专利名称：荆芥挥发油及制剂的制法和在制备治疗抗感冒药中的应用的制作方法 感冒是由感冒病毒引起的一种常见的多发病，主要分普通感冒及流行性感冒两种，病症包括发烧、头痛、肌肉痛、流鼻涕、咽喉痛等。感冒貌似“小病”，但若是治疗不及时，容易导致多种严重的并发症，如病毒性心肌炎等，严重者并可能有生命危险，尤其是其中的流行性感冒，它是由流感病毒引起的一种发病率高、流行广泛、传播迅速的急性呼吸道传染病。1918年、1957年及1968年在全球爆发了3次大流感疫症，有数千万人被流感夺去了生命。因流感病毒的表面抗原红细胞凝集素HA(Hemagglutinin)及神经氨酸酶NA(Neuraminidase)能经常不断地发生变异，造成感冒病毒种类繁多，进而给采用疫苗预防流感带来了一定的困难。目前，患感冒的人数越来越多，而且每年冬春季节都有几次流感发作，故感冒药的应用有着广泛的市场前景。尽管经过多年的研究，国际上已研制出了一些药物用于防治流感，当前临床上用于治疗感冒的药品主要分为西药和中药两种，西药如金刚烷胺(amantadine)、金刚乙胺(rimantadine)、三氮唑核苷(ribavirin)等，虽然具有显效较快的优点，但副作用较大，如很多西药抗感冒药中因含副作用极大的PPA而被禁用；相比较而言，中药及其有效成分副作用较少，但目前市场上应用的抗感冒中药，虽疗效较好，但显效较慢，不能满足人们现代化快节奏生活的需要。
迄今为止，流感仍是未被人类有效控制的病毒性传染病，因而从植物药中寻找高效、无毒副作用的抗流感病毒药物已得到世界各国的重视。故抗感冒新药的研制开发有着现实的意义，如能开发一种疗效显著、副作用较小的新型抗感冒药，必将对人们的医疗健康事业做出相应的贡献。在此指导思想下，我们以传统解表药中药材荆芥为原药材，以其有效部位荆芥挥发油为研究对象，系统研究了荆芥挥发油及其制剂的制备方法以及在感冒治疗中的应用。1、发明目的本发明目的是提供一种荆芥挥发油及其制剂的制备方法，以及在制备治疗抗感冒药物中的应用。中药材荆芥(Schizonepeta tenuifolia Briq.)为唇形科一年生草本植物荆芥的干燥地上部分。荆芥最早以“假苏”一名载于《神农本草经》，被列为中品；荆芥之名始载于《吴普本草》。荆芥性温、味辛，亦有人认为其性平或凉；其生品具有祛风解表、宣毒透疹、散瘀止血之功效，主治风寒感冒、咽喉肿痛及多种皮肤病，为中医临床常用药物。近期，丁安伟等对荆芥药材进行了系统的研究，从中提取得到一有效部位—荆芥挥发油，经系统的药理毒理实验验证，表明该提取物具有明显的抗炎、抗菌、抗甲型及乙型流感病毒活性，且具有毒副作用小的优点，有着良好的开发应用前景，可将其进一步开发成有效的抗感冒新药。2、技术方案挥发油提取常采用水蒸气蒸馏法、溶剂提取法、超临界萃取法等方法，其中水蒸气蒸馏法具有操作方便、成本低廉、无污染、适用于大生产等特点，故本发明采用水蒸气蒸馏法提取挥发油。一种荆芥挥发油，其特征在于由荆芥穗80～120g，加水8～12倍量，水蒸气蒸馏而制得的提取物。一种荆芥挥发油的提取方法，其提取步骤为(1)称取荆芥穗80～120g，加水8～12倍量，水蒸气蒸馏2～8小时；(2)用油水分离器分离得含水荆芥挥发油；(3)在-9～15℃下冰冻6～36小时，去冰除水，得荆芥挥发油。
一种荆芥挥发油制剂，其特征在于加入制备不同剂型的各种辅料，以专门的制剂工艺可制成胶囊剂(硬胶囊、软胶囊)、喷雾剂及其它各种制剂。
一种硬胶囊剂的制备方法，其制备步骤为(1)取1～2g的荆芥挥发油，加6～12倍量的β-环糊精和18～22倍β-环糊精的蒸馏水，在25～40℃条件下用分散机高速分散10～60分钟，进行药液包结；(2)将包结后药液用喷雾干燥法去除黏附的挥发油，喷雾干燥的进风温度为140～180℃，出风温度为60～80℃；(3)将包结物喷干粉末，加适当的95％的乙醇，进行干式制粒，灌装胶囊。
一种软胶囊剂的制备方法，其制备步骤为(1)取1～2g的荆芥挥发油，加30～34g的聚乙二醇-400和1～4g的甘油，在25~40℃条件下用搅拌0.5～4小时，进行药液分散；(2)将分散后药液压制软胶囊；(3)将压制好的软胶囊用60～90％的乙醇洗粒，20～40℃烘干24～96小时，即得。
一种喷雾剂的制备方法，其制备步骤为(1)取1～2g荆芥挥发油，加20～40％的乙醇及10％～30％的聚乙二醇，分散成溶液状；(2)加水200～400ml，分装成口腔喷雾剂。
以荆芥挥发油为原料，可将其开发成各种制剂，如胶囊剂、喷雾剂等，这些制剂具有携带方便，服用简便等优点，亦可将其开发成其它剂型。
荆芥挥发油在制备治疗抗感冒药物中的应用。
以下结合荆芥挥发油的药效学试验，进一步说明本发明的有益效果(1)体外抗菌试验结果表明不同浓度的荆芥挥发油对临床分离菌株肺炎双球菌，人葡萄球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、中葡萄球菌，肺炎克雷百氏菌、阴沟杆菌、溶葡萄球菌、产碱杆菌、大肠杆菌、奇变杆菌、不动杆菌、链球菌、乙型链球菌、大肠杆菌、哈夫利亚杆菌、聚团杆菌、变形杆菌、板畸杆菌、科代葡萄球菌、洋葱假单孢杆菌、产气杆菌和标准菌株金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、藤黄微球菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等均具有一定的抑菌作用，MIC在0.625mg～10mg之间，提示荆芥挥发油具有体外抗菌作用。
