专利名称：海藻糖-释放酶及其制备和用途的制作方法图1表示从用“DEAE-Toyopearl”凝胶装的柱上洗脱本发明海藻糖—释放酶和非还原多糖—形成酶的洗脱图谱。图2表示温度对从根瘤菌M-11微生物得到的本发明海藻糖—释放酶活性的影响。图3表示pH对从根瘤菌M-11微生物得到的本发明海藻糖—释放酶活性的影响。图4表示温度对从根瘤菌M-11微生物得到的本发明海藻糖—释放酶稳定性的影响。图5表示pH对从根瘤菌M-11微生物得到的本发明海藻糖—释放酶稳定性的影响。图6表示温度对从节杆菌Q36微生物得到的本发明海藻糖—释放酶活性的影响。图7表示pH对从节杆菌Q36微生物得到的本发明海藻糖—释放酶活性的影响。
图8表示温度对从节杆菌Q36微生物得到的本发明海藻糖—释放酶稳定性的影响。
图9表示pH对从节杆菌Q36微生物得到的本发明海藻糖—释放酶稳定性的影响。
根据本发明，一种根瘤菌属的微生物，即根瘤菌M-11的鉴别试验得出下列结果。按“Biseibutsu-no-Bunrui-to-Dotei”(微生物的分类和鉴定)(由Takeji Hasegawk编辑；JapanScinticfic Socities Press，Tokyo，Japan(1985)出版)中描述的方所完成试验A.形态学在27℃，于营养琼脂中培养时，细胞的特征通常以0.6-0.8×1.0-1.5μm的棒状形式存在；单个存在，但罕见按顺序成对的或相连的形式；不存在多形性；具有游动性，不产孢子和有鞭毛；非抗酸性；革兰氏染色阴性；荚膜阴性；异染粒阳性；和积累聚-β-羟基丁酸。
B.培养特性(1)在27℃，营养琼脂板上培养时形成的菌落特征形态培养24小时后，得到直径为约1.5mm的圆形菌落；边缘边缘光滑；投影平的或半球形；光泽阳性；表面光滑；颜色形成没有粉色素的奶油状半透明菌落。
(2)27℃在琼脂板上与右旋糖和胰胨培养时形成的菌落特征粘液样的奶油状半透明菌落。
(3)27℃，在琼脂板上与酵母提取物和甘露醇一起培养时形成的菌落特征形态培养5天后，形成直径约3mm的圆性菌落；颜色粘液样的奶油状半透明菌落。
(4)27℃，在琼脂板上与酵母提取物、甘露醇和刚果红一起培养形成的菌落特征既不是淡粉色基本上也没吸收刚果红；(5)27℃，在琼脂板上，与酵母提取物，甘露醇和2％NaCl一起生长；(6)27℃，在营养琼脂斜面上培养时形成的菌落特征生长令人满意；形态线状；和(7)27℃，在营养明胶中穿刺培养时，不能液化明胶。
C.生理特征(1)硝酸盐的还原阳性；(2)脱氮反应阴性；(3)甲基红试验阴性；(4)VP-试验阴性；(5)吲哚的形成阴性；(6)硫化氢的形成阳性；(7)淀粉水解阴性；
(8)柠檬酸的利用阳性；(9)无机氮源的利用利用铵盐和硝酸盐；(10)色素的形成无；(11)脲酶阳性；(12)氧化酶阴性；(13)过氧化氢酶阳性；(14)生长条件在5.5-9.0的pH及4-35℃的温度范围内生长；(15)氧要求需氧(16)碳源的利用和酸形成碳 源 利用 酸形成D-葡萄糖++D-半乳糖++D-果 糖++L-阿拉伯糖 ++D-木 糖++L-鼠李糖++麦芽糖+-蔗 糖++乳 糖+-海藻糖+-棉子糖++
甘露糖+-糊 精+-卫矛醇+-(17)对氨基酸的脱羧酶试验对L-Lys，L-Arg和L-鸟氨酸阴性；(18)氨基酸的利用利用L-谷氨酸钠，L-天冬氨酸钠，L-组氨酸和L-脯氨酸；(19)DNase阴性(20)3-酮乳糖(3-ketolactose)的形成阴性；和(21)DNA鸟嘌呤(G)+胞嘧啶(C)的摩尔％61％。
将细菌学特征与Bergeys Manual of Systematic Bacteriology(第1版(1984))中已知微生物的特征进行比较。结果，表明将这种微生物鉴定为根瘤菌属的微生物。这种微生物与苜蓿根瘤细菌种的那些相似，但可将其与它们区别开，原因是，这种微生物利用麦芽糖，乳糖和甘露醇但不形成酸，而且它既产生当作用于还原性淀粉部分水解产物时，能形成具有海藻糖结构的非还原多糖的酶，也产生可特异性水解非还原多糖中海藻糖部分和其余糖基部分之间的键，从而释放海藻糖部分的新型海藻糖-释放酶。还未报道过有这些特征的微生物。
本发明人将这种微生物命名为“Rhizobium sp M-11”，并于1992，12，24保藏在Fermentation Reasearch Institute，Agency of Industrial Science and Technology，Ibaraki，Japan。当天该微生物保藏被接受，并由该机构以FERM BP-4130的保藏号予以保藏。
