一种赖氨酸接枝海藻酸盐载体及其制备方法[0002]药物的控制释放也称可控给药体系，由于其对包埋的药物或活性物质具有保护和控制释放速率功能，近十多年来获得了广泛的研究与发展。载体材料的选择是其中研究的一个热点，当前使用的载体材料主要包括天然、半合成和合成高分子三大类，其中海藻酸盐是一种天然的水凝胶高分子材料，由于其遇Ca2+、Ba2+等二价阳离子具有瞬时凝胶化的特点，一直受到研究者的亲睐。[0003]然而海藻酸钙水凝胶遇到螯合化合物(磷酸盐、柠檬酸盐)、非凝胶化离子(钠离子、镁离子)或溶液PH变化时，海藻酸钙凝胶中的钙离子易被置换或发生溶胀，从而使凝胶逐渐转变为液体而产生膨胀破裂的趋势。因此，为了提高海藻酸钙胶珠的稳定性，改善药物控制释放的效果，目前研究者主要采取以下两种解决思路:[0004]一是利用其阴离子特性，在胶珠外层裹上一层阳离子聚合物薄膜或层层自组装形成多层薄膜，该聚合物膜具有稳定海藻酸钙胶珠及调节药物控制释放的功能。当前采用的成膜材料很多，包括聚氨基酸材料和壳聚糖等。[0005]另一个思路则是直接改造基体，将海藻酸钠进行改性，引入新的功能基团，利用海藻酸高分子链间缠结和交联剂与新官能团的相互作用来稳定水凝胶体系，如海藻酸钠的双丙酮丙烯酰胺等。[0006]本发明利用新的合成材料——赖氨酸接枝海藻酸盐(ALG-g-Lys )材料替代海藻酸盐，以获得稳定性和机械强度良好的载体。
[0007]为了获得一种新型的载体，本发明的目的在于将新的合成材料赖氨酸接枝海藻酸盐(ALG-g-Lys)替代海藻酸盐用于载体制备，该载体具有一定的稳定性和药物缓释性能。
[0008]为实现本发明的目的，本发明的技术方案是:利用基体改造思路获得的海藻酸钠改性材料ALG-g-Lys，该材料保持了海藻酸钠的离子凝胶性能，可利用高压静电法制得球形度好且分布均匀的胶珠。再用交联剂(京尼平或戊二醛)交联胶珠，得到结构稳定的微球。
[0009]本发明涉及的制备工艺流程和具体操作步骤如下:
[0010](1)采用高压静电法滴制微球，将ALG-g-Lys溶液通过高压静电装置通过微量注射泵滴入CaCl2溶液中制得ALG-g-Lys微胶珠。
[0011](2)从CaCl2溶液滤出微胶珠，用蒸馏水快速冲洗3次，将收集到的微胶珠转入京尼平或戊二醛水溶液中，置于37°C摇床60rpm交联反应24h。
[0012](3)从溶液中洗涤出微球，用蒸馏水冲洗3次。用乙醇梯度洗脱(60%、80%、100%)，冷冻干燥获得产品，
[0013]其中，本发明步骤(1)中的ALG-g-Lys材料科通过如下方法制备。[0014]A、在海藻酸钠溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl )，搅拌均匀，调节pH为5-6 ;在上述溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，继续搅拌；加入L-赖氨酸盐酸盐(Lys.HCl);用锡箔纸包裹上述溶液，避光条件下磁力搅拌反应18-30小时；
[0015]B、将前溶液转移至透析袋中，置于蒸馏水中透析18-30小时，后置于
0.5-1.5mmol/L的盐酸溶液中透析18-30小时,最后置于蒸懼水中透析60-100小时；将透析完成后的透析袋连同溶液置于高浓度的聚乙二醇(PEG20000)内浓缩；将浓缩液真空冷冻干燥；收集干燥后的材料，即为合成的ALG-g-Lys材料。
[0016]通过此方法获得的ALG-g-Lys载体胶珠圆整，表面光滑，粒度分布较为均匀，平均粒径可控制在100~1000 μ m之间。