(2)体内抗菌试验结果表明①荆芥挥发油10mg/kg、20mg/kg剂量组可降低金黄色葡萄球菌感染小鼠死亡率，与模型对照组比较有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)。②荆芥挥发油20mg/kg剂量组可降低肺炎双球菌感染小鼠死亡率，5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg三个剂量组可延长感染小鼠的存活天数；与模型对照组比较有显著性差异(P＜0.05＝提示荆芥挥发油对金黄色葡萄球菌和肺炎双球菌感染小鼠具有一定的保护作用。
(3)体内抗病毒试验结果表明①荆芥挥发油10mg/kg、20mg/kg剂量组对甲型流感病毒(A/PR/8/34)感染小鼠具有明显的保护作用，保护率分别为58.7％和69.0％，并能明显延长甲型流感病毒感染小鼠的存活时间，与模型对照组比较有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01＝。②荆芥挥发油5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg剂量组能明显降低甲型流感病毒感染小鼠的肺指数值，与模型对照组比较有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01＝，肺指数抑制率分别为24.4％，28.9％和34.2％，组织病理学检查结果，荆芥挥发油具有抗甲型流感病毒所致肺部感染疾病的作用，抗病毒感染效果以荆芥挥发油10mg/kg、20mg/kg作用较强，肺部总体病变程度最轻。提示荆芥挥发油具有抗甲型流感病毒感染的作用。③荆芥挥发油10mg/kg、20mg/kg剂量组均可明显延长乙型流感病毒感染小鼠的存活天数和降低乙型流感病毒感染小鼠死亡数，与模型对照组比较具显著性差异(P＜0.05，P＜0.01＝。④荆芥挥发油10mg/kg、20mg/kg剂量组均可明显降低乙型流感病毒感染小鼠的肺指数值，肺指数抑制率为23.23％和22.87％，提示荆芥挥发油具有减轻乙型流感病毒感染小鼠肺部病变的作用。提示荆芥挥发油对乙型流感病毒感染小鼠具有明显的保护作用。
(4)抗炎试验结果表明①荆芥挥发油10mg/kg、20mg/kg可降低二甲苯所致耳廓肿胀度，与模型组比较有明显差异(P＜0.05，P＜0.01)。②荆芥挥发油10mg/kg、20mg/kg可降低醋酸所致的小鼠腹腔洗出液的光密度值的增加，与模型组比较有明显差异(P＜0.05，P＜0.01＝，提示荆芥挥发油具有一定的抗炎作用。
(5)发汗、解热试验结果表明①荆芥挥发油10mg/kg可降低干酵母所致大鼠体温升高，与模型组比较有明显差异(P＜0.05)。②荆芥挥发油6mg/kg可降低内毒素所致家兔体温升高，与模型组比较有明显差异(P＜0.05，P＜0.01)。③荆芥挥发油5mg/kg、10mg/kg可促进大鼠足趾汗腺的分泌，与模型组比较有明显差异(P＜0.05，P＜0.01)。提示荆芥挥发油具有一定解热、发汗作用。
综上所述荆芥挥发油具有较好的抗炎、解热、发汗、抗菌和抗病毒作用。
3、有益效果(1)荆芥挥发油为从传统中药中提取的有效部位，具有较好的抗炎、解热、发汗、抗菌和抗病毒作用①体外抗菌试验结果表明荆芥挥发油具有体外抗菌作用。②体内抗菌试验结果表明荆芥挥发油对金黄色葡萄球菌和肺炎双球菌感染小鼠具有一定的保护作用。③体内抗病毒试验结果表明荆芥挥发油具有抗甲型、乙型流感病毒感染小鼠具有明显的保护作用。④抗炎试验结果表明荆芥挥发油具有一定的抗炎作用。⑤发汗、解热试验结果表明荆芥挥发油具有一定解热、发汗作用。
(2)荆芥挥发油具有剂量小的优点。其小鼠有效剂量为10mg/kg、20mg/kg。
(3)荆芥挥发油具有毒副作用小的优点，其小鼠LD50为560mg/kg，95％的可信限为514mg/kg～609mg/kg。
(4)以荆芥挥发油为原料制成硬胶囊的包结工艺中采用均质分散工艺，该工艺可以大大缩短包结时间，提高包结效率。
(5)硬胶囊制备工艺中的干燥工艺采用喷雾干燥工艺，该工艺可以去除黏附的挥发油，提高半成品及制剂的稳定性。

实施例1、荆芥挥发油的提取方法，其提取步骤为(1)取荆芥穗3.31kg，加10倍量水，水蒸气蒸馏6小时；(2)用油水分离器分离得含水荆芥挥发油33.0g；(3)在-12℃冰冻24小时，去冰除水，得荆芥挥发油31.5g，即得。
实施例2、本发明硬胶囊剂—金感胶囊的制备方法，其制备步骤为(1)取荆芥挥发油31.5g，加入8倍量的β-环糊精(252g)和20倍β-环糊精的蒸馏水(5.04L)在30℃条件下，用分散机高速分散30分钟；(2)包结药液采用喷雾干燥，设置进风温度160℃，出风温度70℃，得包结物喷干粉末；(3)每250g喷干粉喷加10ml95％乙醇，干式制粒，灌装胶囊1000粒，每粒装0.25g，即得。
实施例3、本发明软胶囊剂—清菲软胶囊的制备方法，其制备步骤为(1)取2g的荆芥挥发油，加31.35g的聚乙二醇-400和1.65g的甘油，在30℃条件下用搅拌2小时，进行药液分散；(2)将分散后的药液压制软胶囊；(3)将压制好的软胶囊用75％的乙醇洗粒，25℃烘干72小时，即得。
实施例4、口腔喷雾剂的制备方法，其步骤为(1)取1.2g荆芥挥发油，加30％的乙醇及10％的聚乙二醇，分散成溶液状；(2)加水200ml，分装成口腔喷雾剂。