除上述鉴定的微生物外，根瘤菌属的其它菌株和其突变体只要能产生本发明的海藻糖—释放酶，就适用于本发明。
根据本发明，一种节杆菌属微生物，即节杆菌Q36的鉴定试验得出下列结果。按“Biseibutsu-no-Bunrui-to-Dotei”(微生物的分类与鉴定)(由Takeji Hasegawa编，Japan Scientific Societies Press，Tokyo，Japan(1985)出版)中的描述完成试验。结果如下A.形态学(1)27℃在营养琼脂中培养时的细胞特征通常为0.5-0.7×0.8-1.6μm的棒状形式；单个存在；表现多态性；没有游动性、鞭毛且不产孢子；非抗酸性；革兰氏染色阳性；荚膜阴性；和(2)27℃在EYG琼脂中培养时的细胞特征呈现一个棒球环。
B.培养特征(1)27℃在营养琼脂板中培养时形成的菌落特征形态培养3天后，形成直径约2-2.5mm的圆形菌落；边缘边缘光滑；投影半球形；光泽有分泌物的光泽；表面光滑；颜色半透明和白色或淡黄色。
(2)27℃，在营养琼脂板中培养时形成的菌落特征生长率令人满意；和形状线状(3)27℃，在含酵母提取物和蛋白胨的琼脂板中，斜面培养时的细胞特征生长率令人满意；形态线状；和(4)27℃在肉汤和明胶中穿刺培养时的细胞特征液化肉汤和明胶。
C.生理特征(1)硝酸盐的还原阳性；(2)脱氮反应阴性；(3)甲基红试验阴性；(4)VP-试验阳性；
(5)吲哚的形成阴性；(6)硫化氢的形成阳性；(7)淀粉水解阴性；(8)纤维素水解阴性；(9)柠檬酸的利用阳性；(10)无机氮源的利用；利用铵盐和硝酸盐；(11)色素的形成阴性；(12)脲酶阳性；(13)氧化酶阴性；(14)过氧化氢酶阳性；(15)生长条件在5-10的pH和4-37℃的温度范围内生长；(16)氧需求需氧；(17)碳源的利用和酸形成碳 源利用 酸形成D-葡萄糖+-D-半乳糖+-D-果 糖+-L-阿拉伯糖 +-D-木 糖+-L-鼠李糖+-麦芽糖+-
蔗 糖+-乳 糖+-棉子糖+-甘露糖+-糊 精+-卫矛醇+-(18)氨基酸的利用利用L-谷氨酸钠，L-天冬氨酸钠，L-组氨酸和L-脯氨酸；(19)DNase阳性(20)3-酮乳糖(3-ketolatose)的形成阴性；(21)细胞壁的主要二氨基酸赖氨酸；和(22)DNA鸟嘌呤(G)+胞嘧啶(C)的摩尔％63％。
将细菌学特征与Bergeys Manual of Systematic BacterioCogy(Vol.2(1986))中已知微生物的特征进行比较。结果，表明，将这种微生物鉴定为节杆菌属的一种微生物。这种微生物的特征在于，它产生一种当作用于还原性淀粉部分水解产物时，能形成(具有海藻糖结构的)非还原多糖的非还原多糖—形成酶，和一种特异性水解非还原多糖中海藻糖部分和其余糖基部分之间的键，从而释放海藻糖部分的海藻糖—释放酶。未公开报道过有这些特征的上述微生物。
本发明人已将这种微生物命名为“节杆菌Q36”，并于1993，6，3保藏于National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology，Ibaraki，Japan。当天微生物的保藏被接受，并由该机构以FERMBP-4316的保藏号予以保藏。
除上述微生物外，节杆菌属的其它菌株和其突变体；只要能产生本发明海藻糖—释放酶，就适用于本发明，所述的海藻糖—释放酶能够特异性水解(具有海藻糖结构作为末端单位且葡萄糖聚合度为3或更高的) 非还原糖性淀粉部分水解物中海藻糖部分和其余糖基部分之间的键。
其它微生物只要产生本发明的酶，就可用在本发明中。例如，除上述的根瘤菌M-11(FERM BP-4130)和节杆菌Q36(FERMBP-4316)外，至今为止，其它已知的微生物菌种如微黄短杆菌(Brevibacterium Helvolum)(ATCC11822)和玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)(ATCC186)也很适用于本发明。
任何营养培养基只要上述微生物能生长于其上，且能产生本发明的海藻糖—释放酶，就可用于本发明。例如，可随意使用合成的和天然营养培养基。任何含碳的物质只要它能被所述微生物利用，就可作为碳源用于本发明。所述碳源的实例是多糖，如葡萄糖，果糖，乳糖，蔗糖，甘露醇，山梨醇，糖蜜和淀粉部分水解产物；和有机酸如柠檬酸和琥珀酸。适当选择这些碳源在营养培养基中的浓度。例如，在用淀粉部分水解物时，从所述微生物生长和繁殖的角度看，优选的浓度通常是20％或更低，最好是5％或更低(d.s.b.)。可用于本发明的氮源是，例如，无机氮化合物，如铵盐和硝酸盐；含有机氮的物质，如脲，玉米浆，酪蛋白，蛋白胨，酵母提取物和牛肉膏。可用于本发明的无机成分是，例如钙盐，镁盐，钾盐，钠盐，磷酸盐和镁，锌，铁，铜，钼和钴的其它盐。如果需要，可以使用氨基酸和维生素。