[0017]步骤A中，反应物比例为Ivn2为1-2:1，n2:n3为1: Ln1In4 ^ 1:1-2,其中Ii1表示海藻酸钠单体物质的量；n2表示EDC.HCl物质的量；n3表示NHS物质的量，n4表示Lys物质的量。
[0018]在本发明中，步骤(1) ALG-g-Lys溶液浓度(w/v)较佳地为采用1.2%_2.0%。
[0019]在本发明中，步骤(1)电压较佳地为采用5.5kv-9.0kv。
[0020]本发明的优点在于: [0021]本发明制备的赖氨酸接枝海藻酸盐(ALG-g-Lys)载体的特征在于:载体材料可生物降解，其中海藻酸盐为多糖，降解产物可参与人体自身循环；赖氨酸为人体必需氨基酸，兼具营养作用与药理功效。ALG-g-Lys载体相对单纯的海藻酸钙凝胶，稳定性更强，京尼平交联后载体具有荧光特性。

[0022]首先合成Alg-g-Lys
[0023](I)配制1.5% (w/v)海藻酸钠100mL。用电子天平称取1.5g海藻酸钠，再加入IOOmL蒸馏水，置于磁力搅拌器上搅拌至海藻酸钠溶解完全。用正压过滤器过滤海藻酸钠溶液，滤膜的孔径为0.8 μ m和0.45 μ m。
[0024](2)加入EDOHC1。称取EDC.HClL 25g溶解于15mL蒸馏水中，加入到过滤后的IOOmL海藻酸钠溶液中，搅拌均匀,调节pH为5.5。置于磁力搅拌器上搅拌30min。
[0025](3)加入NHS。称取NHS0.38g溶解于IOmL水中，加入到上述溶液，置于磁力加热搅拌器上磁力搅拌30min。
[0026](4)加入 Lys.HC1。称取 1.79g Lys.HCl (nLys.HC1=l.5nl)溶解于 30mL 蒸懼水中，之后加入到前溶液，用lmol/L的氢氧化钠调节溶液pH至7.5。
[0027](5)用锡箔纸包裹上述溶液，避光条件下磁力搅拌反应24小时。
[0028](6)将前溶液转移至提前处理好的透析袋中，置于IOL的蒸馏水中透析24小时，后置于IOL的lmmol/L的盐酸溶液中透析24小时，最后置于10L的蒸馏水中透析72小时。
[0029](7)将透析完成后的透析袋连同溶液置于高浓度(15_20g/L)的PEG20000内浓缩。
[0030](8)将浓缩液置于-20°C冰箱预冻，后于-80°C真空冷冻干燥。收集干燥后的材料，即为合成的ALG-g-Lys材料。
[0031]实施例一:[0032]采用以上的操作步骤制备载体，考察ALG-g-Lys浓度的影响。其中ALG-g-Lys溶液浓度为1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0% (w/v)，用pH7.4的磷酸盐缓冲液溶解。高压静电制备胶珠的条件为:电压为7.8kv,推进速度为30mm/h，针头与液面距为20mm，针头型号为23G针头，CaCl2浓度为2% (w/v)。
[0033]当ALG-g-Lys浓度小于1.6%时(包括1.6%)，胶珠表面均较光滑；当ALG-g-Lys浓度大于1.6%时，胶珠表面较为粗糙。当ALG-g-Lys浓度为1.4%时，胶珠大小较为均匀，且球形度较好，几乎没有拖尾变形。当ALG-g-Lys浓度为1.4%时胶珠粒径最小。
[0034]实施例二:
[0035]具体操作步骤同实施例一，区别在于考察电压的影响，电压设置为5.5kv、6.0kv,
6.5kv、7.0kv、7.5kv、8.0kv、8.5kv、9.0kv0
[0036]在电压为8.0kv的条件下，胶珠粒径最小。当电压小于8.0kv时，胶珠粒径随着电压的增大而减小；当电压大于8.0kv时，胶珠粒径变化不大。