实施例5、金感胶囊药效学试验1实验材料1.1药品与试剂金感胶囊，类白色粉末，每1gβ-环糊精包结物含挥发油0.084g，由南京中医药大学提供，批号20011220，临用时用蒸馏水配制到所需浓度。
β-环糊精中国医药(集团)上海化学试剂公司 批号20010308环丙沙星广州南新制药有限公司 批号011102利巴韦林胶囊浙江—新制药有限公司 批号010105双黄连哈尔滨松花江制药厂批号001014乙醚上海马陆化工厂批号980209氯化钠 江苏太仓化工厂批号990901苦味酸 广东台山化工厂批号990623营养肉汤 上海市医学化验所 批号010927营养琼脂 上海市医学化验所 批号010324绵羊红细胞 南京江宁防疫站 批号020505胃膜素由中国药科大学微生物室提供二甲苯上海化学试剂采购供应站经销批号010121冰醋酸南京化学试剂厂批号010317伊文思兰中国医药(集团)上海化学试剂公司 批号010213
三九感冒灵三九医药股份有限公司 批号20010609阿司匹林阿斯特拉(无锡)制药有限公司 批号20020110内毒素美国Sigma公司批号L-2630 Lot 31k4121干酵母湖北安琪酵母股份有限公司 批号20020518无水乙醇上海久意化学试剂有限公司 批号20010520碘中国成都化学试剂厂批号010314蓖麻油上海化学试剂站分装厂 批号010623田-高氏试剂A液取碘2克溶于100ml无水乙醇即成。
田-高氏试剂B液取可溶性淀粉50克、蓖麻油100ml，两者均匀混合即可。
1.2实验动物ICR小鼠 由南京医科大学实验动物中心提供，合格批号SCZK(苏)2001-0015昆明种小鼠、SD大鼠由南京中医药大学实验动物中心提供，实验动物合格证号苏动(质)97003，实验动物使用许可证号SYXK(苏)2002-0053，实验动物饲养许可证号SCXK(苏)2002-0012兔由江宁县汤山青龙山动物繁殖厂，实验动物饲养许可证号SCXK(苏)2002-00271.3实验用菌株和病毒株标准菌株金黄色葡萄球菌(26003)、大肠杆菌(44104)、短小芽苞杆菌(63202)、枯草芽苞杆菌(63501)、藤黄微球菌(28001)，由卫生部微生物鉴定所提供。
临床分离菌株金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌，不动杆菌，肺炎克雷百氏菌，表皮葡萄球菌，人葡萄球菌，洋葱假单孢杆菌、枸橼酸肠杆菌，链球菌、变形杆菌、奇变杆菌、产气杆菌、板畸杆菌、聚团杆菌、溶葡萄球菌、肺炎双球菌、乙型链球菌、中葡萄球菌、哈夫利亚杆菌，科代葡萄球菌、产碱杆菌、由江苏省人民医院微生物室分离鉴定提供。
病毒株甲型流感病毒A/PR/8/34，乙型流感病毒B/京防98-76由中国预防医学科学院病毒所提供。
2 实验条件及统计方法2.1实验条件给药前后，实验小鼠分笼饲养全价颗粒饲料，由南京江浦振兴实验动物饲料厂提供，合格证号苏动(饲)字96001，自由饮水，室温22±2℃，湿度55-60％。
2.2统计方法资料统计采用t检验，X2检验。
3实验方法和结果
3.1金感胶囊的体外抗菌作用[1][4]3.1.1增菌培养取各菌株少许，接种肉汤培养基中，37℃培养18h，取出用NS稀释至10-5备用。
3.1.2含药平皿的的配制取金感胶囊32g加至已融化至60℃100ml琼脂培养基中混匀(320mg/ml)，以二倍法稀释成160mg、80mg、40mg、20mg、10mg、5mg、2.5mg、1.25mg 0.625mg、0.313mg、0.156mg/ml系列浓度含药平皿待用。取盐酸环丙沙星注射液与琼脂培养基混匀，也以二倍稀释法制成终浓度为128μg、64μg、32μg、16μg、8μg、4μg、2μg、1μg、0.5μg、0.25μg、0.125μg、0.0625μg、0.0313μg/ml的系列含药平皿待用。
3.1.3体外抗菌活性MIC的测定在上述系列含药平皿上用6mm无菌钢圈打3个孔，每孔注入含菌量约为10-5CFUml，0.1ml，37℃培养18～20h，以无菌生长平皿培养基中所含药物的最低浓度即为药物对该菌的最低抑菌浓度(MIC)结果见表1表1金感胶囊的体外抗菌活性(n＝2)


实验结果所示金感胶囊对标准金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、藤黄微球菌。短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和临床分离菌肺炎双球菌、人葡萄球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、中葡萄球菌、肺炎克雷百氏菌、阴沟杆菌、溶葡萄球菌、产碱杆菌、大肠杆菌、奇变杆菌、不动杆菌、链球菌、乙型链球菌、大肠杆菌、哈夫利亚杆菌、聚团杆菌、变形杆菌、板畸杆菌、科代葡萄球菌、洋葱假单孢杆菌、产气杆菌具有较强的抑菌作用，MIC在0.625mg-10mg之间，提示金感胶囊具有体外抗菌作用。
3.2金感胶囊的体内抗菌作用3.2.1金黄色葡萄球菌菌液的制备取金黄色葡萄球菌菌株，用接种环挑少许于营养肉汤培养基中，置37℃孵箱培养18h。取出，划线于血平皿上，37℃孵箱培养18h，取出，用6ml 5％的胃膜素洗脱菌落，用生理盐水配成0.75ml/ml、0.25ml/ml、0.15ml/ml、0.083ml/ml浓度菌液备用。