将在本发明中可用的微生物于需氧条件下，通常在4-40℃的范围，优选的20-35℃的范围；及4-10的pH；优选的5-9的pH下培养。将在本发明中适用的培养时间调整至比所述微生物生长开始所需的时间更长，优选的是，10-100小时。没有特别限制营养培养基中溶解氧(DO)的浓度，通常，使用0.5-20ppm范围的DO是令人满意的。通过控制通气率，搅拌营养培养基，通气补充氧，及增加发酵容器的内压，可将DO浓度保持在该范围内。
在微生物培养完成后，回收本发明的酶。在细胞和无细胞上清液中，都发现具有活性的本发明酶，可将其回收并用作粗酶。可将所得的培养物原封不动地用作粗酶。在本发明中，可以使用传统的液—固分离方法，以便从培养物中除去细胞。例如，可以用将所得的培养物直接离心的方法，以及预涂布滤器将其过滤或通过使用平板滤器或空心纤维的膜过滤分离细胞的方法。可将因此得到的无细胞滤液原封不动地用作酶溶液或在使用前将其浓缩。本发明中可用的浓缩方法是，例如，使用硫酸铵的盐析，使用丙酮和醇的沉淀法，和使用膜如平板滤器和空心纤维的浓缩法。
可将无细胞滤液和其浓缩物用于传统的固定方法。传统方法的实例是使用离子交换剂的结合法，使用树脂和膜的共价键和吸收法，以及使用高分子量物质的包埋法。可以将从所得培养液中分离的细胞用作粗酶而不需任何进一步的处理或在使用前将其固定。例如，将细胞与藻酸盐混合，在氯化钙溶液中滴所得的混合物，将珠滴胶凝成颗粒，从而固定细胞。可以用聚亚乙基亚胺或戊二醛固定所得的颗粒。可以将由细胞提取的酶制品，在本发明中，作为粗酶溶液使用。通过从细胞中提取本发明的酶，包括用超声波，使用玻璃珠和氧化铝的机械破碎，法兰西压力(freneh-press)破碎等，使得到的提取物经离心或膜过滤，从而得到含本发明酶的粗酶澄清溶液。
可以原封不动地使用由此得到的粗酶溶液或在使用前，用传统方法将其纯化。例如，在电泳上呈现一个带的纯酶制品可以通过渗析粗酶制品而制备，通过用硫酸铵盐析粗酶培养物并将所得产物浓缩，然后，在用“DEAE-Toyopearl?”(一种阴离子交换剂)的阴离子交换柱上层析；用“Butyl-Toyopearl?”(一种疏水树脂)的疏水柱层析；和使用“Toyopearl?HW-55”(一种凝胶过滤树脂)的凝胶过滤层析(所有产品均是TosohCorpration，Tokyo，Japan的产品)，成功地纯化渗析过的溶液，从而制备所述的粗酶制品。
由此得到的本发明海藻糖—释放酶有下列物理化学特性；(1)作用特异性水解具有海藻糖结构为一个末端单位且葡萄糖聚合度为3或更高的非还原多糖中，海藻糖部分和其余糖基部分之间的键；(2)分子量在十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上约57,000-68,000道尔顿；(3)等电点(pI)在用两性电解质的等电点电泳上为约3.3-4.6；(4)最佳温度在pH7.0培养30分钟时，约35-45℃；(5)最佳pH在40℃培养30分钟时，约6.0-7.5；(6)热稳定性在pH7.0，培养30分钟时，可稳定的温度达到约30-45℃；(7)pH稳定性25℃培养16小时，在5.0-10.0的pH内稳定。
按下列步骤检测本发明海藻糖—释放酶的活性将1ml酶溶液加到4ml 1.25w/w％麦芽三糖基海藻糖(别名α-麦芽四糖基α-葡糖苷)的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)中，将混合物在40℃培养30分钟。将所得的反应混合物加到一铜溶液中进行Somogyi反应，以终止酶反应，然后，用Somogyi-Nelson方法确定还原能力。作为对照，在100℃将酶溶液预热10分钟以使酶失活，按与上述相似的方法检测。将1单位的本发明酶活性定义为用上述方法检测时，每分钟增加1μmol葡萄糖还原能力的酶量。
任何物质只要它是一种含有海藻糖结构作为一个末端单位且葡萄糖聚合度为3或更高的非还原多糖，就可作为本发明酶的底物。所述底物的实例是糖基海藻糖如葡糖基海藻糖，麦芽糖基海藻糖，麦芽三糖基海藻糖，麦芽四糖基海藻糖和麦芽五糖基海藻糖，这些糖是由非还原多糖—形成酶作用于麦芽三糖.麦芽四糖，麦芽五糖，麦芽六糖和麦芽七糖而形成的。除这些底物外，通过用淀粉酶或酸部分水解淀粉物质如淀粉、支莲淀粉和直莲淀粉而制备的(具有海藻糖结构作为末端单位且葡萄糖聚合度为3或更高的)相对低的还原性淀粉部分水解产物也适用于本发明。
