专利名称：一种提取动物组织样品中病原核酸的试剂的制作方法近年来，甲型Hmi流感、禽流感等烈性人畜共患病在世界上呈现爆发性流行，在国内已经造成了一定的经济损失，而且时刻威胁着国人的健康；非洲猪瘟、裂谷热等动物疫病已经逼近国境，尼帕病毒、裂谷热等新的动物源性人畜共患病在我国周边国家时有爆发等等。这一系列跨国境传播的潜在动物疫病，给我国防范高风险动物疫病在国内流行提出了严峻的考验。与此同时，随着我国外交外贸事业的发展，进出境动物及动物产品数量逐年增多，为防止口岸动物疫情传入传出，保障我国畜牧业生产安全以及国民身体健康，提高我国动物及其动物产品的国际竞争能力和适应“快检快放”大通关的需求，提高动物疫病口岸检出率，从而提高我国检验检疫系统的检疫把关能力非常必要。目前，对动物疫病的检测主要依据的是分子生物学的技术，而分子生物学的基础是核酸抽提。其中酚抽提法、异丙醇沉淀法、甲酰胺裂解法及TriZol法是比较经典的核酸抽提方法，目前很多方法的改进都是在这些方法的基础上进行的，前面三种方法均是利用蛋白酶K和十二烷基硫酸钠(SDQ消化破碎细胞，而TriZol法是用异硫氰酸胍消化破碎细胞。细胞破碎后甲酰胺法是利用高浓度的甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，然后利用透析来处理DNA样品，但其它三种方法则是先用酚/氯仿去除蛋白质，再分别用乙醇或异丙醇沉淀DNA。这些经典方法获得的核酸纯度比较高，基本能满足后续PCR及酶切等各种试验的要求，但存在很多缺陷一是整个操作过程用时长，消化破碎细胞需放置2-3个小时或过夜； 二是操作繁琐，需酚等有机试剂反复抽提以除去蛋白，且Trizol法还需要低温4°C离心 ’三是缺少能够更好的配合环介导等温扩增技术(LAMP)等口岸核酸快速检测技术的简便快速的核酸提取方法；四是提取效率受限，不能满足实验室核酸提取的精准要求。
本发明的目的在于提供一种简单、安全、快速的动物组织样品中携带病原核酸的提取试剂，以克服上述不足。本发明的另一目的在于提供一种利用上述试剂提取动物组织样品或细胞培养液中病原核酸的方法。异硫氰酸胍是一种白色结晶性粉末，有刺激性，对光敏感，溶于乙醇和水，熔点 118°C。用于变性裂解细胞和提取RNA和DNA，且无RNA酶和DNA酶活性。柠檬酸钠为无色或白色结晶颗粒或结晶性粉末，无嗅、味咸、凉、易溶于水、难溶于乙醇，过热分解，熔点 150°C (此温度时失去结晶水)，溶液pH值约为8，柠檬酸钠安全无毒，具有金属离子络合能力和良好的PH调节及缓冲性能，还具有优良的缓凝性能及稳定性能，作为抗氧化剂抗凝剂广泛应用于化工和医药行业。十二烷基肌氨酸钠(SLQ为白色粉末，易溶于热水，属阴离子表面活性剂，具有优异的渗透、洗涤、润湿、去污和乳化作用。本发明根据上述化学试剂的特性，研制了一种核酸的提取试剂，其配方为溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质4M-6M异硫氰酸胍，20mM-25mM柠檬酸钠，质量百分比 0. 2% -0. 5%的 SLS。优选地，本发明提供的核酸提取试剂，其配方为溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质6M异硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠，质量百分比0. 5%的SLS。本发明提供了上述试剂在提取动物组织样本和/或细胞培养物中DNA和/或RNA 的应用。本发明提供的试剂，其PH值为7-9。当用于提取DNA时，所述试剂pH值为8-9，或，用于提取RNA时，所述试剂pH值为7。本发明提供了一种提取动物组织样品中携带的病原核酸的方法，包括如下步骤(1)动物组织预处理；(2)裂解组织样本在预处理后的动物组织中加入本发明的试剂，上下颠倒混勻；(3)将样品室温放置10-30min后，15_25°C，13000g离心5min，去除杂质；(4)核酸沉淀将步骤(3)的上清液转移到新管，加入异丙醇，异丙醇加入量为步骤O)中试剂加入量的一半，来回颠倒混勻，IOOOOg离心8-lOmin，弃去上清；加75%乙醇洗涤核酸沉淀，5000g离心3min，倒去上清，室温干燥2_;3min ；(5)加入无核酸酶的无菌水溶解核酸沉淀，55°C放置2min。。其中，步骤(1)所述的动物组织预处理方法为勻浆或液氮研磨。其中，步骤(2)试剂的用量为30_70mg动物组织中加入ImL本发明提供的提取动物组织样品中病原核酸的试剂。其中，步骤(3)所述的杂质为未消化的组织及蛋白。本发明还提供了一种提取细胞培养液中病原核酸的方法，其包括如下步骤(1)加入本发明的试剂于细胞培养液，添加体积比为5 1 ；(2)将混合液室温放置10-30min后，15_25°C，13000g离心5min，去除杂质；(3)核酸沉淀将步骤O)的上清液转移到新管，加入异丙醇，异丙醇加入量为步骤O)中试剂加入量的一半，来回颠倒混勻，IOOOOg离心8-lOmin，弃去上清；加75%乙醇洗涤核酸沉淀，5000g离心3min，倒去上清，室温干燥2_;3min ；(4)加入无核酸酶的无菌水溶解核酸沉淀。