3.2.2金黄色葡萄球菌感染小鼠死亡率预实验取ICR小鼠40只，♀♂各半，体重18-22g随机分组，每组1个浓度，腹腔注射金黄色葡萄球菌菌液，0.5ml/只鼠，观察感染小鼠死亡数，结果感染小鼠死亡率分别为100％，100％，90％，70％。实验选用0.11ml/ml浓度菌液。
3.2.3对金黄色葡萄球菌感染小鼠的保护作用取18-22g ICR种小鼠126只随机分组，每组21只，♀♂兼用。(1)空白对照组等量β-环糊精20ml/kg(2)模型对照组等量β-环糊精20ml/kg。(3)双黄连组20ml/kg。(4)金感胶囊I组5mg/kg。(5)金感胶囊II组10mg/kg。(6)金感胶囊III组20mg/kg。以上各组小鼠均灌胃给药，灌胃容量20ml/kg，1次/天×5天，第3天给药1小时后，腹腔注射金黄色葡萄球菌培养液0.5ml/只鼠(除空白对照组)，继续给药2天，观察各组动物7日内死亡情况结果见表2表2金感胶囊对金黄色葡萄球菌感染小数死亡的保护作用组别 动物数 剂量 死亡数存活率存活天数(只)(g/kg)(只) (％) (x±S) P值空白对照组 21 -1模型对照组 21 -1719.04 3.35±2.24双黄连组 21 20ml 9 57.14*5.00±2.43 p＜0.05金感胶囊I组 21 0.0051052.38 4.86±2.44 p＞0.05金感胶囊II组 21 0.0109 57.14*5.10±2.35 p＜0.05金感胶囊III组21 0.0207 66.67**5.23±2.43 p＜0.05模型对照组比较*p＜0.05**p＜0.05实验结果所示金感胶囊10mg/kg和20mg/kg剂量组对金黄色葡萄球菌感染小鼠可降低其死亡率并可延长感染小鼠的存活天数；与模型组比较具有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)提示金感胶囊对金黄色葡萄球菌感染小鼠具有明显的保护作用。
3.2.4肺炎双球菌菌液的制备取肺炎双球菌菌株，用接种环挑少许于营养肉汤培养基中，置37℃孵箱培养18h。取出，划线于血平皿上，37℃孵箱培养18h，取出，用6ml 5％的胃膜素洗脱菌落，用生理盐水配成1ml/ml，0.5ml/ml，0.33ml/ml，0.25ml/ml浓度菌液备用。
3.2.5肺炎双球菌感染小鼠死亡率的预实验取ICR小鼠40只，♀♂各半，体重18--22g随机分组，每组1个浓度，腹腔注射肺炎双球菌菌液，0.5ml/只鼠，观察感染小鼠死亡数，结果感染小鼠死亡率分别为100.0％，90.0％，60.0％，40.0％实验选用0.5ml/ml浓度菌液。
3.2.6.金感胶囊对肺炎双球菌感染小鼠死亡的保护作用。
取18-22g ICR种小鼠126只随机分组，每组21只，♀♂兼用。(1)空白对照组等量β-环糊精20ml/kg(2)模型对照组等量β-环糊精20ml/kg。(3)双黄连组20ml/kg。(4)金感胶囊I组5mg/kg。(5)金感胶囊II组10mg/kg。(6)金感胶囊III组20mg/kg。以上各组小鼠均灌胃给药，灌胃容量20ml/kg，1次/天×5天，第3天给药1小时后，腹腔注射肺炎双球菌培养液0.5ml/只鼠(除空白对照组)，继续给药2天，观察各组动物7日内死亡情况结果见表3表3金感胶囊对肺炎双球菌感染小鼠死亡的保护作用组别 动物数 剂量 死亡数存活率 存活天数(只)(g/kg) (只) (％) (x±S) P值空白对照组 21 -0模型对照组 21 -199.51.81±1.74双黄连组 21 20ml 1242.9*3.81±2.81 p＜0.05金感胶囊I组 21 0.0051338.1 3.52±2.75 p＜0.05金感胶囊II组 21 0.0101338.1 3.71±2.62 p＜0.05金感胶囊III组21 0.0201242.9*3.95±2.95 p＜0.05与模型对照组比较*P＜0.05**P＜0.01实验结果所示金感胶囊20mg/kg剂量组对肺炎双球菌感染小鼠可降低其死亡率，金感胶囊5mg/kg，10mg/kg和20mg/kg剂量组可延长感染小鼠的存活天数；与模型对照组比较具有显著性差异(P＜0.05＝提示金感胶囊对肺炎双球菌感染小鼠具有一定的保护作用。
3.3金感胶囊的体内抗病毒作用[2][3]3.3.1对甲型流感病毒感染小鼠的保护作用(1)血凝试验取36孔微孔板，每孔加入生理盐水0.25ml。第一孔加入10-1病毒尿囊液0.25ml，混匀后，依次取0.25ml置第二孔，稀释至第9孔。第十孔不加病毒尿囊液，作对照。每孔加入0.5％鸡红细胞0.25ml，轻轻摇匀后于室温放置2小时观察结果，记录结果，血凝试验(HA)为640。
(2)甲型流感病毒感染小鼠半数致死量(LD50)滴定。
取ICR小鼠49只，体重13-15g，雌雄兼用，随机分7组，每组7只，取增毒3次的病毒尿囊液，以10倍稀释，每组滴一个病毒浓度，各组小鼠在乙醚浅麻醉下以病毒尿囊液30ul滴鼻，观察14天内死亡数，按Reed和Muench法计算，结果LD50为2.903.3.2金感胶囊对甲型流感病毒感染小鼠的保护作用取ICR小鼠174只，体重12-16g，雌雄各半，随机分6组，每组29只(1)空白对照组等量β-环糊精10ml/kg(2)模型对照组等量β-环糊精10ml/kg(3)利巴韦林组75mg/kg(4)金感胶囊I组5mg/kg(5)金感胶囊II组10mg/kg(6)金感胶囊III组20mg/kg，在乙醚浅麻醉下，以血凝试验640以上的尿囊液，给小鼠滴鼻感染，每鼠30ul，(20个LD50致死量)，观察动物感染后发病及死亡情况，结果见表4。