部分水解淀粉的所述淀粉酶的实例是在Handbook of Amyloses and Related Enzymes(由Pergamon Press；Tokyo，Japan(1988)出版)中公开的α-淀粉酶、麦芽五糖—形成淀粉酶和麦芽六糖—形成淀粉酶。可以将这些淀粉酶与脱支酶如支链淀粉和异淀粉酶结合使用。
对在本发明中用作底物的还原性淀粉部分水解产物的浓度没有特别的限制。根据本发明甚至可以在含0.1％或50％底物的溶液中进行酶反应，形成海藻糖。在本发明中也可使用含不可溶底物的悬浮物。在本发明酶反应中可用的反应温度可以是本发明酶不失活的温度，即最高达约55℃，优选的在40-55℃。在本发明酶反应中可用的反应pH是5-10pH，优选的是6-8pH。仅根据酶反应条件来选择本发明酶反应所用的时间，通常，当以0.1-100单位/g底物d.s.b.使用本发明的酶时，大约需0.1-100小时。
关于从材料底物制备海藻糖的产率，特别是，在由具有相对低DE值的非还原性淀粉部分水解产物(即具有相对高的葡萄糖聚合度的那些)制备海藻糖的情况下，本发明的海藻糖制备方法具有提高海藻糖产率的优点，其产率大于用日本专利申请No.362,131/92中公开的制备方法(其中非还原多糖—形成酶与葡糖淀粉酶结合使用)所得的产率。本发明的制备方法，其中，非还原多糖—形成酶与本发明的海藻糖释放酶结合使用，以约60％或更高的高产率形成海藻糖，而日本专利申请的制备方法，形成海藻糖的产率只有约30％。
本发明的酶机制如下首先用非还原多糖—形成酶将具有相对高的葡萄糖聚合度的还原性淀粉部分水解产物转变成1摩尔具有海藻糖结构作为末端单位的非还原多糖，然后，用本发明的海藻糖—释放酶将所得的非还原多糖水解成1摩尔海藻糖和1摩尔比原材料还原性淀粉部分水解物的葡萄糖聚合度低2的还原性淀粉部分水解产物。对于新形成的葡萄糖聚合度为3或更高的还原性淀粉部分水解物，可以将其进一步转化为有一个海藻糖作为末端单位的非还原多糖，然后，用海藻糖—释放酶转变成1摩尔的海藻糖和淀粉部分水解产物。因此，重复前述非还原多糖—形成酶和海藻糖—释放酶的酶反应，可以从1摩尔还原性淀粉部分水解物形成一个或更多的海藻糖分子和数量比形成的海藻糖分子多2倍的，葡萄糖聚合度低于原料淀粉部分水解产物的非还原性淀粉部分水解产物。
在本发明制备方法中，可以同时使用非还原多糖-形成酶和本发明的海藻糖—释放酶以作用于葡萄糖聚合度为3或更高的非还原性淀粉部分水解产物，或以该顺序连续使用这两种酶以作用于非还原性淀粉部分水解产物。为了进一步提高海藻糖产率，可使所得的反应混合物进一步经葡糖淀粉酶的作用。
用常规方法过滤并浓缩由此得到的反应混合物以除去不可溶物质，然后用活性炭将所得的溶液脱色，用H-和OH-形式的离子交换剂脱盐，在浓缩成浆状产品。可以随意地将糖浆产品干燥成粉状产品。
如果需要，用一种或多种方法，如离子交换柱层析、用活性炭或硅胶的柱层析分级分离进行纯化；用有机溶剂如乙醇和丙酮分离法；和降解并除去剩余的还原多糖的碱处理法，很容易将粉状产品加工成高纯度的海藻糖产品。
如果需要，按照本发明，可以用淀粉酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶和/或海藻糖酶水解含海藻糖的多糖产品，或使其经使用环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶和/或糖基转移酶的多糖—转移反应以控制其甜度和还原力并降低其粘度。此外，可以随意地使多糖产品氢化以将其转变成糖醇，从而降低其还原力。可以用上述的纯化方法，如离子交换柱层析从所得的产品中除去葡萄糖以制备海藻糖含量高的流份。可以很容易将由此得到的流份纯化并浓缩成糖浆产品，且，如果需要，可以进一步将糖浆产品浓缩成过饱和浓液并结晶以得到含水的晶状海藻糖或无水的晶状海藻糖。
在本发明中可用的离子交换柱层析技术包括，例如，在日本专利公开No.23,799/83和72,598/83中公开的，使用强酸阳离子交换树脂的方法。使用这些技术，可以很容易地除去在粗海藻糖产品中所含的随伴多糖以得到高海藻糖含量的产品。在这种情况下，可以随意使用固定床，移动床和半移动方法。
