淀粉酶，但是由于微生物具有生长迅速、操作简单及成本低廉等优点，所以商业化的异淀粉酶一般是由微生物生产的。异淀粉酶产生菌株研究的最多的是假单胞菌O^eudomonas. sp.)，其次是其它细菌和真菌。不同来源的异淀粉酶具有不同的底物特异性、水解产物、最适PH、最适温度等。异淀粉酶主要用于水解淀粉生产食品添加剂，如高葡萄糖浆、麦芽糖、海藻糖、环糊精和抗性淀粉等。由于异淀粉酶在淀粉水解中的巨大应用潜力，国内外都对异淀粉酶进行了大量的研究。Harada等研究发现I^seudomonas. sp.来源的异淀粉酶的最适pH在5到6之间。 Olemposka-Beer等报道了 Pseudomonas amyloderaosa来源的异淀粉酶最适pH在3到5之间。而芽孢杆菌来源的异淀粉酶的最适PH差异较大，有的最适pH是酸性的在PH 5.0，有的是碱性的PH9.0.酵母来源的异淀粉酶最适pH—般在6. O到7. O。在热稳定性方面，不同来源的异淀粉酶也有较大差异。酵母来源的异淀粉酶热稳定性较差，而假单胞菌来源的异淀粉酶一般具有较好的热稳定性，Yokobayashi等报道了一种来源于假单胞菌的异淀粉酶在 45°C具有较好的稳定性，但是当温度达到60°C时就会迅速失活。工业上淀粉水解过程往往在酸性和较高温度(50到60°C)下进行。而同时具有在酸性和较高温度下具有较好活性的异淀粉酶往往更少。目前唯一商业化的异淀粉酶是由日本林原株式会社生产的，其生产菌种是经过诱变改良的I3Seudomonas amyloderaosa，该菌株发酵单位达到5100U/mL。随着基因工程技术的发展，越来越多的异淀粉酶在大肠杆菌或酵母中得到了成功表达，但是目前发酵水平较低、成本较高，无法达到工业化生产要求。如Chen等将来源于I^seudomonas amyloderaosa的异淀粉酶编码基因在酿酒酵母中成功表达，发酵4天酶活达到86U/mL。环糊精(Cyclodextrins，通常简称为⑶)，是一类由淀粉或多糖在环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的由D-吡喃葡萄糖单元通过α-1，4-糖苷键首尾相连的环状化合物的总称，常见的有6、7和8个葡萄糖单元的分子，分别称为α-、β-和Y-环糊精。由于 α -环糊精溶解度较大，所以化学法制备比较困难，而且会对环境造成较大污染，生物法目前被认为是极具应用潜力的方法。目前生物法生产α-环糊精的工艺一般是采用α-淀粉酶对淀粉进行部分液化，然后加入α-环糊精葡萄糖基转移酶进行环化反应制备α-环糊精。由于淀粉中原料含有75-85%的支链淀粉，支链淀粉是高度分支的多糖，其结构中每隔 1718个葡萄糖单位就有一个由α _1，6糖苷键构成的分支点。而α-环糊精葡萄糖基转移酶没有α-1，6糖苷键水解活性，其难以越过α _1，6糖苷键，导致周期长、淀粉利用率不高， 目前采用这种工艺时α-环糊精转化率往往在50%左右。由于淀粉脱支酶能够切断淀粉中的分支点，加速后续酶的反应，缩短反应时间，提高淀粉的转化率，从而增加产量、降低生产成本。Rendleman等报道先采用脱支酶(包括普鲁兰酶和异淀粉酶)对蜡质玉米支链淀粉进行脱支，再加入α-环糊精葡萄糖基转移酶在 15°C反应5天，可以使转化率达到76%。Ivan Pishtiyski等采用普鲁兰酶对马铃薯淀粉、 玉米淀粉等进行脱支后再采用酶转化20小时制备环糊精，发现玉米淀粉浓度为2. 5%时转化率最高，为65%。然而这些工艺存在原料太贵或底物浓度太低，反应周期较长等严重问题，因此难以实现工业化生产。