表4. 金感胶囊对甲型流感病毒感染小鼠死亡的保护作用组别 动物数 剂量 死亡数 死亡率保护率存活天数(只) (mg/kg) (只) (％) (％) (x±s)空白对照组 29 - -模型对照组29 - 21 72.4 27.6 8.58±3.55利巴韦林组29 758 27.5 72.5**10.38±2.71**金感胶囊I组 29 5 14 48.2 51.8 10.93±3.58*金感胶囊II组 29 1012 41.3 58.7*11.17±3.50*金感胶囊III组 29 209 31.0 69.0**12.31±3.72**与病毒对照组比较*p＜0.05**p＜0.01实验结果所示金感胶囊5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg剂量组均可明显延长甲型流感病毒感染小鼠的存活天数，(P＜0.05，P＜0.01＝10mg/kg和20mg/kg剂量组可显著降低甲型流感病毒感染小鼠死亡数，与模型对照组比较具显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)提示金感胶囊对甲型流感病毒感染小鼠具有明显的保护作用。
3.3.3金感胶囊对甲型流感病毒感染小鼠肺指数的影响取ICR小鼠100只，体重13-16g，♂♀各半。随机分5组，每组20只。(1)模型对照组等量β-环糊精 10ml/kg(2)利巴韦林组75mg/kg(3)金感胶囊I组5mg/kg(4)金感胶囊II组10mg/kg(5)金感胶囊III组20mg/kg，以上各组小鼠均灌胃给药，灌胃容量20ml/kg 1次/天×7天，于给药第3天各组小鼠(除空白对照组外)，在乙醚浅麻醉下以病毒尿囊液滴鼻感染小鼠，每鼠30ul(15个LD50攻击量)。继续给药4天，实验前禁食不禁水，实验当日各组小鼠称重，脱颈处死，解剖，观察肺部病变，取全肺称重，计算各鼠肺指数值，肺指数抑制率，比较各组间差异，并取肺用10％甲醛固定，作病理组织学检查，结果见表5。
表5金感胶囊对甲型流感病毒感染小鼠肺指数的影响(x±s)组别剂量 动物数 肺指数值 肺指数抑制率(mg/kg) (只) (g/10g) (％)模型对照组 - 20 0.1676±0.055利巴韦林组 7520 0.1075±0.017**35.86金感胶囊I组 5 20 0.1267±0.034*24.40金感胶囊II组1020 0.1175±±0.019**29.89金感胶囊III组 2020 0.1103±0.020**34.19与病毒对照组比较*p＜0.05**p＜0.01实验结果所示(1)金感胶囊5mg/kg，10mg/kg和20mg/kg剂量组均可明显降低甲型流感病毒感染小鼠的肺指数值，肺指数抑制率为24.40％，29.89％和34.19，提示金感胶囊具有减轻甲型流感病毒感染小鼠肺部病变的作用。
(2)肺部病理学检查报告所示。
①甲型流感病毒肺炎模型组轻度支气管炎，间质性肺炎1例。中度化脓性支气管炎，小叶性肺炎和间质性肺炎改变3例。支气管上皮细胞可见变性、坏死，腔内可见一些脓性渗出物。部分肺组织结构不清，呈实变状。实变区有较多的嗜中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞浸润。上述改变成效叶状分布。实变区周围部分肺泡壁增厚，其内血管扩张充血，亦见少量上述炎细胞浸润，小部分肺泡扩张，呈气肿状。重度化脓性支气管炎，小叶性肺炎和间质性肺炎改变了5例。支气管上皮细胞变性、坏死，腔内可见较多脓性渗出物。病变支气管周围小叶泡周围肺组织结构不清，有大量嗜中性粒细胞、淋巴细胞浸润。部分病变融合实变。实变区周围部分肺泡壁增厚，其内血管扩张，间质有多少不等的上述炎细胞浸润。部分肺泡扩张，呈气肿状。极重度化脓性支气管炎，小叶性肺炎和间质性肺炎改变了1例。支气管上皮细胞明显变性、坏死，腔内可见大量脓性渗出物。病变支气管周围大片肺组织结构不清，呈实变状，实变区有大量嗜中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞浸润。实变区周围部分肺泡壁增厚，其内血管明显扩张、充血，间质有较多上述炎细胞浸润。部分肺泡扩张，呈气肿状。
②利巴韦林组轻度支气管炎，间质性肺炎7例。中度化脓性支气管炎，小叶性肺炎和间质性肺炎3例。
③金感胶囊小剂量组轻度支气管炎，间质性肺炎4例。中度化脓性支气管炎，小叶性肺炎和间质性肺炎6例。
④金感胶囊中剂量组轻度支气管炎，间质性肺炎7例。
中度化脓性支气管炎，小叶性肺炎和间质性肺炎3例。
⑤金感胶囊大剂量组轻度支气管炎，间质性肺炎6例。中度化脓性支气管炎，小叶性肺炎和间质性肺炎4例。
上述结果提示甲型流感病毒感染复制小鼠肺部感染性疾病，可形成各种程度的化脓性支气管炎，小叶性肺尖及间质性肺炎。金感胶囊具有抗甲型流感病毒所致肺部感染疾病的作用。
3.3.4对乙型流感病毒感染小鼠的保护作用。
(1)血凝试验取36孔板，每孔加入生理盐水0.25ml。第一孔加入10-1病毒尿囊液0.25ml，混匀后，依次取0.25ml置第二孔，稀释至第9孔。第十孔不加病毒尿囊液，作对照。每孔加入0.5％鸡红细胞0.25ml，轻轻摇匀后于室温放置2小时观察结果，记录结果，血凝试验(HA)为640。