为了制备含水的晶状海藻糖，将约65-90％的海藻糖溶液放在一结晶器中，于95℃或更低，优选10-90℃的范围内，在存在0.1-20％晶种的情况下，边搅拌边逐渐冷却以得到含有含水晶状海藻糖的糖膏。可以在本发明中使用传统方法，如分离法、块粉碎作用、流化床或成粒作用及喷雾干燥法以便从糖膏或晶状多糖制备含水的晶状海藻糖。
在分离时，使糖膏经篮式离心以便从母液中分离含水的晶状海藻糖，如果需要，用少量冷水喷洗含水的晶状海藻糖以促进高纯度含水晶状海藻糖的制备。喷雾干燥时，通过从一个高压泵喷嘴射具有60-85％浓度(以干重计)约20-60％结晶度(以干重计)的糖膏，用约60-100℃不融化所得晶体粉末的热空气干燥所得物，边向其吹约30-60℃热空气，边搅拌所得的粉末约1-20小时，很容易制备没有或基本没有吸湿性的结晶多糖。在块粉碎作用时，使水分含量为约10-25％且结晶度为约10-60％(以干重计)的糖浆放几小时或3天以便使全部内含物结晶并固化成块，粉碎或切割所得的块，并将所得物干燥，从而很容易地制备没有或基本没有吸湿性的结晶多糖。尽管可以通过干燥含水的晶状海藻糖以将其变成无水形式，来制备无水的晶状海藻糖，但一般是通过提供水分含量低于10％的高海藻糖含量溶液，将该溶液放在结晶器中，在搅拌条件下，于50-160℃，优选80-140℃的范围，存在晶种的情况下保持溶液以得到含无水晶体海藻糖的糖膏，将其结晶，在干燥和相对高的温度下，用传统方法如块粉碎法、流化床成粒法和喷雾干燥将所得的无水晶体海藻糖粉碎，从而制备无水晶体海藻糖。
由此得到的本发明海藻糖是稳定的且基本上没有还原能力，并可以与其它物质，特别是氨基酸和含氨基酸的物质如寡肽和蛋白质混合，而不必顾虑引起令人讨厌的焦化和气味以及所述物质的变质。海藻糖本身有令人满意的高质量和甜度。由于海藻糖很容易被海藻糖酶水解，因此，口服时，能被活体同化，吸收和利用。此外，海藻糖基本上不会被诱发龋齿的微生物发酵，因此，这可使其用作甜味剂而基本上不诱发龋齿。
可以将本发明的海藻糖制成药剂，如，用于输血和管饲法的营养药剂，可以随意地将其施用于活体并很容易被活体代谢和利用而不必担心引起毒性和副作用。因此，有利于将这些产品作为用于活体的能量补充药剂。
海藻糖是稳定的甜味剂，特别是，当与粘合剂如支链淀粉，羟乙基淀粉或聚乙烯吡咯烷酮结合使用时，晶体海藻糖可随意被用作片剂的糖包衣剂。另外，海藻糖有许多特性，如控制渗透压的能力、赋予填料的能力、赋予光泽的能力、保持湿度的能力、赋予粘度的能力、基本不发酵性、防止胶凝化淀粉退化的能力、以及防止其它多糖结晶的能力。
因此，可随意地将含本发明海藻糖和多糖的本发明海藻糖和多糖组合物作为甜味剂、味道改善剂、质量改善剂、稳定剂和填充剂用于各种组合物如食品、香烟、烟草、饲料、化妆品和药物。
可将含本发明海藻糖和多糖的本发明海藻糖和多糖组合物原封不动地用作甜味调料。如果需要，可以与足量的一种或多种其它甜味剂，如粉化的糖浆、葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、异构糖、蜂蜜、槭糖、赤藓糖、山梨醇、甘露醇、lactitol、dihydrocharcone、卡哈苡苷、α-糖基卡哈苡苷、rebaudioside、甘草甜、L-天冬氨酰基L-苯丙氨酸甲基酯、糖精、甘氨酸和丙氨酸；和/或填充剂如糊精、淀粉和乳糖一起使用。
可以原封不动地使用含本发明海藻糖和多糖的粉末或晶体形式的本发明海藻糖和多糖组合物，如果需要，使用前，可以将其与赋形剂、填充剂、稀释剂和粘合剂混合，并制成颗粒、球、短棒，扁片(plate)、锭剂和片剂。
含本发明海藻糖和多糖的本发明海藻糖和多糖组合物可与有酸味、盐味、苦味、涩味及美味的其它物质很好地兼容，并有相对高的酸耐受性和热抗性。因此，一般，可很好地将其用于食品，作为甜味剂、味道改善剂和质量改善剂。
可以将含本发明海藻糖和多糖的本发明海藻糖和多糖组合物用于调味剂中，如氨基酸、肽、酱油、粉末化的酱油、“miso”、“fummatsu-miso”(粉末化的miso)、“moromi”(一种精制日本清酒)、“hishio”(一种精制酱油)、“fwrikake”(一种调味的鱼饭)、蛋黄酱、调味品、醋、“sanbai-zu”(糖、酱油和醋的酱油)、“funmatsu-sushi-su”(用于sashi的粉末化的醋)、“chuka-no-moto”(用于中国菜的即溶混合物)、“tentsuga”(用于日本多脂肪煎食品的酱油)、“mentsuyu”(用于日本vermiui的酱油)、酱油、catsup、“yakiniku-no-tare”(用于日本烤肉的酱油)、curry roux、即食的炖混合物、即食的汤混合物、“dashi-no-moto”(即食的汤料混合物)、核酸调味品、混合调料、“mirin”(甜清酒)、“shin-mirin”(合成的mirin)食糖和咖啡糖。
