专利名称：一种紫云蛤科贝类线粒体coi基因扩增引物的制作方法紫云蛤科(Corbiculacea)隶属于双壳纲(Bivalvia),异齿亚纲(Heterodonta),帘蛤目(Veneroida)，全部海产，广泛分布于中国沿海，日本、菲律宾和印度洋。该科贝类种类较多，中国已知约25种，通常埋栖于潮间带至浅海细沙或泥沙质海底。紫云蛤科的贝类多数肉质鲜美，营养价值高，具有重要的经济价值。例如，中国紫蛤、双线紫蛤、紫彩血蛤和尖紫蛤都是名贵的海珍品。然而由于紫云蛤科种类的贝壳外部形态高度可塑性和外套窦形 态高度相似性，利用形态特征对紫云蛤科进行物种分类和系统发育的分析变得异常困难，特别对于一些亲缘物种，单利用形态学数据很难区分开来。而且，近年来由于过度捕捞等原因，其种质资源已明显消退，紫云蛤种质资源合理利用和保护亟不可待。关于紫云蛤的增养殖和生物学特征等方面研究已有报道，但是基于分子标记的遗传多样性的研究开展较少，这种现状极大的阻碍了紫云蛤种质资源的开发利用和保护。线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)因其单亲遗传、无重组、中性进化等特性,在分子遗传学研究中发挥着重要作用。其中，COI基因作为进化速率相对较快的区域，在无脊椎动物系统分类、种类鉴别、群体遗传多样性和分子进化方面得到广泛应用，已成为区分物种和研究物种进化关系的理想基因。因此，利用mtCOI基因对紫云蛤科进行物种鉴定和系统发育分析是一种很好的方法。由于Folmer (1994)设计的通用引物C0IL1490和C0IH2198在紫云蛤中扩增结果不理想(即琼脂糖电泳检测大部分个体无扩增条带)，因此，开发研究紫云蛤科线粒体COI基因扩增专用引物，对利用分子方法鉴定紫云蛤科物种和进行系统发育分析具有重要的意义，同时也能为利用COI基因保护紫云蛤科种质资源提供技术条件。
本发明的目的是提供一种紫云蛤科线粒体COI基因适用性好的扩增引物，它能满足现有技术的上述需求。本发明根据紫云蛤科物种mtCOI序列变异度较高和非特异性扩增引物扩增效率低的特性，通过重复试验筛选出紫云蛤科mtCOI基因的扩增引物。采用本发明的紫云蛤科线粒体mtCOI基因的扩增引物，可以有效的扩增出紫云蛤科不同物种的COI序列，对于利用COI序列研究紫云蛤科的物种分类、系统发育、系统地理学和保护紫云蛤科种质资源具有重要意义。HC02198R 5，-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3 ’对上述采集的紫云蛤科200个个体进行PCR扩增。不同物种的PCR热循环退火温度不同，退火温度范围为42 56°C。扩增产物经I. 5倍的琼脂糖电泳检测后，送往测序公司进行双向测序。用Lasergene软件将测得的序列进行人工矫正。最终获得5个种类64个个体的COI序列，其长度约为650bp，其余个体均未扩增出。3.序列比对利用CLUSTALW软件将上述测得的64个个体的COI序列进行比对，找出比较保守、碱基变异度最小的序列片段。4.弓丨物合成根据上述的比对结果,利用引物设计软件Primer Primer5在碱基变异度最小的序列片段设计出3对扩增引物。5.引物扩增将上述设计的6对扩增引物分别应用于PCR扩增所采集的紫云蛤科10个种类的200个个体。不同物种的PCR热循环退火温度不同，PCR热循环退火温度范围为48 54°C。扩增产物用I. 5倍的琼脂糖电泳进行检测。6.引物扩增结果上述3对扩增引物均可扩增出上述紫云蛤科个体，I对引物能扩增出72个个体，I对引物只能扩增出120个个体，另一对引物能够扩增出185个个体，扩增效果非常好。特异性扩增引物序列经过大量的重复试验，最终筛选出上述扩增紫云蛤科COI基因效果最好的一对引物序列为C0IZGF(5’ -ACAAATCATTAAGGATAITGG-3’)、C0IZGR(5’ -GTCCGAAGAATCAAAACAAATG-3’ )。利用此对引物扩增出的DNA片段长度约为650bp。7.特异性扩增引物扩增条件上述COIZGF与COIZGR扩增引物的10 U LPCR反应体系为1 U LlOXbuffer Mg2+, I u L DNTP (2mM), 0. 6 u L Mgcl2 (25mM)，I y L 弓I 物COIZGF (10 iiM)，Iii L 引物 COIZGR (IOiiM)，0.08 ii L r-Taq (5u/ u L), I U L DNA 模板，4.32 u L双蒸水。PCR热循环的退火温度为48 54°C。


本发明利用由通用引物扩增得到的64条紫云蛤科序列，利用CLUSTALW软件比对分析，在确定的保守区域用引物设计软件Primer Premier 5设计多对引物，用200个紫云蛤科个体在10μl体系下反复进行PCR反应试验，最后经琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出一种紫云蛤科贝类线粒体COI基因序列高效扩增引物，其特征是COIZGF5’-ACAAATCATTAAGGATATTGG-3’COIZGR5’-GTCCGAAGAATCAAAACAAATG-3’采用本发明的紫云蛤科贝类线粒体COI引物，可以有效地扩增出紫云蛤科贝类不同物种的目的片段，扩增效率大于90％，能够满足紫云蛤科遗传多样性研究的需要，对紫云蛤科的资源保护和利用、多样性评估、遗传育种等方面将起到重要作用。