(2)乙型流感病毒B/京防98-76感染小鼠半数致死量(LD50)滴定。
取ICR小鼠49只，体重13-15g，雌雄兼用，随机分7组，每组7只，取增毒3次的病毒尿囊液，以10倍稀释，每组滴一个病毒浓度，各组小鼠在乙醚浅麻醉下以病毒尿囊液30ul滴鼻，观察14天内死亡数，按Reed Muench法计算，结果LD50为2.60。
3.3.5金感胶囊对乙型流感病毒B/京防98-76感染小鼠的保护作用取ICR小鼠174只，体重12-16g，雌雄各半，随机分6组，每组29只(1)空白对照组等量β-环糊精10ml/kg(2)病毒对照组等量β-环糊精10ml/kg(3)利巴韦林组75mg/kg(4)金感胶囊I组5mg/kg(5)金感胶囊II组10mg/kg(6)金感胶囊III组20mg/kg，在乙醚浅麻醉下，以血凝试验640以上的尿囊液，给小鼠滴鼻感染，每鼠30ul，(20个LD50致死量)，观察动物感染后发病及死亡情况，结果见表6。
表6金感胶囊对乙型流感病毒感染小鼠死亡的保护作用组别 动物数剂量 死亡数死亡率保护率存活天数(只) (mg/kg) (只) (％) (％) (x±s)空白对照组 19 - 0模型对照组 19 - 18 95.0 5.0 7.16±2.28利巴韦林组 19 7510 52.6* 47.4 10.74±3.18**金感胶囊I组 19 5 12 63.2 36.8 9.42±3.68*金感胶囊II组 19 1010 52.6* 47.4 10.68±3.36**金感胶囊III组19 2010 52.6* 47.4 10.21±3.75**与模型对照组比较*p＜0.05**p＜0.01实验结果所示金感胶囊10mg/kg和20mg/kg剂量组均可明显延长乙型流感病毒感染小鼠的存活天数和降低乙型流感病毒感染小鼠死亡数，与模型对照组比较具显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)提示金感胶囊对乙型流感病毒感染小鼠具有明显的保护作用。
3.3.6金感胶囊对乙型流感病毒感染小鼠肺指数的影响取ICR小鼠100只，体重13-16g，♂♀各半。随机分5组，每组20只。(1)模型对照组等量β-环糊精10ml/kg(2)利巴韦林组75mg/kg(3)金感胶囊I组5mg/kg(4)金感胶囊II组10mg/kg(5)金感胶囊III组20mg/kg，以上各组小鼠均灌胃给药，灌胃容量20ml/kg 1次/天×5天，于给药第2天各组小鼠(除空白对照组外)，在乙醚浅麻醉下以病毒尿囊液滴鼻感染小鼠，每鼠30ul(20个LD50攻击量)。继续给药4天，实验前禁食不禁水，实验当日各组小鼠称重，脱颈处死，解剖，观察肺部病变，取全肺称重，计算各鼠肺指数值，肺指数抑制率，比较各组间差异，并取肺用10％甲醛固定，作病理组织学检查，结果见表7。
表7金感胶囊对乙型流感病毒感染小鼠肺指数的影响(x±s)
组别 剂量 动物数 肺指数值 肺指数抑制率(mg/kg) (只) (g/10g) (％)空白对照组 - 16 0.0999±0.009模型对照组 - 14 0.1679±0.047利巴韦林组 75 16 0.1210±0.034**27.93金感胶囊I组5 16 0.1479±0.039 11.91金感胶囊II组 10 16 0.1289±0.032**23.23金感胶囊III组 20 16 0.1295±0.036*22.87与模型对照组比较*p＜0.05**p＜0.01实验结果所示(1)金感胶囊10mg/kg和20mg/kg剂量组均可明显降低乙型流感病毒感染小鼠的肺指数值，肺指数抑制率为23.23％和22.87％，提示金感胶囊具有减轻乙型流感病毒感染小鼠肺部病变的作用。
(2)病理组织学检查结果见附

图14-29。
①正常对照组10例肺组织均呈正常形态。支气管腔内无渗出物，黏膜上皮无变性坏死脱落，管壁及其周围组织无炎细胞浸润；肺泡间隔未增厚，无炎细胞浸润，肺泡腔内无渗出物。
②模型组本组所有肺组织均呈中至重度支气管炎及间质性肺炎，且充血、出血较明显，1/3肺组织为轻至中度肺泡炎。表现为支气管上皮细胞变性、坏死，腔内见坏死细胞及渗出物。病变支气管壁及其周围肺组织结构不清，有多量淋巴细胞、巨噬细胞和少量嗜中性粒细胞浸润。肺泡壁普遍增厚，其内血管扩张，并有多少不等的上述炎细胞浸润，其中部分肺组织肺泡内可见凋亡小体。
③利巴韦林组本组7例肺组织呈轻至中度支气管炎及间质性肺炎，2例较重，1例基本正常。总体病变程度轻于模型组。
④低剂量组本组肺组织亦呈轻至中度支气管炎及间质性肺炎，少数病例较重。但总体病变程度轻于模型组⑤中剂量组本组病变形态与低剂量组相似，总体病变程度略轻。
⑥高剂量组本组病变形态与上述各组相似，但总体病变程度明显轻于上述各给药组。其中3例基本正常。
结论乙型流感病毒感染成功复制小鼠肺炎性病变。主要表现为支气管炎和间质性肺炎。荆芥有抗乙型流感病毒所致肺部感染疾病的作用，高剂量疗效较好。
3.4金感胶囊对小鼠的抗炎作用3.4.1金感胶囊对二甲苯所致的耳肿胀的抗炎作用[5]昆明种雄性小鼠50只，体重25-30g，按体重随机分为5组，每组10只。(1)模型对照组给予等体积的β-环糊精；(2)阿司匹林组600mg/kg；(3)金感胶囊I组5mg/kg；(4)金感胶囊II组10mg/kg；(5) 金感胶囊III组20mg/kg；给药体积20ml/kg，金感胶囊各剂量组当天ig给药45min后，于小鼠右耳两面涂二甲苯0.05ml/只致肿，左耳不涂为正常耳。45min后脱颈椎处死小鼠，用9mm打孔分别在相同部位打下圆片，电子天平称重，每鼠右耳重量-左耳重量＝肿胀度。结果见表8。