可以将含本发明海藻糖和多糖的本发明海藻糖和多糖组合物随意用于增加以下食品的甜味“wagashi”(日本糕点)如“sendei”(大米饼干)、“arare-mochi”(大米糕点方糖)、“okoshi”(小米-和-大米糕点)，“mochi”(大米面团)，“manju”(带有豆酱的甜点)，“uiro”(甜大米果胨)，“an”(豆酱)，“yokan”(豆子作的甜果胨)，“mizu-yokan”(软adzuki豆果胨)，“kingyoku”(一种yokan)，果胨，paode Castella和“amedama”(日本乳脂糖)；甜食如甜点心，饼干，干酪，小甜饼，派，布丁，黄油，牛奶蛋糊，奶油酥，牛奶鸡蛋格子甜饼，海绵蛋糕，油炸饼圈，巧克力，口香糖，焦糖和糖果；冷冻甜点如冰激凌和甜味果汁粉，糖浆如“kajitsu-no-syrup-zuke”(保藏的水果)和“korimitsu”(用于刨冰的糖浆)；加工过的水果和蔬菜如果酱，marmalade，“syrup-zuke”(腌水果)和“toka”(蜜饯)；腌菜和腌制食品如“fukujin-zuke”(腌红萝卜)，“bettare-zuke”(一种腌的整个新鲜的萝卜)，“senmai-zuke”(一种片状的腌鲜萝卜)和“rakkyo-zuke”(腌制的青葱)；腌菜和腌制食品的预混合物如“takuan-zuke-no-moto”(腌萝卜的预混合物)和“hakusai-zuke-no-moto”(新鲜白油菜腌菜的预混合物)；由产品如火腿和香肠；鱼肉产品如鱼火腿，鱼肠，“kamaboko”(-种蒸鱼团)，“chikuwa”(一种鱼团)和“tenpura”(一种日本多脂肪煎鱼团)，“chinmi”(开胃菜)如“uni-no-shiokara”(海胆的盐肠)，“ika-no-shiokara”(乌贼的盐肠)，“su-konbu”(加工过的tangle)，“sakic surmun”(干乌贼条)和“fugu-no-mirin-boshi”(干的mirin调味的河豚)；“tsukudani”(在酱油中煮的食物)如紫菜，可食用的野生植物，干乌贼，鱼和水生贝壳类动物，日常菜如“nimane”(烹饪的豆角)，西红柿沙拉和“konbu-maki”(tangle roll)；奶产品；罐装和瓶装产品如肉，鱼肉，水果和蔬菜；含醇饮料如合成的清酒，葡萄酒和烈酒；软饮料如咖啡，茶，可可，果汁，碳酸饮料，酸牛奶饮料和含乳酸菌的饮料；即食食品如即食布丁混合物，即食热糕点混合物和“sokuseki-shirueo”(adzuki豆汤与大米糕点的即食混合物)和即食汤混合物；和饮料，如婴儿食品、治疗用食品、营养品饮料；并改善上述食品的味道和质量。
也可将含本发明海藻糖和多糖的本发明海藻糖和多糖组合物用于动物如家养动物、家禽、蜜蜂、蚕和鱼的饲料和宠物食品，以改善其口味爱好。可以在团和液体形式和其它产品中，将海藻糖和多糖组合物用作甜味剂、味道改善剂、质量改善剂和稳定剂。如烟草、香烟、牙膏和牙膏粉、口红、胭脂、唇膏、内服药、片剂、锭剂、滴剂形式的鱼肝油、cachou、口服致冷剂、含漱剂、化妆品和药物。
可将含本发明海藻糖和多糖的本发明海藻糖和多糖组合物作为质量改善剂和稳定剂用于对其有效成分和活性的丧失敏感的生物活性物质，以及含生物活性物质的健康食品和药物组合物。上述生物活性物质的实例是淋巴细胞活素如α-，β-，和γ-干扰素，α-肿瘤坏死因子(TNF-α)，β-肿瘤坏死因子(TNF-β)，巨噬细胞迁移抑制因子，集落刺激因子，转移因子和白细胞介素2(IL-2)；激素如胰岛素，生长激素，泌乳素，红细胞生成素和卵泡刺激素；生物制品如BCG疫苗，日本脑炎疫苗，麻疹疫苗，活脊髓灰质炎疫苗，天花疫苗，破伤风类毒素，Trimeresurus抗毒素和人免疫球蛋白；抗生素如青霉素，红霉素，氯霉素，四环素，链霉素和硫酸卡那霉素；维生素如硫胺，核黄素，L-抗坏血酸，鱼肝油，类胡萝卜素，麦角甾 醇和生育酚；酶如脂酶，弹性蛋白酶，脲激酶，蛋白酶，β-淀粉酶，异淀粉酶，聚葡糖酶和乳糖酶；提取物如人参提取物，浓乌龟提取物，小球藻提取物，芦荟提取物光蜂胶提取物；可存活的微生物，如病毒，乳酸菌和酵母；其它生物活性物质如蜂王浆。通过使用含本发明海藻糖和多糖的本发明海藻糖和多糖组合物，可以很容易将上述生物活性物质加工成具有令人满意的高稳定性和质量的健康食品和药物组合物，而不必担心丧失或失活其有效成分和活性。
