专利名称：一株产苦参碱的枝顶孢属真菌及其应用和其发酵液的应用的制作方法苦豆子(Sophora alopecuroides L)为豆科槐属多年生草本植物,广泛分布于我国宁夏、甘肃、内蒙古、新疆等西部省区的荒漠、半荒漠草地。苦豆子全草、根、种子可入药，用于抗肿瘤、抗病毒、抗菌消炎、清热解毒、消肿止痛、止痢、杀虫等，其有效成分主要为苦参碱等喹诺里西啶类生物碱，具有重要的医疗和研究价值。苦豆子抗寒耐旱耐盐碱、固氮作用强，是西北地区防风固沙、维持西部草原生态平衡的重要沙生植物。但近年来，随着临床医疗对苦豆子生物碱需求的不断增加，人为的滥采滥挖致使野生苦豆子储量急剧下降，大批草场退化，水土流失，严重威胁着苦豆子植物资源的可持续开发和利用以及西部草地的生态平衡。目前，人们主要对苦豆子内生细菌、内生放线菌进行了研究，但苦豆子内生真菌的研究较少。王兰等(2007)对苦豆子内生真菌进行研究，分离出I株对小麦赤霉等6种病原菌具有不同程度抑制作用的内生真菌，与苦豆子生物碱的作用相近；顾沛雯等从苦豆子中分离到214株内生真菌，167株具有抑菌活性。但苦豆子中合成喹诺里西啶类生物碱内生真菌的研究还未见报道。产生喹诺里西啶生物碱的苦豆子内生真菌的开发，将是解决苦豆子植物资源日益匮乏的有效途径，具有重要的研究价值和广阔应用前景
本发明的目的之一是提供一株产苦参碱的枝顶孢属真菌，利用该枝顶孢属真菌能够通过微生物发酵合成苦参碱等苦豆子的主要有效成分。本发明的目的之二是提供一种上述枝顶孢属真菌的应用，其能够用于通过微生物发酵合成苦参碱；本发明的目的之三是提供一种上述枝顶孢属真菌发酵液的应用，该发酵液对黄瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌具有不同程度的抑菌作用。—株产苦参碱的枝顶孢属真菌，是枝顶孢属真菌(Acremonium sp. ) SA_NXE5CCTCC NO. M 2012214。—株用于通过微生物发酵合成苦参碱的枝顶孢属真菌(Acremonium sp. ) SA_NXE5CCTCC NO. M 2012214。一株其发酵液用于抑制黄瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌的枝顶孢属真菌(Acremonium sp.)SA_NX E5CCTCC NO. M 2012214。本发明的枝顶孢属真菌，可以通过微生物发酵合成苦参碱等苦豆子主要有效成分，从而开发新的微生物资源，为野生苦豆子植物资源的保护和利用提供了依据。并且本发明的枝顶孢属真菌可直接利用真菌发酵产生苦参碱，与植物栽培产生苦参碱相比，具有效率高，周期短，不受季节、气候、地理条件等因素的限制，经过试验证明，可通过微生物发酵合成苦参碱等苦豆子的主要有效成分。附图I为本发明菌株SA_NX E5的菌落图；附图2为本发明菌株SA_NX E5的显微形态；附图3为本发明菌株SA_NX E5提取物中保留时问为25. 546min的色谱峰的离子碎片质谱图；附图4为本发明菌株SA_NX E5提取物在250 800nm范围的紫外扫描图；附图5为本发明菌株SA_NX E5的NJ系统发育树。 PDA培养基马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水lOOOmL，pH为6 7，121 °C高压灭菌20min。PCA培养基马铃薯20g，胡萝卜20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH为6 7，121°C高压灭菌20min。(4)真菌富集培养挑取PCA斜面上的SA_NX E5菌株的菌落，放入装有10 15粒灭菌的玻璃珠和IOml灭菌去离子水的具塞离心管中，置涡旋器上振荡I 2min，分散真菌孢子，并在显微镜下记录每毫升液体中孢子的数量。吸取该孢子悬液5ml加入新的灭菌试管中，在试管中加入适量的灭菌去离子水，轻轻振荡混匀，使真菌孢子的终浓度为I X IO5 I X IO6个/ml。取Iml真菌孢子悬液加入到装有IOOml发酵培养基的250ml三角瓶中，置25°C摇床中，150r/min振荡培养15d。所述的发酵培养基的组分及配比为葡萄糖20g，蛋白胨5g，酵母粉2g，MgS04. 7H20