本发明要解决的技术问题是提供一种酸性耐热异淀粉酶基因工程菌，是以携带重组质粒表达耐热异淀粉酶基因的大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种构建所述基因工程菌的方法，通过克隆 Tfu_1891 编码基因(Genbank 登录号 NC_007333. 1)到 pT7_7 载体，以 E. coli BL21 (DE3) 为表达宿主，实现了酸性耐热异淀粉酶的高效表达。所述重组质粒为pUC系列，pET系列，ρΤ7_7，或pGEX中的任意一种。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种α -环糊精的生产的生产工艺，包括如下步骤按照5-20%的浓度进行淀粉调浆，在50-90°C条件下保温5-15分钟；调节温度 300C -60°C，调pH5. 0-6. 0后，按照每克淀粉加入2-100U的异淀粉酶和10-100个单位的 α -环糊精葡萄糖基转移酶，加入5%体积的有机溶剂后，充分反应4-10小时；回收有机溶剂，采用结晶方法得到α-环糊精。所述异淀粉酶是与α-环糊精葡萄糖基转移酶同步添加，二种酶同时作用于淀粉达到脱支、环化同步进行。此外，异淀粉酶可以先添加先对淀粉进行部分脱支，再添加α-环糊精葡萄糖基转移酶进行环化反应。所述的有机溶剂为乙醇，异丙醇，正丁醇，正癸醇中任一种。本发明提供的基因工程菌产酶活性高，达到3185U/mL，其应用于α _环糊精的制备酸性耐热异淀粉酶具有淀粉支链水解活性，最适温度为50°C，最适ρΗ 5. 5，在50°C下保温30h，酶活仍达50%以上。按照5-20%的浓度进行淀粉调浆，在50-90°C条件下保温5_15 分钟；调节温度30°C -60°C，调pH5. 0-6. 0后，按照每克淀粉加入2-100U的酸性耐热异淀粉酶和10-100个单位的α-环糊精葡萄糖基转移酶，加入5% (ν/ν)的有机溶剂后，充分反应 4-10小时，环糊精总转化率达到76. 95%，为目前国内外文献公开报道最高水平。图1酸性耐热异淀粉酶分离纯化SDS-PAGE图。1、Sephadex G50纯化后样品；2、DEAE-Sepharose纯化后样品；Μ、标准蛋白分子量。图2酸性耐热异淀粉酶最适温度。图3酸性耐热异淀粉酶最适ρΗ。图4酸性耐热异淀粉酶热稳定性。图5酸性耐热异淀粉酶ρΗ稳定性。实施例5 α -环糊精的生产本实施例采用酸性耐热异淀粉酶和α -环糊精葡萄糖基转移酶同时转化淀粉制备α-环糊精。按照5-20%的浓度进行淀粉调浆，在50-90°C条件下保温5_15分钟；调节温度 300C -60°C，调pH5. 0-6. 0后，按照每克淀粉加入2-100U的酸性耐热异淀粉酶和10-100个单位的α-环糊精葡萄糖基转移酶，再加入5% (ν/ν)的正癸醇后，充分反应4-10小时，环糊精总转化率达到76. 9%，其中α -环糊精转化率61. 7%。


本发明涉及一种酸性耐热异淀粉酶基因工程菌及其应用，属于酶工程领域。本发明采用化学合成获得异淀粉酶Tfu_1891编码基因序列，以pT7-7为表达载体，以E.coli BL21(DE3)为表达宿主，在工业级发酵培养基中培养，经过诱导重组异淀粉酶发酵活力达到3185U/mL。该重组酶具有淀粉α-1，6葡萄糖苷键水解活性，最适温度为40～50℃，最适pH 5.5，在50℃下保温30h，酶活仍保留50％以上。重组酶具有淀粉脱支活性，能水解淀粉中支链淀粉形成直链淀粉，该酶与α-环糊精葡萄糖基转移酶复配使用可以显著提高环糊精转化率，适合环糊精的工业生产。