一种大型海藻活性素的生物提取方法 【技术领域】，特别涉及一种大型海藻活性素的生物发酵提取方法。 [0002]天然产品的成分复杂，且多种有效成分进入人体后相互配合、协同作用，而后起到治疗疾病的作用。传统的提纯分离技术，如煎煮法、回流、浸渍等，以及现代中药提取分离技术，如超微粉碎技术、超临界萃取技术、逆流动态提取技术、吸附分离纯化技术、膜分离技术等，均沿用纯粹传统的物理或化学手段，与吸收入人体的中药有效成分的协同作用无关，易破坏中药有效成分的结构或组成，难以将中药中含有的有效成分完全提取出来，且提取剂用量大、需反复提取、提取效率低、周期长。 [0003]仿生提取法是近几年提出的新方法，它是从生物药剂学的角度，将整体药物研宄法与分子药物研宄法相结合，模拟口服药物经胃肠道转运吸收的环境，采用活性指导下的导向分离法。该方法不仅能充分发挥中药混合物的综合作用，又能利用单体成分控制中药制剂的质量，有效成分损失少。但是现有仿生提取技术中使用的仿生液仅仅是模仿胃液或肠液的PH值，仿生程度低，有效成分的提取效率以及有效成分的损失依然没有明显改善。 [0004]比如，公布号为“CN102266370 ”的中国发明专利公开了一种杭白菊中抗胃癌活性物质的半仿生提取方法，包括以下步骤:1)将干燥的杭白菊粉碎后过40-60目筛，然后加入PH为2.0-2.2的缓冲液I，置于36.5-37.5°C水浴中提取1_2小时；提取结束后过滤，弃去滤液I ;2)在步骤I)所得滤渣中加PH为7.8-8.2的缓冲液II，置于36.5-37.5°C水浴中提取1-2小时；提取结束后，过滤，去滤液II ;滤液II经干燥处理，得杭白菊抗癌提取物。 [0005]大型海藻活性素是人或动物通过胃液消化分解再分段排入十二指肠、小肠吸收后通过门静脉到达肝脏，经肝脏分解后通过血液靶向性到达病灶起作用。目前尚没有高效且对有效成分无损害的大型海藻活性素提取方法。
[0006]



[0007]本发明的目的在于提供一种大型海藻活性素的生物提取方法，以解决现有技术的大型海藻活性素提取方法，易破坏海藻有效成分的结构或组成，难以将海藻中含有的有效成分完全提取出来，且提取剂用量大、需反复提取、提取效率低、周期长的问题。
[0008]本发明的技术方案是这样实现的:
一种大型海藻活性素的生物提取方法，包括以下步骤:
I)制备仿生胃液:
a.取浓度为17-1O8cfu /ml的乳杆菌菌和浓度为106-107cfu/ml的酵母菌按体积3:1进行混合；
b.向混合菌液中加入浓度为3mol/L的稀盐酸，调节混合液PH值至0.9-1.5 ； C.加入氯化钠饱和溶液，调节溶液密度至1.006-1.009g/ml，以保证所述仿生胃液的渗透压等同于人体胃液；
d.加入营养平衡剂，营养平衡剂中山药粉和黄原胶的浓度均为0.5-2g/100ml ；
e.加入胃蛋白酶，浓度为0.5-2g/100ml ；
f.加入稳定调节剂，其中枸橼酸钠浓度为l_3g/100ml，葡萄糖浓度为2-4g/100ml；
2)制备仿生肠液:
a.取浓度为5X106-107cfu/ml的芽孢杆菌菌液；
b.向芽孢杆菌菌液中加入高浓度K2PO4S液，使混合液中的K#04的浓度为
0.8-1.5g/100ml ；
c.加入浓度为5%的胰酶水溶液，调节到胰酶的浓度为0.25-0.5% ；
d.用浓度为0.1-0.3mol/L的氢氧化钠溶液调节PH至8-10 ；
3)将大型海藻干燥粉碎并过50-80目筛；
4)将过筛后海藻粉末加入上述仿生胃液，使仿生胃液浸没海藻粉末，然后发酵20-50h ；