0.5g, KCl 0. 5g, FeSO4. 7H20 0. Olg, K2HPO4Ig,蒸馏水 IOOOmL, pH 为 6 7，121 °C高压灭菌20mino二、菌株SA_NX E5抑菌活性的检测(I)菌株SA_NX E5的发酵培养分别在10支装有IOOml发酵培养基的250ml三角瓶中各加入孢子悬液1ml，置25°C摇床中，150r/min振荡培养15d。(2)发酵液的处理待培养结束后，用滤纸将发酵液过滤，滤液用旋转蒸发仪80°C减压浓缩。浓缩残渣用20ml去离子水超声振荡使其充分溶解,然后3000r/min离心lOmin，取上清液。用孔径为
0.22 um的微孔滤膜过滤除菌，制成待检液，加入到50 60°C的PDA培养基中，摇匀并铺制含有待检液的PDA平板。(3)抑菌试验将黄瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌分别接种于PDA培养基表面，置25°C培养72h。用打孔器在培养黄瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌的培养基上截取的6_的菌饼，分别接种于含有待检液的PDA培养基和不含待检液的PDA培养基表面，置25°C培养72h，测量菌落直径。结果表明，在不含待检液的PDA培养基上生长的黄瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌的菌落直径 分别为33. 5 ±4mm和27. 3 ± 3mm，而在含有待检液的PDA培养基上生长的黄瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌的菌落直径分别为16. 2±3mm和20. 5±5mm，菌株SA_NX E5发酵液对黄瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌的抑制率分别为51. 6%和24. 9%。三、菌株SA_NX E5中生物碱的检测(I)真菌菌丝中苦参碱的提取与分离将发酵培养的真菌过滤，收集真菌菌丝2 3g，用液氮冷冻菌丝并研磨成粉末，置60°C水浴30min烘干。分别用干净滤纸包裹真菌粉末，置索氏提取器中，加入50ml甲醇，75°C提取24h。将提取液浓缩挥干，用5ml甲醇溶解，溶液与0. 5 Ig中性氧化铝混匀，并置60°C水浴上加热挥干甲醇。将吸附了样品的中性氧化铝粉末干法装于5g的中性氧化铝柱上，用V氯仿V鴨=7 : 3的混合溶剂30 50ml洗脱样品，洗脱液分为2份，分别浓缩挥干，I份用Iml吡啶溶解，经0. 22 y m微孔滤膜过滤后，再用吡啶定容至5ml，制成样品待检液用于气相色谱质谱联用分析。另I份用Iml乙醇溶解，经0. 22 y m微孔滤膜过滤后，再用乙醇定容至5ml，制成样品待检液用于酸性染料比色法分析。(2)真菌发酵液中苦参碱的提取与分离将发酵培养的真菌过滤，收集滤液500ml，用lmol/L的氨水溶液调节pH至9 10，然后加入分液漏斗中。在漏斗中加入200 300ml的氯仿溶剂，振荡萃取3 5次，回收氯仿萃取液，浓缩挥干氯仿，残渣用5ml吡啶超声振荡使其充分溶解，经0. 22 微孔滤膜过滤后，再用吡啶定容至IOml，制成样品待检液用于气相色谱质谱联用分析。(3)真菌菌丝和发酵液中苦参碱的气相色谱质谱联用分析将按上述方法制备的样品待检液按如下条件进行气相色谱质谱联用分析。分析条件为 Agilent HPSMS (190915-433)石英毛细管柱(30mX0. 25mmX0. 25 y m)，载气为氦气，流速 lmL/min。柱温为100°C保持 Imin ；100 200。。，5。。/min，200 270°C, 20°C /min ；270°C保持lOmin。进样口温度250°C，进样量luL，分流比50 I ;质谱离子源温度230°C，扫描范围30 550，EI电压为70eV。经色谱分离后，菌株SA_NX E5的菌丝和发酵液提取物分别在色谱保留时间为25. 580min和25. 546 min出现色谱峰，且该色谱峰的离子碎片质谱图与质谱数据库中苦参碱的离子碎片质谱图吻合(参见附图3)，说明菌株SA_NX E5的菌丝和发酵液中均含有苦参碱，确定菌株SA_NX E5能够产生苦参碱。(4)真菌菌丝中苦参碱含量的测定取lmg/ml苦参碱标准液10、20、30、40、50、60、70、80 U I分别置于25ml的具塞试管中，挥尽乙醇，分别加入pH = 7.6的溴麝香草酚蓝缓冲液6. 00ml，氯仿6. 00ml，密塞，剧烈振摇2min提取，加入到酸式滴定管中静置2h，分取氯仿层，以未加苦参碱液管为空白，取空白管中的氯仿层溶液放入紫外分光光度计中进行基线校正，然后分别将各样品氯仿层置于紫外分光光度计下进行250 SOOnm波长范围内进行扫描，确定苦参碱出现最大吸收峰时对应的波长为414nm，在该波长下，测定各标准品提取液的吸光度值。