二甲基亚砜在控制细菌感染中的应用的制作方法【技术领域】，具体涉及二甲基亚砜DMSO在控制细菌感染中的应用。【背景技术】[0002]细菌抗药性的产生限制了人们治疗细菌感染性疾病的能力，对人类健康造成了严重的威胁。多重耐药性病原菌大量涌现的原因一方面由于近些年来人们对抗生素的盲目滥用，另一方面是由于传统抗生素本身抑菌及杀菌的作用机制而导致的。传统抗生素是以抑制细菌的生长或生存为作用靶点的，这给细菌本身生存带来了很大的压力，因此导致了细菌耐药性的产生。病原 菌耐药性的不断蔓延使很多传统抗生素在临床疾病的治疗中失去了作用，人们对新型抗生素的需求非常的迫切，因此寻找新型抗感染类药物成为当今生物及医学界非常紧迫的课题之一，而且对于新型抗生素的寻找需要新的研究角度和研究方法。[0003]目前临床应用的抗生素其作用靶点仅限于蛋白合成、细胞壁、DNA复制、细胞膜和叶酸辅酶等等，数量极为有限，而且存在严重的耐药性问题。细菌的致病力是其感染宿主并导致疾病的能力，而细菌的致病力取决于细菌所产生的毒性因子及其损伤宿主的作用机制。病原菌通过释放多种毒素类蛋白破坏宿主细胞的正常生理功能，甚至导致宿主细胞的死亡。近年来研究发现将细菌的致病力作为靶点来开发新型抗生素，可以通过抑制细菌致病性从而达到治疗细菌感染类疾病的目的，而且由于其对细菌的生长不产生影响，因此可以较少或者避免传统抗生素所引起的细菌耐药性问题的出现。[0004]细菌细胞之间存在信号传递系统，这些信号传递系统控制病原菌致病因子的表达及生物被膜的形成，是调节病原菌致病性的枢纽。细菌细胞之间的信号传递系统中，“群体感应调节系统”(Quorum Sensing, QS)，是一种依赖于细胞数量的基因调控系统。系统中由细菌自身所分泌的自诱导物(Autoinducer或Al)随细菌数量的增加而变化，当细菌数达到一定数量时，系统中的自诱导物达到一定的浓度阈值，即可以与一类转录调节蛋白结合，开始诱导或抑制细菌多种基因的表达，使细菌表现多细胞特性的群体行为。QS系统存在于很多细菌当中，革兰氏阴性细菌中大多是利用酰基高丝氨酸内酯作为信号分子，如假单胞菌属中的铜绿假单胞菌。对以酰基高丝氨酸内酯(acyl homoserine lactones, AHLs)为信号分子的QS系统的研究最为成熟，研究表明QS系统可以调节细菌多个基因的表达，其中包括细菌致病因子、细胞毒素、生物被膜形成等一系列细菌特征性的表型。所以细菌的群体感应系统相关基因的表达对细菌的致病过程起着关键性作用，与细菌致病力有着非常重要的关系。因此抑制细菌QS系统及其相关毒性因子的表达，可以在不损害人体自身正常菌群的情况下扩大药物治疗细菌性感染疾病的作用靶点，具有较大的开发潜力。[0005]二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMS0),为无色液体,几乎无臭,略带苦味,是一种重要的极性有机溶剂，它可与许多有机溶剂及水互溶。药用DMSO主要用于医药及中间体合成反应溶剂，医药溶剂及药物的载体等，DMSO可以溶解多种药物，并增加其渗透性，从而可以增加药物吸收和提高疗效，而且其本身毒性很低，亦具有消炎、止痛，促进血液循环和伤口愈合、利尿、销静的作用，在国外被叫做“万能药”。此外，有研究表明DMSO对神经性皮炎、牛皮癣、关节炎、类风湿、扭伤、腰肌劳损、烧伤等等都具有疗效。但并未有报道DMSO在抑制细菌毒性相关基因、细菌致病性的相关研究以及治疗细菌感染性疾病中的应用。
[0006]本发明为了解决【背景技术】中存在的上述技术问题，从“抗细菌致病性”角度出发寻找新型抗生素物质。通过抗致病物质检测系统(利用荧光素酶luxCDABE标记铜绿假单胞菌多种致病因子，通过化学发光反应致病因子的表达)进行基因表达监测，研究发现一定浓度范围的DMSO溶液在不抑菌及杀菌的条件下可明显抑制细菌致病因子的表达，可以抑制致病相关表型，并具有抗细菌感染作用，可以作为新型抗菌药物应用于临床治疗。
[0007]本发明的技术解决方案为:
[0008]二甲基亚砜在控制细菌感染中的应用，细菌为革兰氏阴性细菌。
[0009]细菌为假单胞菌属。
[0010]细菌为铜绿假单胞菌。
[0011]基于二甲基亚砜实现控制细菌感染的方法，包括以下步骤:
[0012]I】准备原材料:
[0013]二甲基亚砜液体；体积浓度百分比为0.01%-10% ；
[0014]2】给药:
[0015]将二甲基亚砜液体通过外敷或冲洗到细菌感染处，实现控制细菌感染。
[0016]二甲基亚砜液体；体积浓度百分比为0.5%_3%。
[0017]二甲基亚砜液体；体积浓度百分比为2%。
[0018]本发明所具有的优点:
[0019]本发明从“抗细菌致病性”角度出发寻找新型抗生素物质。DMSO在其不抑菌、杀菌的前提下，可以抑制病原菌的致病力，不会给细菌本身带来生存压力，因此可以较少或者避免耐药性的产生，因此利用DMSO治疗细菌感染类疾病有助于解决临床上细菌耐药性带来的难题。