5)发酵后的药物采用孔径为0.005-0.0lum的超滤膜过滤；
6)向超滤液中加入仿生肠液，调节PH为6.5-7.5，得大型海藻活性素提取物。
[0009]本发明的大型海藻活性素的生物提取方法中:
A菌植入培养基，在37°C、厌氧条件下培养20-40h，得A菌菌液。
[0010]A菌培养基:酪蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二胺 2.0g, Tween 80 1.0g，磷酸氢二钾 2.0g, MgS04.7H20 0.2g，MnS04.H20
0.05g，CaC03 20.0g，琼脂 15.0g，蒸馏水 1.0L，pH6.8。
[0011]酿酒酵母菌植入培养基，在25-28°C、厌氧条件下培养20-40h，得酿酒酵母菌菌液。
[0012]酿酒酵母菌培养基:5° Β?麦芽汁1.0L，琼脂15.0g。
[0013]嗜碱性枯草芽孢杆菌植入培养基，在28_28°C、有氧条件下培养20_40h，得嗜碱性芽孢杆菌菌液。
[0014]枯草芽孢杆菌培养基:氯化钠0.5克，琼脂2克，牛肉膏I克，蛋白胨I克，水100 毫升，PH 7.2。
[0015]本发明的有益效果为:
本发明的大型海藻活性素的生物提取方法，将海藻一般性粉碎后，用仿生胃液对海藻粉进行仿生学生物活性发酵，再采用膜分离法进行大型海藻活性素的提取。然后采用仿生肠液将所提取的大型海藻活性素溶液的PH调节6.5-7.5，使活性素溶液呈弱碱性、中性或弱酸性，适合服用，同时仿生肠液调节PH，可以提高大型海藻活性素的吸收速度。
[0016]本发明大型海藻活性素的生物提取方法中未使用对海藻中的有效成分产生破坏性的手段，所提取的大型海藻活性素有效成分的结构或组成不变；本发明方法对海藻的大型海藻活性素的提取率高，另外，采用本发明的大型海藻活性素的生物提取方法所提取的大型海藻活性素不需要胃、肠液消化分解，能够直接进入病灶，提高中药有效成分的吸收速度。
[0017]下面结合一临床病例进一步说明本发明: 周某，女，46岁，山东安丘人，2013年10月初诊，胃脘隐痛2年，胃部不舒，近两个月加重，胃痛喜温喜按，偶有呃逆，无泄泻。精神萎靡，四肢怕冷，喜热恶凉，睡觉时两脚怕冷加重。平素血压偏低(105/60mmHg)，常觉头晕、眼花。舌质淡红苔中部薄白，边有齿痕，左寸关脉弦细，右关脉沉弦略弱。镜检所见:胃底粘膜粗糙，充血，胃体皱襞排列整齐，粘膜弥漫性充血水肿，密集斑点样糜烂有出血点，胃角形态正常粘膜充血，胃窦粘膜弥漫性充血水肿，散在斑片样糜烂，幽门粘膜充血。结论:非萎缩性胃炎。
[0018]采用本发明的大型海藻活性素的生物提取方法制得的药物治疗，经本发明提取方法提取得到微黄色大型海藻活性素液，每次50ml，一日服用三次。服用后即痛疼见轻，共服用10天，以后患者自述已无胃痛至今。
[0019]注意事项:在应用本生物药品时，不得与其它抗生素共同使用。




[0020]图1为采用本发明的大型海藻活性素的生物提取方法制备含大型海藻活性素药物的工艺流程图。


[0021]下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0022]本发明的大型海藻活性素的生物提取方法中用到的菌种由中国食品工业发酵研宄院提供。
[0023]实施例1
本发明的大型海藻活性素的生物提取方法包括以下步骤:
(O制备仿生胃液:
取600mlA菌液和200ml酿酒酵母菌菌液混合，取浓度为3mol/L的稀盐酸，调节混合菌液的PH至1.3，加入氯化钠固体，调节溶液的密度至1.006-1.009g/ml，WA8g山药粉，加入Sg黄原胶，山药粉和黄原胶作为营养调节剂，加入Sg胃蛋白酶，加入16g枸橼酸钠，加入24g葡萄糖，枸橼酸钠和葡萄糖作为稳定调节剂，制得仿生胃液。
[0024](2)制备仿生肠液
取嗜碱性芽孢杆菌浓度为5X 106-107cfu/ml的菌液500ml，加入6g磷酸二氢钾固体进行溶解，然后加入到菌液中。取3.0g胰酶，加入300ml水使之溶解。将步骤上市所得的混合菌液与胰酶溶液混合，并稀释至1000ml。
[0025](3)取Ikg海藻粉，向中药粉末中加入仿生胃液，仿生胃液浸没中药粉末，发酵36ho发酵完成后，将发酵后的药物采用0.005um的超滤膜过滤。向超滤膜过滤后所得的透过液中加入仿生肠液，采用仿生肠液调节PH至7，得大型海藻活性素提取物。向大型海藻活性素提取物中加入口服液复配制剂，制得含大型海藻活性素的口服液。
[0026]实施例2
(O制备仿生胃液: 取900mlA菌液和300ml酿酒酵母菌菌液混合，取浓度为3mol/L的稀盐酸，调节混合菌液的PH至1.0，加入氯化钠固体，调节溶液的密度至1.008g/ml，加入18g山药粉，加入18g黄原胶，山药粉和黄原胶作为营养调节剂，加入18g胃蛋白酶，加入32g枸橼酸钠，加入32g葡萄糖，枸橼酸钠和葡萄糖作为稳定调节剂，制得仿生胃液。
[0027](2)制备仿生肠液
取嗜碱性芽孢杆菌浓度为5X 106-107cfu/ml的菌液500ml，加入6g磷酸二氢钾固体进行溶解，然后加入到菌液中。取5.0g胰酶，加入300ml水使之溶解。将步骤上市所得的混合菌液与胰酶溶液混合，并稀释至1000ml。
[0028](3)取Ikg海藻粉，向中药粉末中加入仿生胃液，仿生胃液浸没中药粉末，发酵48ho发酵完成后，将发酵后的药物采用0.0lum的超滤膜过滤。向超滤膜过滤后所得的透过液中加入仿生肠液，采用仿生肠液调节PH至7，得大型海藻活性素提取物。向大型海藻活性素提取物中加入口服液复配制剂，制得含大型海藻活性素的口服液。将制得的发酵含大型海藻活性素口服液经负压浓缩并干燥后进行超微粉碎，制成胶囊制剂，得含大型海藻活性素的胶囊。
[0029]实施例3
取900mlA菌液和300ml酿酒酵母菌菌液混合，取浓度为3mol/L的稀盐酸，调节混合菌液的PH至1.5，加入氯化钠固体，调节溶液的密度至1.006g/ml，加入24g山药粉，加入24g黄原胶，山药粉和黄原胶作为营养调节剂，加入18g胃蛋白酶，加入32g枸橼酸钠，加入48g葡萄糖，枸橼酸钠和葡萄糖作为稳定调节剂，制得仿生胃液。取嗜碱性芽孢杆菌浓度为5X 106-107cfu/ml的菌液500ml，加入6g磷酸二氢钾固体进行溶解，然后加入到菌液中。取5.0g胰酶，加入300ml水使之溶解。将步骤上市所得的混合菌液与胰酶溶液混合，并稀释至100ml。取Ikg海藻粉，向中药粉末中加入仿生胃液，仿生胃液浸没中药粉末，发酵36h。发酵完成后，将发酵后的药物采用0.005um的超滤膜过滤。向超滤膜过滤后所得的透过液中加入仿生肠液，采用仿生肠液调节PH至7，得大型海藻活性素提取物。向大型海藻活性素提取物中加入口服液复配制剂，制得含大型海藻活性素的口服液。将制得的发酵含大型海藻活性素口服液经负压浓缩并干燥后进行超微粉碎，制成胶囊制剂，得含大型海藻活性素的胶囊。
[0030]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。