按上文所述，将含本发明海藻糖和多糖的本发明海藻糖和多糖组合物掺入上述物质的方法包括传统方法，例如，混合、捏合、溶解、融化、浸泡、渗透、喷淋、敷、涂上、喷、注射、结晶和固化。通常以0.1％或更高，优选的1％或更高(以干重计)的量，将含本发明海藻糖和多糖的本发明海藻糖和多糖组合物掺入上述的物质和组合物中。
下列实施例说明从根瘤菌M-11和节杆菌Q36微生物，以及迄今已知的微生物中生产并纯化本发明的海藻糖—释放酶。
实施例1用根瘤菌M-11生产海藻糖—释放糖将含2.0w/v％“PINE-DEX#4”(Matstani ChemicalZnd.Co.Ltd.Kyoto，Japan的淀粉产品)、0.5w/v％蛋白胨，0.1w/v％酵母提取物，0.1w/v％磷酸氢二钠，0.1w/v％磷酸氢钾和水的液体营养培养基，调pH到7.0。将约100ml等份的液体营养培养基放在500mlErlenmeyer烧瓶中，在120℃高压灭菌20分钟以灭菌，冷却，用根瘤菌M-11(CCTCC M 94031)种子培养物接种，并于130rpm的搅拌条件下，于27℃培养24小时。收集所得的培养物并用作种子培养物。
将约20升在上述培养中所用的所述液体营养培养基的新鲜制备物放在30升的发酵罐中，灭菌，冷却到27℃，用1w/v％的种子培养物接种，并在27℃，pH6.0-8.0，搅拌并通气的条件下培养约72小时。
在培养物中，积累的非还原多糖—形成酶和本发明海藻糖—释放酶的活性分别为约1.5单位/ml和约2单位/ml。将部分培养物离心，分离成细胞和上清液，并将细胞悬浮于50mM磷酸缓冲液(pH7.0)得到相同体积部分，接着检测细胞悬浮液和上清液的酶活性。在细胞悬浮液中，非还原多糖—形成酶和本发明海藻糖—释放酶的活性分别是约0.6单位/ml和约0.8单位/ml，而上清液含有.9单位/ml的非还原多糖—形成酶和约1.2单位/ml的本发明海藻糖—释放酶。
非还原多糖形成酶的检测如下将1ml酶溶液加到4ml 1.25w/v％麦芽五糖的50mM磷酸缓冲溶液(pH7.0)中，该混合溶液于40℃培养10分钟，并在100℃加热10分钟中止该酶反应。用一缓冲液将该所得反应混合物精确地稀释到10倍，并以Somogyi-Nelson′S方法测定其还原能力。作为对照，一种酶溶液，在100℃预热10分钟，使该酶失活，再用如上方法进行检测。该非还原多糖形成酶的一个活性单位定义为当使用上述方法检测时，每分钟消除1微摩尔的麦芽五糖的还原能力的酶量。
实施例2酶的纯化对由实施例1方法得到的约18L培养液进行处理，用“MINI-RABO”(一种超高压细胞破裂仪，由日本东京Dainippcn Pharmaceutical Co.，Ltd.经销)破裂细胞。所得悬浮液于100,000，rpm下离心30分钟得到约16L上清液。将硫酸铝加到上清液中并使其溶解得到0.2的饱和度，并将得到的溶液于4℃放置1小时，在10,000rpm下离心30分钟得到上清液。
将硫酸铝加到所得的上清液中并使其溶解得到0.6的饱和度，并将所得溶液于10,000rpm下离心30分钟，重新得到沉淀并将其溶于10mM磷酸缓冲液(pH7.0)中。如此得到的溶液在新鲜制备的相同的磷酸缓冲液中透析24小时，于10,000rpm下离心30分钟除去不溶物。将所得的360ml透析液分成两份，然后每份分别用以300ml“DEAE-Toyopearl”(由日本东京Tosoh Corporation上市的一种离子交换剂)装填的柱进行柱层析。
目标的非还原多糖形成酶和海藻糖释放酶被吸附于离子交换剂上，用新鲜制备的以不同盐浓度的盐补充的磷酸缓冲液将它们分别从柱上洗脱下来。图1表示了该柱或柱层析的洗脱图谱。在盐浓度为约0.2M时，非还原多糖形成酶被从柱上洗脱下来，而在盐浓度为约0.3M时，海藻糖释放酶被从柱上洗脱下来。分别合并含有任何一种目标酶的流份并精制。
把合并的含有非还原多糖形成酶的流份在新鲜制备的用2M硫酸铵补充的同一磷酸缓冲液中透析。透析液于10,000rpm下离心30分钟除去不溶物，所得上清液用以300ml“Butyl-Toyopearl?650”(一种疏水性凝胶，由日本东京Tosoh Corporation上市)装填的柱进行疏水性柱层析。用从2M到0M范围的线性梯度缓冲液将吸附于凝胶的酶从柱上洗脱下来，回收具有酶活性的流份。将所得流份用以300ml“Toyopearl?HW-55”(一种凝胶层析树脂，由日本、东京Tosoh Corporation上市)装填的柱进行凝胶过滤层析，回收具有酶活性的流份。