表8金感胶囊对二甲苯致小鼠耳肿胀的抗炎作用(X±S)组别 动物数 剂量 耳廓肿胀度(mg) 肿胀抑制率(只) (mg/kg) (％)模型对照组 10 --0.0147±0.0029 ----阿司匹林组 10 600 0.0045±0.0048**69.39％金感胶囊I组 10 5 0.0154±0.0037 -4.76％金感胶囊II组 10 100.0114±0.0033*22.45％金感胶囊III组10 200.0105±0.0031**28.57％与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01结果表明金感胶囊10mg/kg、20mg/kg剂量组可对抗二甲苯所致小鼠耳肿胀，与模型对照组比较有显著性差异(*P＜0.05)。提示金感胶囊具有一定的抗炎作用。
3.4.2金感胶囊对醋酸所致小鼠腹腔毛细血通透性增加的影响[6]昆明种雄性小鼠50只，按体重随机分为5组，每组10只。(1)模型对照组给予等体积的β-环糊精；(2)阿司匹林组600mg/kg；(3)金感胶囊I组5mg/kg；(4)金感胶囊II组10mg/kg；(5)金感胶囊III组20mg/kg；给药体积20ml/kg，金感胶囊各剂量组当天ig给药45min后，尾静脉注射0.5％伊文思蓝生理盐水溶液0.1ml/10g，立即腹腔注射0.6％醋酸0.1ml/10g，20min后，断头放血处死小鼠，剪开腹腔，用5ml生理盐水冲洗腹腔数次，收集洗涤液，离心(1000rpm)5min，在紫外分光光度计590nm处测定吸收度(OD值)。结果见表9。
表9 金感胶囊对醋酸致小鼠毛细血管通透性增加的影响(X±S)动物数 剂量 吸收度组别(只) (mg/kg)(OD值)模型对照组 10-- 0.248±0.088阿司匹林组 106000.128±0.049**金感胶囊I组 105 0.235±0.099金感胶囊II组 1010 0.147±0.067*金感胶囊III组1020 0.133±0.062**与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01结果表明金感胶囊10mg/kg、20mg/kg剂量组可抑制醋酸所致小鼠腹腔毛细血通透性增加，与模型对照组比较有显著性差异(*P＜0.05)。提示金感胶囊具有一定的抗炎作用。
3.5金感胶囊的解热、发汗作用3.5.1金感胶囊对干酵母所致大鼠发热的影响[8]取SD大鼠70只体重200±20g置于实验环境中，实验前2天固定时间用体温计测量大鼠肛温一次，选取体温在正常范围36.6℃-38.3℃内波动的大鼠，于实验前禁食12小时，可自由饮水，实验当日测体温2次，隔2小时一次，选择温差不超过0.3℃的合格大鼠50只，按体重随机分为5组，每组10只。(1)模型对照组给予等体积的β-环糊精；(2)阿司匹林组300mg/kg；(4)金感胶囊I组2.5mg/kg；(4)金感胶囊II组5mg/kg；(5)金感胶囊III组10mg/kg，给药体积20ml/kg，灌胃给药后立刻于大鼠背部皮下注射干酵母(15％)混悬液10ml/kg，然后在1h、2h、4h、6h、8h、10h的时刻测其肛温值，于大鼠背部皮下注射干酵母(15％)混悬液4h后再灌胃给药一次，求出各测定时刻体温相对于正常体温的变化值，以此为纵坐标，以时间为横坐标，作图，观察体温变化情况。见表10。
表10 金感胶囊对干酵母所致大鼠发热的影响(X±S)

与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01表明金感胶囊10mg/kg可降低干酵母所致大鼠体温升高，与模型对照组比较有明显差异，提示金感胶囊具有一定的降低体温作用。
3.5.2金感胶囊对内毒素所致家兔发热的影响[9]选用体重2kg左右的健康家兔置于实验环境中，实验前2天固定时间用体温计测量家兔肛温一次，选取体温范围38.5℃-39.5℃的家兔，耳缘静脉注射内毒素1h后，选择温差超过1.0℃的发热家兔40只，随机分5组，(1)模型对照组给予等体积的β-环糊精；(2)阿司匹林组300mg/kg；(3)金感胶囊I组6mg/kg；(4)金感胶囊II组3mg/kg；(5)金感胶囊III组1.5mg/kg，灌胃给药，给药体积1ml/kg，然后在1h、2h、3h、4h、5h、6h的时刻测其肛温值，求出各测定时刻体温相对于正常体温的变化值，以此为纵坐标，以时间为横坐标，作图，观察体温变化情况，见表11。
