专利名称：利用植物基因工程技术培育菊苣优质新种质的方法含硫氨基酸在饲料植物中含量较 少，特别是半胱氨酸和蛋氨酸，常成为第一限制性必需氨基酸。培育高含硫氨基酸的饲草品种是当前饲草品质改良的研究热点之一。菊苣(Cichorium intybus L.)是菊科菊苣属多年生草本植物,适应性强,喜温暖湿润气候,温度达5 °C时，能正常生长发育。抗寒能力强，幼苗能耐_8°C的低温。对土壤要求不严格，在荒地、坡地均能生长，全国各地都适合种植。利用期长，由于春季返青早，冬季休眠晚，利用期长达8个月(4 11月)之久，夏秋干旱季节，大多数牧草枯黄时，菊苣仍能保持青枝绿叶，可解决养殖业春秋两季和青饲料紧缺的矛盾，一次播种，在不收种的情况下可连续利用多年。菊苣被广泛用于饲料、蔬菜、制药和制糖原料，是目前较具开发前途的经济作物和首选的养殖业青饲料，近年来，菊苣在很多地区大量栽培，己成为一种极受欢迎的高档保健型蔬菜和新型优良饲草。但是菊苣含硫氨基酸特别是蛋氨酸和半胱氨酸含量很低，限制了其更为广泛的利用。菊苣遗传背景复杂，用常规育种方法培育高蛋白和高含硫氨基酸品种不仅耗时耗财耗力且难度极大，因此，利用一些高含硫氨基酸蛋白基因，通过遗传工程手段创造菊苣优质新种质，并提高菊苣蛋白质中含硫氨基酸水平具有十分重要的意义。利用转基因技术改良菊苣品质特别是提高含硫氨基酸含量目前还没有报道。重组蛋白基因zeolin是将菜豆球蛋白基因phaseiolin通过连接肽连接到玉米种子醇溶蛋白基因Y-Zein的N端构成的，该基因富含蛋氨酸和半胱氨酸，为提高了转基因植物中zeolin基因的稳定性和增强其表达，在重组基因前面加上了内质网驻留蛋白信号(KDEL)。Zeolin重组蛋白基因编码区有1578个核苷酸，编码526个氨基酸序列。其蛋白质分子量为58. OkDa0
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种利用植物基因工程技术培育菊苣优质新种质的方法。本发明的技术方案如下一种利用植物基因工程技术培育菊苣优质新种质的方法，包括以下步骤:Al、菊苣无菌实生苗的获得；A2、叶片外植体预培养；A3、转化菌液的准备用无菌牙签或接种针挑取含有外源基因质粒的农杆菌LBA4404单菌落，接种到50 mL含有硫酸链霉素(Str，50 mg/L)和卡那霉素(Kan, 50 mg/L)的液体YMB培养基中，28°C振荡培养16 24h至对数生长期，将培养物于4000飞000r/min离心10 min，去除上清液，收集菌体，用1/2MS无菌液体培养基重悬沉淀至0D600=0.4Abs，用于侵染转化；或直接用1/2MS无菌液体培养基稀释菌液用于侵染。所述YMB 培养基0. 5g/L K2HPO4 + O. 2g/L MgSO4 · 7H20 + 0. 5g/L NaCl + lOg/LMannitol +0.4g/LYeast extract,pH7.5 ；A4、外源基因的浸染转化无菌条件下，选取生长状态良好的预培养外植体放入制备好的菌液中，使叶片外植体与菌液充分接触，并放于震荡培养箱上震荡浸染IOmin ;浸染完后取出外植体，用灭菌滤纸吸去叶片表面附着的多余菌液，接种到垫有一层无菌滤纸且添加有乙酰丁香酮(AS，100umol/L)的共培养基上，于黑暗中共培养2_3d到肉眼有可见微菌落；共培养完后，将外植体接种到与预培养相同的培养基上进行恢复培养l-2d ;所述共培养培养基为MS 基本培养基 +6-BA 2. Omg/L + IBA O. 2mg/L+AS 100 μ mol/L+30g/L 蔗糖+8g/L 琼脂，ρΗ5· 