专利名称：一种有效降低动物体内胆固醇、血脂水平的脂肪酶及其应用的制作方法脂肪酶，又称甘油三酯水解酶，是一类能催化长链脂肪酸甘油酯水解的酶，也可以催化该反应的逆反应，许多微生物分泌的脂肪酶还可以催化酯化反应、酯交换反应、醇解反应、酸解反应以及氨解反应等。家禽胰腺中脂肪酶的活性在出生时很低，出生后随着日龄的升高而逐渐增加，肉鸡出生时对动物脂肪的消化率很差，在1-8周龄逐渐增加，肉鸡对植物油的消化率较动物油高，但在仔鸡出生后两周内的消化率较低。家禽在刚出生时胰腺分泌的脂肪酶不足成为限制脂肪消化利用的一个因素，因此，在玉米-豆粕型日粮中添加脂肪酶可以提高脂肪的消化率，从而影响动物的生长。在饲料中添加脂肪酶，能够提高日粮的脂肪消化率和能量利用率，从而改善畜禽生产性能。
本发明申请即是针对现有技术中的不足之处，提供一种能够有效降低动物体内胆固醇、血脂水平的脂肪酶及其应用。具体来说，本发明申请所述的一种有效降低动物体内胆固醇、血脂水平的脂肪酶， 其特征在于所述的脂肪酶由以下的方法获得1、获得潮霉素抗性表达盒并克隆至目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒；2、分别扩增青霉的脂肪酶基因(PEL)、构巢曲霉的强启动子3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子(PgpdA)和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子(TtrpC)，得到有强启动子驱动的PEL基因表达盒；3、将该PEL基因表达盒插入到潮霉素抗性的重组质粒中，获得了含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体；4、将含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体转化工程农杆菌，利用农杆菌介导转化法将PEL基因表达盒转化到青霉菌株中，获得高表达脂肪酶的青霉基因工程菌；5、将所述的青霉基因工程菌以菌丝体或孢子悬液接入种子培养基，在25-35°C、 200-300rpm条件下培养对小时后，以5% -20 %接种量转入发酵培养基，在25-35 °C、 150-300rpm条件下发酵2天后，经分离纯化得到所述的脂肪酶。其中，获得潮霉素抗性表达盒的方法包括PCR技术或限制性酶切技术。获得青霉的脂肪酶基因(PEL)、构巢曲霉的强启动子3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子 (PgpdA)和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子(TtrpC)的方法包括PCR扩增或限制酶克隆或化学合成技术克隆。其中所述的被转化的青霉菌为扩展青霉菌。所述的目标质粒为下列之一pCAMBIA1300、pCAMBIA2300、pCAMBIA3300 或 pHB。其中，所以培养基的成分如下1、种子培养基(% )黄豆饼粉 4，玉米淀粉 0. 8，Na NO3 0. 3，Na2HPO4 0. 2，K2SO4 0. 25，MgSO4 0. 03，FeSO4 0. 003 ；2、发酵培养基(% )黄豆饼粉 6，玉米淀粉 1，NaNO3 0. 4，Na2HPO4 0. 2，K2SO4 0. 3， MgSO4 0. 035，FeSO4 0. 02，CaCO3 0. 5，Na2CO3 0. 02。本发明申请还要求包括该脂肪酶在降低动物体内胆固醇、血脂水平中的应用。例如可以将该脂肪酶作为动物饲料添加剂添加到动物的日常饲料中，改善动物的肉质。图1为PV2+载体的结构示意图；图2为pCAMBIA2300载体的结构示意图；图3为pCAMBIA2302载体的结构示意图；图4 为 PMD18-T: :gpdA-Lip-TtrpC 载体的结构示意图；图5 为 pCHAMBIA2302: PgpdA-Lip-TtrpC 最终载体的结构示意图；图6为超表达载体pCHAMBIA2302 PgpdA-PEL-TtrpC的构建路线图；图7为构建的超表达载体pCHAMBIA2302: PgpdA-PEL-TtrpC的PCR鉴定图谱；其中，1-6 独立的农杆菌转化子、+ 阳性对照、-阴性对照、M :DL-2000Marker ；图8为青霉转基因菌株的PCR鉴定图谱；其中，1-5 独立的农杆菌转化子、+ 阳性对照、-阴性对照、M :DL-2000Markero
(3)将第(1)步得到的新鲜孢子配制成IX IO7个/mL浓度的悬浮液，随后取上述孢子悬液与步骤O)中的工程农杆菌等体积混合，取200 μ L均勻涂布到铺有玻璃纸的IM 固体培养基(含AS 200yg/mL)之上二8°C共培养60h，然后将玻璃纸反铺到含有潮霉素 (100 μ g/mL转化选择抗生素)、头孢菌素(500 μ g/mL，抑制农杆菌生长抗生素)的PDA培养基上培养2天，揭下玻璃纸，在条件下培养1-3天，将抗潮霉素的转化子挑出接种到二筛培养基上，如稳定传代，即是所述的青霉基因工程菌，如此获得了 30株青霉基因工程菌。随机挑选5株转化子进行扩大培养，并分别抽提基因组DNA，以(TGACTAGTATGTTG TTCAACTACCAATCTTT)作为正向引物；以(GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC)作为反向引物，以载体PMD-18-T: =PEL-TtrpC为阳性对照，野生型青霉基因组DNA为阴性对照，对这 5株菌进行PCR鉴定，结果显示这5株菌均为阳性，见图8。MM培养基的成分如下所述IM K2HPO4-KH2PO4 (PH7. 