[0020]同时，DMSO作为抗致病物质治疗细菌感染类疾病，将不会像传统抗生素那样影响人体的正常微生物群体，而人体正常微生物群体对人体健康有着非常重要的作用。



[0021]图1、图2、图3为DMSO对铜绿假单胞菌phzAl和phzA2基因表达及其产物绿脓菌素产量的抑制结果示意图；其中:液体培养酶标仪检测2%(v/v)DMSO对PAOlphzAl (图1)和phzA2 (图2)基因表达的影响；(图3) DMSO对绿脓菌素产量的影响，*代表DMSO组与对照组相比具有显著性差异，P=0.003<0.01。
[0022]图4、图5为DMSO对铜绿假单胞菌IasB基因表达及其产物弹性蛋白酶产量的抑制结果示意图；其中(图4)液体培养酶标仪检测2%(v/v)DMS0对IasB基因表达的影响；(图5) DMSO对弹性蛋白酶产量的影响，*代表DMSO组与对照组相比具有显著性差异，p=0.0088<0.01 ；
[0023]图6、图7为DMSO对铜绿假单胞菌rhlA基因表达及其产物鼠李糖脂产量的抑制结果示意图；其中(图6)液体培养酶标仪检测2%(v/v)DMS0对rhlA基因表达的影响；(图7) DMSO对鼠李糖脂产量的影响，*代表DMSO组与对照组相比具有显著性差异，P=0.0037〈0.01 ；
[0024]图8、图9为DMSO对IasA基因表达及其产物LasA蛋白产量的抑制结果示意图；其中(图8)酶标仪检测液体培养下2%(v/v)DMSO对IasA基因表达的影响；(图9) DMSO对LasA蛋白产量的影响；
[0025]图10为DMSO抑制铜绿假单胞菌生物膜形成的示意图，其中DMSO浓度为2%(v/v)，*代表DMSO组与对照组相比具有显著性差异p=3.97541E-05〈0.001。

[0026]实施方式概括为:利用荧光素酶(Luciferase)基因(luxCDABE)标记的铜绿假单胞菌毒性相关基因为基因表达检测系统，利用酶标检测仪检测在DMSO存在的条件下铜绿假单胞菌毒性相关基因表达的变化；并同时检测在DMSO作用下铜绿假单胞菌与致病性相关表型的变化，如绿脓菌素、弹性蛋白酶、鼠李糖脂以及细菌生物被膜的形成等等。结果发现DMSO在不影响细菌生长的条件的下对铜绿假单胞菌(PA)致病因子有明显的抑制作用，并通过一系列的动物实验验证了 DMSO治疗细菌感染的有效性。
[0027]具体通过以下实施例而得到的:
[0028]实施例1:细菌抗致病物质检测系统的构建
[0029]检测系统的具体原理为:通常基因表达的强弱取决于基因本身启动子的强弱，毒性相关基因的启动子连接于无启动子的报道基因荧光素酶基因luxCDABE之前，从而启动报道基因的表达。若待测药品对毒性因子的启动子有抑制作用，报道基因的表达也会减弱，即菌体发光减弱；反之，若对启动子有激活作用，则菌体发光增强。通过表观上菌体发光的变化可知DMSO对毒性因子表达的影响情况。
[0030]研究所应用的检测系统的毒性因子包括phzAl、phzA2、Ias1、lasR、rhll、rhlR、fliC、pilG、lasA、lasB、rhlA等等。其中IasR和rhlR为铜绿假单胞菌群体感应系统(QS)的上游调控基因，IasI和rhll为信号分子合成的催化酶基因，这些毒性因子的表达对铜绿假单胞菌致病过程起到非常重要的作用。
[0031]具体实施方法为:质粒pMS402是带有缺失启动子的报道基因luxCDABE的载体。毒性相关基因的启动子区域分别经PCR扩增、酶切克隆到报道质粒pMS402荧光素酶基因操纵子前，构成重组质粒。并利用CTX6.1载体将重组质粒整合于细菌染色体之上，构建抗致病物质检测系统。
[0032]实施例2 =DMSO对铜绿假单胞菌毒性因子表达的影响
[0033]通过实验结果发现10%浓度以下的DMSO对铜绿假单胞菌的生长没有明显的抑制作用。实施方案以2%浓度为例，研究DMSO在不影响细菌生长的条件下对多种毒性因子表达的影响。
[0034] 具体通过酶标检测仪进行基因表达检测:将检测菌株在LB固体培养基上划线、37 °C过夜培养。挑取单克隆接种到含100 μ LLB培养基的白色96孔板中，37°C、200rpm培养12h。然后按5%接种量转接到新鲜LB培养基中，活化3h，取95 μ L含有2% (v/v) DMSO或不含有DMSO (对照组)的新鲜LB培养基于已灭菌的黑色底部透明的96孔板中，同时加入5 μ L活化后的菌液。最后每孔用50 μ L矿物油覆盖，置于多功能酶标仪Synergy2上，每隔0.5h测定其CPS值和OD600值，共测24ho
[0035]实验发现DMSO对铜绿假单胞菌多种毒性因子的表达有明显的抑制作用，具体结果见表1。
[0036]表1.DMSO对铜绿假单胞菌毒性相关基因表达的抑制
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