4 5· 8 ;Α5、抗性芽筛选和再生恢复培养后，将转化外植体转入含筛选剂潮霉素(Hyg，25mg/L)和抑菌剂头孢霉素(Cef，500 mg/L)的筛选培养基中筛选培养直到长出抗性芽，当抗性芽长到Icm时，转入含筛选剂潮霉素(Hyg，15mg/L)和抑菌剂头孢霉素(Cef，250 mg/L)的扩繁培养基中扩繁至芽长到2-3cm，再转入含筛选剂潮霉素(Hyg，10mg/L)和抑菌剂头 孢霉素(Cef，250 mg/L)的生根培养基中进行生根培养，直到长成完整的小植株；所述筛选培养基为MS基本培养基 +2. 0mg/L6-BA + O. 2mg/LIBA+0. O lmg/LTDZ+25mg/L Hyg+500 mg/L Cef+30g/L 蔗糖 +8g/L 琼脂；pH5. 8 6. 0 ;扩繁培养基MS基本培养基 +2. Omg/L 6-BA + 0. 2mg/LIBA+0. 0 lmg/L TDZ+15mg/L Hyg+500 mg/L Cef+30g/L 鹿糖 +8g/L 琼脂；pH5. 8 6. 0 ;生根培养基为1/2MS基本培养基+0. lmg/LNAA+10mg/L Hyg+250 mg/L Cef+蔗糖15g/L+8g/L 琼脂，ρΗ5· 8-6. 0 ；A6、菊苣优质种质材料的鉴定和筛选。所述的方法，步骤Al中，挑选饱满的菊苣种子，依次进行75 %的乙醇表面浸泡30s，升汞浸泡10分钟，期间不停摇动，倒掉升汞，无菌水反复冲洗，最后用无菌水浸泡种子12h，倒掉浸泡液，用无菌滤纸吸干表面水分，接种于装有高压灭菌的Ms培养基的三角瓶中上，放于温室中萌发，得到无菌实生苗；所述无菌实生苗培养基为MS基本培养基+蔗糖30g/L+ 琼脂 8g/L, pH 5. 8 6. O。所述的的方法，步骤A2中，选取菊苣无菌苗幼嫩叶片，切成0.5X0. 5cm小块，将其接种于诱导培养基中进行预培养2-3d，培养到叶片边缘开始膨大；所述诱导培养基为MS基础培养基 +6-BA 2. 0mg/L+IBA 0. 2mg/L+30g/L 蔗糖 +8g/L 琼脂，pH 为 5. 8-6. O。具有培育周期短、效率高、成本低、对菊苣本身重要农艺性状影响小等优点，该技术将加速我国菊苣品种培育的进程。该技术通过提高菊苣含硫氨基酸含量，降低饲料成本，实现优质饲料的绿色无公害生产，为畜牧业发展和人们生活提供充足的绿色蛋白质原料来源，应用前景广阔。通过本发明的方法，测定数据结果(表I所示)表明在已检测的12株转zeolin基因菊苣中，有2株材料的含硫氨基酸总含量比对照分别提高了 7. 87%和13. 7%，选取这2株蛋氨酸和胱氨酸总含量显著高于对照的转基因菊苣植株即为菊苣优质新种质。图I为抗性芽的筛选和再生；图2为抗性芽的生根培养；图3为转zeolin基因菊苣炼苗 图4为转化菊苣DNA提取；图5为转基因菊苣扩繁植株RNA提取；图6为转zeolin基因菊苣的PCR电泳检测；注M: DL 2000 DNA marker;P:pCB-zeolin (阳性对照的质粒);CK:阴性对照(非转基因菊苣)；I 5转基因菊苣，该图与扩繁的P相同；图7为转Zeolin基因菊苣扩繁植株RT-PCR检测，注M: DL 2000 DNA marker;P:质粒pCB-GFP-zeolin (阳性对照);CK:阴性对照(非转基因菊苣)；I 4为转基因菊苣扩
繁植株；图8为转zeolin基因菊苣扩繁植株Southern blotting检测，注CK为ddH20, I和2为转化植株；图9为转zeolin基因菊苣田间表现及筛选。