表11 金感胶囊对内毒素所致家兔发热的影响(X±S)动物数 剂量 药前体温药后体温(Δ℃)组别(只) (mg/kg) (℃) 1h 2h 3h 4h 5h 6h40.52±0.39 40.90±0.48 41.22±0.3840.72±0.5940.19±0.4939.72±0.39模型对照组 8 - 39.10±0.19(1.42±0.35)(1.80±0.50)(2.12±0.37) (1.62±0.58) (1.08±0.50) (0.62±0.41)39.35±0.2140.22±0.16 40.20±0.28**40.31±0.68**40.00±0.62*39.61±0.38*阿司匹林组 8 300 39.21±0.11(0.14±(1.02±0.22*) (0.99±0.35**) (1.11±0.75**)(0.77±0.69*) (0.41±0.44*)0.21*)金感胶囊I 40.80±0.45 40.81±0.45 41.31±0.5940.75±0.6040.16±0.4939.78±0.428 1.5 39.22±0.12组(1.58±0.49)(1.59±0.47)(2.09±0.60) (1.53±0.54) (0.94±0.43) (0.56±0.34)金感胶囊II40.60±0.47 40.65±0.32 41.02±0.4640.44±0.5539.90±0.3439.52±0.338 3 39.06±0.23组(1.54±0.41)(1.59±0.25)(1.97±0.50) (1.38±0.54) (0.84±0.33) (0.47±0.35)金感胶囊III 40.86±0.34 40.74±0.33 40.62±0.52*40.14±0.4439.81±0.4839.49±0.268 6 39.26±0.10组(1.60±0.31)(1.47±0.33)(1.36±0.52**)(0.87±0.47*) (0.55±0.53) (0.22±0.30)与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01结果表明金感胶囊6mg/kg可降低内毒素所致兔体温升高，与模型对照组比较有明显差异，提示金感胶囊具有一定的降低体温作用。
3.5.3金感胶囊对大鼠足趾部汗液分泌的影响[10]取体重相近的雄性大鼠50只，分别观察足底部有无污物，如有污物，用棉签蘸取无水乙醇轻轻擦洗干净。随机分为5组，(1)模型对照组给予等体积的β-环糊精；(2)三九感冒灵组500mg/kg；(3)金感胶囊I组10mg/kg；(4)金感胶囊II组5mg/kg；(5)金感胶囊III组2.5mg/kg，给药体积20ml/kg，灌胃给药45min后，分别置于自制的大鼠固定器内固定，暴露双下肢，用干棉签轻轻拭干原有和挣扎所致的汗液。然后分别于每鼠足趾部皮肤涂上和田-高氏试剂A液。待充分干燥后，再薄薄涂上B液，然后用放大镜观察深紫色着色点(即汗点)，记录5min内大鼠出汗的点数，见表12。观察后随即取下大鼠一侧足，用10％福尔马林固定，作病理组织学检查，观察各组大鼠汗腺上皮细胞变化。
表12 金感胶囊对大鼠足趾部汗液分泌的影响(X±S)动物数 剂量组别5min内出汗点数(只) (mg/kg)模型对照组 10 -- 186.4±63.42三九感冒灵组 10 500 288.0±66.42**金感胶囊I组 10 2.5 238.6±88.31金感胶囊II组 10 5263.6±81.59*金感胶囊III组10 10 262.8±41.66**与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01病理结果如下，并见附图30～34。
①模型对照组各取材点大鼠皮肤完整，皮下汗腺组织结构清晰完好，周围组织无明显出血及炎细胞浸润。
②三九感冒灵组各取材点大鼠皮肤完整，皮下汗腺组织结构清晰完好，汗腺腺泡数目较模型组有明显增加(++- +++)，周围组织无明显出血及炎细胞浸润。
③小剂量组各取材皮下汗腺组织结构清晰完好，汗腺腺泡数目较模型组有所增加(+- ++)，周围组织无明显出血及炎细胞浸润。
④中剂量组各取材点大鼠皮肤完整，皮下汗腺组织结构清晰完好，汗腺腺泡数目增加同小剂量组(+- ++)，周围组织无明显出血及炎细胞浸润。
⑤大剂量组各取材点大鼠皮肤完整，皮下汗腺组织结构清晰完好，汗腺腺泡数目有明显增加(++- +++)，周围组织无明显出血及炎细胞浸润。
实验结果表明金感胶囊20mg/kg、10mg/kg剂量可促进大鼠足趾汗腺的分泌，与模型对照组比较有显著性差异，提示金感胶囊具有一定的促进发汗作用。
参考文献[1]陈奇主编《中药药理研究方法学》，人民卫生出版社，北京2000，P251，P275[2]刘劲松、齐方埠、贺蕊等。荆防口服液抗病毒作用的研究，中药药理与临床1998，14(1)41[3]杜平主编《医用实验病毒学》人民军医出版社，北京1985，9，第一版P111[4]朱萱萱、徐立、方泰惠 肺毒清抗菌抗病毒实验研究，中药新药与临床药理2001(12)4 P263[5]陈奇主编.中药药理实验方法，第1版.北京人民卫生出版社199470[6]陈奇主编.中药药理实验方法，第1版.北京人民卫生出版社199472[7]陈奇主编.中药药理实验方法，第1版.北京人民卫生出版社1994107[8]陈奇主编.中药药理实验方法，第1版.北京人民卫生出版社199452[9]李仪奎、王钦茂.中药药理实验方法学[M].上海上海科学技术出社.1991.311-313[10]陈奇主编.中药药理实验方法，第1版.北京人民卫生出版社19944

本发明公开了一种荆芥挥发油及其制剂的制备方法和药效学作用。以荆芥穗为原料，加水，蒸馏，分离得含水荆芥挥发油，冰冻后，去冰除水，即得荆芥挥发油，再以荆芥挥发油为活性物质加入不同剂型的辅料，可制成各种剂型，为胶囊剂(硬胶囊剂、软胶囊剂)、喷雾剂。荆芥挥发油及其制剂—金感胶囊、清菲软胶囊均具有较好的抗炎、解热、发汗抗菌和抗病毒作用，且具有使用剂量小的优点。