0) IOmL, M-N (MgSO4 ‘ 7H20 30g/L, NaCl 15g/L)20mL，l % CaCl2 ·2Η20 111^，20%葡萄糖1011^，0.01% 6504 IOmL, Spore element (ZnSO4 ·7Η20 IOOmg/ L, CuSO4 · 5H20 lOOmg/L, H3BO 3100mg/L, MnSO4 · H2O lOOmg/L, Na2MoO4 · 2H20 lOOmg/L) 5mL, 20% NH4NO3 2. 5mL，无菌水 941. 5mL。IM培养基的成分如下所述IM K-buf f er (PH4. 9) IOmL, M-N (MgSO4 ‘ 7H20 30g/L, NaCl 15g/L)20mL，l % CaCl2 ·2Η20 111^，20%葡萄糖1011^，0.01% 6504 IOmL, Spore element (ZnSO4 ·7Η20 IOOmg/ L, CuSO4 · 5H20 lOOmg/L, H3BO3 lOOmg/L, MnSO4 · H2O lOOmg/L, Na2MoO4 · 2H20 lOOmg/L) 5mL, 20% NH4NO 32. 5mL，50%甘油 10mL，IM MES (PH5. 5)40mL, IOOmM AS(乙酰丁香酮)2mL，无菌 7jC 898. 7mLCM培养基加一半IM培养基的葡萄糖量，外加1. 5%琼脂，其它成份同IM培养基。PDA培养基(g/L)马铃薯，200 ；蔗糖，20 ；琼脂，15 ；PH自然。实施例三、产脂肪酶能力对比实验随机挑选实例2所得的青霉基因工程菌接种到PDA培养基上，培养10天后分别接入种子培养基50mL中，在，210rpm摇床培养Mh，然后以10%的接种量分别转入发酵培养基Q50mL三角瓶装30mL发酵培养基)，在，210rpm条件下发酵48h ；然后将发酵液离心，取上清液进行脂肪酶活力检测。利用酸碱滴定法对脂肪酶活力进行检测。步骤取IOOmL三角瓶20只，分别加入4. OmL pH9. 4的Gly-NaOH缓冲液和5. OmL橄榄油乳化液；放入震荡恒温水浴锅36°C水浴锅预热5分钟.酶液过滤后，用0.05mol/L pH9. 4 的Gly-NaOH缓冲液稀释使酶活为4_5u/mL后测定。往其中两个各加入ImL稀释好的酶液，缓慢振荡(60次/min) 10分钟(精确计时).另外两瓶做空白对照.立即加入95%酒精20mL(空白对照加入ImL稀释好的酶液)，摇勻，加入10mL30 %的氯化钠溶液，摇勻；用 0. Olmol/LNaOH溶液滴定样品使其与空白对照的pH相同，记下0. Olmol/LNaOH用量。计算X = AXBXl/TXn式中
X—样品的酶活力(u/g或u/mL)；A——滴定样品时消耗标准0. Olmol/LNaOH的体积(mL)；B——滴定用NaOH的浓度(μ mol/mL) T——酶促反应时间(min)，η—稀释倍数；同时做两份平行，结果取平均值，所得结果表示至整数。平行试验相对误差不得超过 5.0%。PDA培养基(g/L)马铃薯，200 ；蔗糖，20 ；琼脂，15 ；PH自然种子培养基(%)黄豆饼粉 4，玉米淀粉 0. 8，NaNO3 0. 3，Na 2HP04 0. 2, K2SO4O. 25， MgSO4 0. 03，FeSO4 0. 003发酵培养基(%)黄豆饼粉 6，玉米淀粉 1，NaNO3 0. 4，Na2HPO4 0. 2，K2SO4 0. 3， MgSO4 0. 035，FeSO4 0. 02，CaCO3 0. 5，Na2CO3 0. 02橄榄油乳化液的制取4% PVA溶液和橄榄油为2 1 (ν/ν)，放到小三角瓶里(外包冰块)，调整为转速为10000转/分，一次乳化3分钟，间隔3分钟，共乳化3次。转基因青霉和非转基因青霉的酶活力测定结果见下表
菌林编号WTTlT2T3T4T5酶活力 (IU/mL)3100 + 155320 + 305210 + 256130 + 405460 + 455750 + 50其中，WT为青霉野生型菌株，Tl，Τ2，Τ3，Τ4，Τ5 为独立的青霉转化子，由图可知， 转基因青霉的酶活力显著高于非转基因青霉的酶活力。实施例四、在动物饲料中添加上述脂肪酶的动物实验本试验选用240只1日龄健康的爱维因肉仔鸡，按照随机分配原则分为4个处理组，每个处理4个重复，每个重复15只鸡。试验期为8周。整个饲养期分为三个阶段0-3wk 为生长前期，4-6wk为生长中期，7-8wk为生长后期，试验设计见表1。表1试验设计
组别正对照负对照试验I试验11处理常规曰粮低能量曰粮常规曰粮低能量曰粮+0. 02%脂肪酶+0. 02%脂肪酶一、试验日粮—次性购入所需北方常规使用原料，粉碎后按日粮组成用搅拌机混合均勻。依据国家肉鸡标准O004)的营养需要量配制基础日粮作为正对照组日粮，负对照组、试验I、试验I I日粮组成与营养水平见表2、表3与表4。所有日粮均为粉料，严格按试验设计饲喂相应日粮。表2 0-3周日粮组成及营养水平(％ )


本发明申请提供一种能够有效降低动物体内胆固醇、血脂水平的脂肪酶及其应用，通过在日粮中添加脂肪酶对商品肉仔鸡的生长性能的影响、对表观代谢能的影响、对血液生化指标的影响和对腹脂率等的影响进行研究。结果表明，添加脂肪酶能提高肉鸡的生长性能和表观代谢能，降低血液中甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白含量，降低腹脂率，并且在试验中期生长性能和表观代谢能提高最大，甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白含量和腹脂率降低最大。