5· 8ο5、抗性芽筛选和再生。恢复培养后，将转化外植体转入含筛选剂潮霉素(Hyg，25mg/L)和抑菌剂头孢霉素(Cef，500 mg/L)的筛选培养基中筛选培养直到长出抗性芽，如图I所示，从图中可以看出，转化的外植体经过25mg/LHyg抗性筛选2周后，转化体长出了带有外源基因的抗性芽，4周后统计得出Hyg抗性芽发生率平均为13. 52%，比常规转化转化条件下的2. 95%提高了 3. 58倍。当抗性芽长到Icm时，转入含筛选剂潮霉素(Hyg，15mg/U和抑菌剂头孢霉素(Cef，250 mg/L)的扩繁培养基中扩繁至芽长到2-3cm，再转入含筛选剂潮霉素(Hyg，10mg/L)和抑菌剂头孢霉素(Cef，250 mg/L)的生根培养基中进行生根培养，直到长成完整的小植株，如图2所示，抗性芽在含适当头孢和潮霉素的生根培养基中生根 长势良好，统计得出生根率达到92. 56 %。所述筛选培养基为MS基本培养基 +2. 0mg/L6-BA + O. 2mg/LIBA+0. O lmg/LTDZ+25mg/L Hyg+500 mg/L Cef+30g/L 蔗糖 +8g/L 琼脂；pH5. 8 6. 0 ;扩繁培养基MS基本培养基 +2. Omg/L 6-BA + 0. 2mg/LIBA+0. 0 lmg/L TDZ+15mg/L Hyg+500 mg/L Cef+30g/L 鹿糖 +8g/L 琼脂；pH5. 8 6. 0 ;生根培养基为1/2MS基本培养基+0. lmg/LNAA+10mg/L Hyg+250 mg/L Cef+鹿糖15g/L+8g/L 琼脂，ρΗ5· 8-6. O。6、菊苣优质种质材料的鉴定和筛选。转基因抗性小植株及未转基因再生植株的对照经过炼苗后移栽至温室花盆，如图3所示，从图3可以看出经过筛选得出的转基因苗炼苗后植株成活良好，通过统计分析得出炼苗后植株成活率高达95%以上。对成活植株提取DNA，如图4所示，进行PCR检测，PCR检测结果如图6所示，初步表明zeolin基因已经被导入大部分菊苣基因组中，统计分析表明经过潮霉素筛选为阳性的植株，PCR检测的阳性率为46. 15% ;对PCR检测为阳性的菊苣材料进行Southern杂交检测，检测结果(图7所示)表明zeolin基因以单拷贝的形式随机整合进菊苣基因组中；采用TRIzoI法，对以上检测都为阳性的转基因材料提取RNA(图5所示)进行RT-PCR检测，检测结果(图8所示)表明转zeolin基因的菊苣材料都扩增出与质粒大小相同的890bp的预期条带，说明阳性转基因菊苣材料将外源目的基因转录为mRNA，在核酸水平得到了表达。对稳定表达的阳性转基因植株移栽到田间挂牌标记，在莲座到抽薹期进行刈割，烘干，粉碎，氧化水解，测定蛋氨酸和胱氨酸的含量(图9所示)，测定数据结果(表I所示)表明在已检测的12株转zeolin基因菊苣中，有2株材料的含硫氨基酸总含量比对照分别提高了 7. 87%和13. 7%，选取这2株蛋氨酸和胱氨酸总含量显著高于对照的转基因菊苣植株即为菊苣优质新种质。表I 2株转基因材料含硫氨基酸含量测定结果


本发明公开了一种利用植物基因工程技术培育菊苣优质新种质的方法，包括以下步骤A1、菊苣无菌实生苗的获得；A2、叶片外植体预培养；A3、转化菌液的准备；A4、外源基因的浸染转化；A5、抗性芽筛选和再生；A6、菊苣优质种质材料的鉴定和筛选。本发明具有培育周期短、效率高、成本低、对菊苣本身重要农艺性状影响小等优点,该技术将加速我国菊苣品种培育的进程。该技术通过提高菊苣含硫氨基酸含量，降低饲料成本，实现优质饲料的绿色无公害生产，为畜牧业发展和人们生活提供充足的绿色蛋白质原料来源，应用前景广阔。