所述加入无菌水的量与步骤O)中所加提取核酸试剂的量相同，55°C放置aiiin。本发明提供的试剂应用于提取动物组织样品或细胞培养液中病原核酸，消化破碎细胞的时间短，15min左右，操作简单，且提取效率高。与现有的核酸提取方法相比，本发明提供的试剂及方法能快速的提取高质量的核酸，能同时满足快速和高效两个方面，因此能够更好的配合LAMP等快速检测技术应用于现场检疫工作中。本发明中的核酸提取试剂具有简单、快速、安全的特点，可应用于动物疫病的实验室检测和口岸检验检疫。图1显示的是采用本发明实施例1提供试剂提取蛤组织中派琴虫DNA进行PCR的扩增产物电泳图，其中M.为2000bp的Marker ； 1-4.为样品1_4的PCR的扩增结果；阴性对照为已知未感染派琴虫的蛤组织DNA的PCR的扩增结果；阳性对照为派琴虫DNA的PCR的扩增结果；图2显示的是采用Trizol法提取蛤组织中派琴虫DNA进行PCR的扩增产物电泳图，其中M.为2000bp的Marker ； 1-4.为样品1_4的PCR的扩增结果；阴性对照和阳性对照同图1 ；图3显示的是采用本发明试剂及方法提取细胞培养液中口蹄疫病毒RNA进行 RT-PCR的扩增产物电泳图，其中M.为2000bp的Marker ； 1-4.为样品1_4的RT-PCR扩增结果；阴性对照为未接毒细胞RNA的RT-PCR扩增结果；阳性对照为口蹄疫病毒RNA的RT-PCR 扩增结果；图4显示的是采用Trizol法提取灭活口蹄疫病毒细胞培养液RNA进行RT-PCR的扩增产物电泳图，其中M.是2000bp的Marker ； 1-4.为样品1-4的RT-PCR扩增结果；阴性对照和阳性对照同图3 ；图5显示的是阳性口蹄疫模拟病料提取RNA进行RT-PCR的扩增产物电泳图，其中 M.是2000bp的Marker ； 1-4.为样品1_4的RT-PCR扩增结果；阴性对照为已知未感染口蹄疫的组织RNA的RT-PCR扩增结果；阳性对照为口蹄疫病毒RNA的RT-PCR的扩增结果；图6显示的是采用Trizol法提取灭活口蹄疫病毒细胞培养液RNA进行RT-PCR的扩增产物电泳图，其中M.是2000bp的Marker ； 1-4.为样品1-4的RT-PCR扩增结果；阴性对照和阳性对照同图5。滤除菌，获得滤液。3、提取病原核酸试剂的配制称取35. 448g异硫氰酸胍放入无菌试剂瓶中，加入 1. 667mL 0. 75M柠檬酸钠(pH7. 0)溶液，2. 5mL10% SLS。用NaOH调节pH至8. 7，用无菌水定容至50mL。各溶质终浓度分别为6M异硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠，0.5% SLS。常温放置实施例2提取病原核酸试剂的制备1,0. 75M柠檬酸钠(ρΗ7· 0)的配制同实施例1。2、10% SLS的配制同实施例1。3、提取病原核酸试剂的配制称取异硫氰酸胍放入试剂瓶中，加入1. 533mL 0. 75M 柠檬酸钠(ρΗ7· 00)溶液，1. 5mL10% SLS。用 NaOH 调节 pH 至 7. 0，用无菌水定容至50mL。各溶质终浓度分别为5M异硫氰酸胍，23mM柠檬酸钠，0.3% SLS。常温放置备用。实施例3提取病原核酸试剂的制备1,0. 75M柠檬酸钠(ρΗ7· 0)的配制同实施例1。2、10% SLS的配制同实施例1。3、提取病原核酸试剂的配制称取23. 632g异硫氰酸胍放入试剂瓶中，加入 1. 333mL 0. 75M(pH7. 00)柠檬酸钠溶液，ImLlO % SLS0用NaOH调节pH至7. 0，用水定容至 50mL。各溶质终浓度分别为4M异硫氰酸胍，20mM柠檬酸钠，0. 2% SLS0实施例4蛤组织中派琴虫基因组的提取与PCR检测1、提取蛤组织中的DNA的方法(1)随机挑取4个蛤仔样品分别称取鳃组织50mg，用手持勻浆仪勻浆，加入ImL实施例1制得的试剂，若溶液中还有肉眼可见的肉块，继续用勻浆仪勻浆。(2)室温放置1511^11，231，1300(^离心51^11，，弃沉淀，取上清移。(3)上清液中加0. 5mL异丙醇，23°C，IOOOOg离心lOmin，弃上清。(4) 1. 5ml 75% 乙醇洗涤 DNA 沉淀。(5)加入50 μ L无菌水55°C放置2min，溶解核酸沉淀。(6)取2μ L核酸样品采用NanoDrop DL-1000分光光度计测浓度。浓度见表1。(7)按照Trizol试剂提取说明书，采用Trizol法提取上述四份蛤组织样品1_4中派琴虫DNA。取2 μ L核酸样品采用NanoDrop DL-IOOO分光光度计测浓度。浓度见表1。 可见，本发明实施例1的试剂提取蛤仔样品中派琴虫DNA的浓度高于传统的Trizol法，且操作简便，快速，提取时间在40min内即可完成，大大缩短了传统方法提取核酸(传统方法提取核酸所需时间为2-3h)的时间。
表1本发明试剂和Trizol试剂分别提取四份蛤仔样品核酸的浓度对比
^Baammmim...................................................