以氯仿提取液中苦参碱浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，构建线性回归方程，得回归方程y =47. 312x-0. 016 (R2 = 0. 9969)。吸取(I)中制备的菌丝提取物乙醇溶液IOOii L，加入到25ml具塞玻璃试管中，挥干乙醇。在试管中分别加入6. OOml溴麝香草酚蓝pH = 7. 6缓冲液和6. OOml氯仿，密塞，剧烈振摇2min，然后将混合液体加入到酸式滴定管中静置2h，分取氯仿层。将该样品氯仿层置于紫外分光光度计下250 SOOnm波长范围内进行扫描，结果表明菌丝提取物也在414nm处有最大吸收峰(参见附图4)，将该波长下测得的吸光度值代入线性回归方程，计算得出菌丝中苦参碱的含量为37. 6 u g/g。四、菌株SA_NX E5的分子生物学鉴定采用引物ITSl和ITS4扩增内部转录区间序列(internal transcribedsequence, ITS)，采用引物NSl和NS2扩增核糖体小亚基编码序列。PCR反应体系为TaKaRaTaq DNA 聚合酶 2. 5 U，10XPCR Buffer 5 u L, MgCl2 3 u L, dNTP 4 y L，弓丨物各 2 y L，模板DNA 0. L，加双蒸水至50ii L ;反应条件为94°C预变性5min ;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，30个循环；最后72°C延长IOmin使其完全反应。将扩增的片段凝胶回收后，送上海英骏生物技术公司测序。核苷酸序列测定结果显示，菌株SA_NX E5的ITS-5. 8SrDNA序列和SSU rDNA序列长度分别为573bp和50Ibp，其GenBank登录号分别为JX021664和 JX040872。
菌株SA_NX E5的ITS-5. 8S rDNA核苷酸序列为序列表中序列I所示,菌株SA_NXE5的SSU rDNA核苷酸序列为序列表中序列2所示。登录http//:www. ncbi. nlm. nih. gov,分别应用 BLAST 程序将测定的 ITS 和 SSUrDNA序列与GenBank中的ITS和SSU rDNA序列进行同源性比较，选取同源性较高的菌株序列构建系统发育树。采用邻接法(neighbor-j0ining，NJ)构建系统发育树。BLAST比对结果显不，菌株 SA_NX E5 的 ITS-5. 8SrDNA 序列与 Acremonium sp. CB90 (HM989951)、Acremoniumsp. YT03 (EF577237)、Acremonium sp. XSD-85 (EU326199)、Acremonium sp. B26 (HQ696028)等枝顶孢属真菌的序列同源性高达98%。菌株SA_NX E5的SSU rDNA序列与AcremoniumguiIlematii CBS 756. 69(HQ232186)、Acremonium guiIlematii CBS 766.69(HQ232194)等枝顶孢属真菌的序列同源性高达99%。NJ系统发育树(参见附图5)表明，SA_NX E5菌株与 Acremonium sp. CB 90 (HM989951)、Acremonium sp. YT03 (EF577237)、Acremoniumsp. XSD-85 (EU326199)、Acremonium sp. B26 (HQ696028)等枝顶抱属真菌的遗传距离最近。根据SA_NX E5菌株的形态特点、ITS-5. 8S rDNA和SSU rDNA序列信息及其系统发育分析结果，确定SA_NX E5菌株为枝顶孢属真菌(Acremonium sp.)。

本发明涉及一株产苦参碱的枝顶孢属真菌及其应用和其发酵液的应用。是枝顶孢属真菌(Acremonium sp.)SA_NX E5CCTCCNO.M2012214。本发明的枝顶孢属真菌，可以通过微生物发酵合成苦参碱等苦豆子主要有效成分，从而开发新的微生物资源，为野生苦豆子植物资源的保护和利用提供了依据。并且本发明的枝顶孢属真菌可直接利用真菌发酵产生苦参碱，与植物栽培产生苦参碱相比，具有效率高，周期短，不受季节、气候、地理条件等因素的限制，经过试验证明，可通过微生物发酵合成苦参碱等苦豆子的主要有效成分。