[0037]实施例三:
[0038]具体操作步骤同实施例一，区别在于考察针头内径的影响，针头内径为0.39mm、
0.32mm,0.27mm,0.22mm，对应型号分别为 23G、24G、25G、26G。
[0039]针头内径为23G条件下，胶珠大`小不一，有拖尾现象；针头内径为24G条件下，大胶珠较均匀，小微粒较少，拖尾也较少；针头内径为25G条件下，胶珠拖尾较多，且形状不规则的较多；针头内径为26G条件下，胶珠形状不规则的较多，且小微粒的数目较多。另针头型号为23G的胶珠粒径最大，26G的胶珠粒径最小，总体趋势随着针头内径的减小，胶珠粒径也减小。
[0040]实施例四:
[0041]具体操作步骤同实施例一，区别在于考察注射泵推进速度的影响，推进速度设置为 IOmm/h、20mm/h、30mm/h、40mm/h、50mm/h、60mm/h。
[0042]注射泵推进速度为10mm/h的胶珠形状非常不规则且大小非常不均一；注射泵推进速度为20mm/h的胶珠大小不均匀且有部分拖尾变形；注射泵推进速度为30mm/h的胶珠大球较均匀，小球较少，拖尾也较少；注射泵推进速度为40mm/h的胶珠形状不规则,但小球较少；注射泵推进速度为50mm/h的胶珠形状不规则，大小不均一；注射泵推进速度为60mm/h的胶珠拖尾较多，但小球较少。
[0043]实施例五:
[0044]具体操作步骤同实施例一，区别在于考察不同溶剂的影响，磷酸盐缓冲液的pH分别为 5.0,5.8,6.8,7.0,7.4,7.8。
[0045]pH5.0磷酸盐缓冲液为溶剂的胶珠大小不均，有极少部分变形；pH5.6磷酸盐缓冲液为溶剂的胶珠大小不均，有多数拖尾；PH6.8磷酸盐缓冲液为溶剂的胶珠大小相对较均匀，但是存在许多粒径极小的胶珠；pH7.4磷酸盐缓冲液为溶剂的胶珠大小均匀，球形度好。当溶剂为PH7.4的磷酸盐缓冲液时，胶珠粒径最小；当溶剂为pH6.8的磷酸盐缓冲液时，胶珠粒径最大；当溶剂pH在5.0~5.6时，胶珠粒径变化不大；当6.8<pH<7.4时，胶珠粒径随pH值的增大而减小；当pH>7.4时,胶珠粒径随pH的增大而增大。
[0046]实施例六:
[0047]具体操作步骤同实施例一，区别在于考察交联剂及其浓度影响，戊二醛浓度(v/V)为 0.1%、0.4%、0.8%、1.2%，京尼平浓度(w/v)为 0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%。高压静电制备胶珠条件:电压为8.0kv，针头型号24G，针头与液面距离为20mm，推进速度为30mm/h，ALG-g-Lys 溶液浓度为 1.5% (w/v), CaCl2 溶液浓度为 1.5%(w/v)。
[0048]交联过程中微球粒径有明显膨胀。戊二醛交联的ALG-g-Lys微球粒径明显小于京尼平交联的ALG-g-Lys微球，微球稳定性与交联剂浓度总体表现出的趋势是微球稳定性随着交联剂浓度的增大而增大。京尼平交联后载体具有荧光特性，激发波长为396nm，发射波长为477nm。
[0049]实施例七:
[0050]具体操作步骤同实施例六，区别在于甲氨蝶呤溶解于ALG-g-Lys的pH7.4的PBS缓冲液中。甲氨蝶呤的浓度分别为8、4、2mg/mL。
[0051]投药浓度为2mg/ml时，载药量低于2% ;投药浓度为4mg/ml时，载药量为3%~5% ；投药浓度为8mg/ml时，载药量在8%~10%之间。包封率在2%~30%之间。在0.5h内，交联微球的累积释放率均低于30%，无突释现象，在48h内，交联微球对甲氨蝶呤累积释放率均大于75%，药物释放基本完全。`