样品1 样品2 样品3 样品4
？M (ngiiL)97.5102.298.6112.9■賦剂OD260nm/280nm1.871.851.891.85Trizd礎丨J？M (ngiiL)85.088.286.586.0OD260nm/280nm1.841.871.8 61.902、采用PCR方法检测提取的DNA(I)OIE推荐的派琴虫通用PCR引物序列如下Primer PerkITS-85 (5，-CCGCTTTGTTTGGATCCC-3，)Primer PerkITS-750 (5，-ACATCAGGCCTTCTAATGATG-3，) 引物合成后，用ddH20稀释至lOpmol/L，_20°C保存备用。 (2)以实施例1制得的试剂提取的上述4份DNA为模板，分别进行PCR扩增反应，
25 μ L反应体系
10XPCR Buffer 2. 5 μ L，dNTP (各 2. 5mM) 2 μ L，上下游引物(10 μ Μ)各 1 μ L， rTaq (5U/ μ L) 0. 5 μ L，模板 2 μ L，ddH20 补充至 25 μ L 反应体系。(3)反应程序95 °C 预变性 ^iin ；95°C 变性 lmin，55°C 退火 lmin，65°C 延伸 3min，40 个循环；最后 65 °C 延伸 5min。G)PCR反应结束后，以的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。预期得到的派琴虫目的基因片段大小为67;3bp。采用本发明试剂及PCR方法提取的蛤仔派琴虫核酸PCR扩增产物电泳检测结果见图1。采用Trizol法提取的蛤仔派琴虫核酸PCR扩增产物的电泳检测结果见图2。电泳结果显示，以两种核酸提取方法获得派琴虫总DNA为模板，采用PCR方法扩增得到673bp的基因片段，与预期片段大小一致，说明用本发明实施例1制得的试剂提取动物组织样品中派琴虫的核酸能够用于PCR反应，PCR扩增结果特异、准确。实施例5灭活口蹄疫病毒细胞培养液RNA的提取与RT-PCR检测1、提取口蹄疫病毒细胞培养液中的RNA(1)分4次取灭活口蹄疫病毒细胞培养液各200 μ L，共4份样品，每份加入ImL实施例2制得的试剂。(2)室温放置10min，23°C，IOOOOg离心5min，将上清移至新管。(3)上清液中加0. 5mL异丙醇，23°C，IOOOOg离心8min，弃上清。(4) 1. 5ml 75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀。(5)加入50 μ L无菌水55°C放置2min，溶解核酸沉淀。(6)取2 μ L核酸样品采用NanoDrop DL-1000分光光度计测浓度。浓度见表2。(7)按照Trizol试剂提取说明书，采用Trizol法提取上述四份灭活口蹄疫病毒细胞培养液样品1-4中病毒RNA。取2 μ L核酸样品采用NanoDrop DL-1000分光光度计测浓度。浓度见表2。可见，本发明实施例2的试剂提取细胞培养液中口蹄疫病毒RNA的浓度高于传统的Trizol法，且操作简便，快速，提取时间在40min内即可完成，大大缩短了传统方法提取核酸(传统方法提取核酸所需时间为2- )的时间。表2本发明试剂和Trizol试剂分别提取四份FMDV细胞培养液样品核酸的浓度比较


本发明提供了一种动物组织样品中病原核酸的提取试剂。该试剂pH为7-9，溶剂是水，溶质是如下终浓度的物质4M-6M异硫氰酸胍，20mM-25mM柠檬酸钠，0.2％-0.5％质量百分比的十二烷基肌氨酸钠(SLS)。采用该试剂提取核酸成本低廉，无有毒有害试剂，安全快速，适用于提取动物组织样品中病原核酸。