对“DEAE-Toyopearl?”柱洗脱的具海藻糖释放酶活性的合并流份，通过采用相似于非还原多糖形成酶制备中的纯化步骤进行处理，此种方法即在含2M硫酸铵的缓冲液中进行透析，随后进行疏水性柱层析和凝胶过滤层析。
表1显示了每个纯化步骤中非还原多糖形成酶的总酶活性、比活性及收率，而表2显示了海藻糖糖释放酶的相应内容。
表1纯化步骤总酶*活性(单位) 比活性 收率(％)(单位/mg蛋白)原料培养液 28,500 - 100细胞破裂后上清液22,900 0.12 80盐析后透析溶液 21,100 0.43 74离子交换柱洗脱液15,200 6.2 53疏水性柱洗脱液 7,950 101 28凝胶过滤柱洗脱液5,980 197 21注“*”符号表示非还原多糖形成酶。
表2纯化步骤 总酶**活性(单位) 比活性收率(％)(单位/mg蛋白))原料培养液 37,400 -100细胞破裂后上清液31,500 0.17 84盐析后透析溶液 29,200 0.60 78离子交换柱洗脱液25,400 5.3 68疏水性柱洗脱液 18,700 98.5 50凝胶过滤柱洗脱液11,600 240 31注“**”符号表示海藻糖释放酶。
纯化过的酶制品(由表1和2中凝胶过滤柱得到的洗脱液)，使用7.5％聚丙烯酰胺，在电泳上测定其纯度。结果，观察到每种酶制品均呈单一蛋白谱带，这表明它是具有较高纯度的电泳单一制品。
实施例3海藻糖释放酶的性质使用含10％十二烷基磺酸钠的聚丙烯酰胺凝胶，将由实施例2中方法得到的部分纯化的海藻糖释放酶制品进行电泳，并通过将它与日本东京Japan Bio-Racl Laboratories上市的标识蛋白进行比较，测得其分子量为约57,000-68,0000道尔顿。
使用含2v/v％“AMPHOLINE”(一种瑞典Uppsala Pharmacia LKB Biotechnology AB上市的两性电解质)，将另外部分的纯化酶制品进行等电点电泳(isoeletrohopresis)。将所得凝胶切成片，然后测定它们的pH值，得到该酶的pI为约3.3-4.3。
根据对酶活性的分析来研究温度和pH对该酶活性的影响。图2(温度的影响)和图3(pH的影响)分别显示了这些结果。
当于pH7.0培养30分钟时，该酶的适宜温度为约45℃，在40℃培养30分钟时，该酶的适宜pH为约6.0-7.5。
通过将在50mM磷酸缓冲液(pH7.0)中的酶在不同温度下培养60分钟，然后用冷水冷却测试试管中的缓冲液并测定每份缓冲液中残留的酶活性，从而来测定该酶的热稳定性。通过将在不同pH的50mM磷酸缓冲液中的酶于25℃下培养16小时，调整这些缓冲液至pH7.0，然后分析每份缓冲液中残留的酶活性来测定该酶的pH稳定性。图4和5分别显示了该酶的热和pH稳定性结果。该酶在温度高达约40℃和pH约5-10下是稳定的。
实施例4从末端为海藻糖结构且葡萄糖聚合度为3或更高的非还原多糖制备海藻糖按日本专利申请No.362,131/92所述的方法来制备非还原多糖，该糖用作底物，它具有海藻糖结构的末端且葡萄糖聚合度为3或更高。往作为底物的含20％麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖或麦芽七糖的水溶液中加入由实施例2方法得到的纯化的酶制品，2单位/g底物(d.s.b.)，将所得混合物于40℃和pH7.0下进行酶反应48小时。将该反应混合物加热，使残留的酶失活，过滤、脱色、脱盐并浓缩得到一种浓的糖溶液，然后用“XT-1016(Na型，聚和度为4％的一种离子交换剂，由日本东京Tokyo Oranic Chemical Industries，Ltd.上市)对该溶液进行柱层析。在柱层析中，用内径为2.0cm，长为1m的3个套层的不锈钢柱装填离子交换剂，然后将这些柱顺序级联并加热至柱内温达55℃，将5v/v％浓糖溶液(对树脂量)上样，当温度保持在55℃，且在SV(体积速度)为0.13下用55℃热水洗脱(feed)，得到高纯度的非还原多糖，该糖具有海藻糖结构的末端且葡萄糖聚合度为3或更高。在得到的制品中，葡糖基海藻糖制品含葡糖基海藻糖的纯度为97.6％(d.s.b.)，麦芽糖海藻糖、麦芽三糖基海藻糖、麦芽四糖基海藻糖和麦芽五糖基海藻糖在它们的高纯度制品中的纯度分别为98.6％、99.6％、98.3％和98.1％(d.s.b.)。
配制含20％(d.s.b.)上述5种非还原多糖制品，即糖基海藻糖制品中的一种的水溶液，然后将该溶液与实验例2中得到的纯化的海藻糖释放酶混合，2单位/9底物(d.s.b.)，然后将所得溶液于40℃和pH7.0进行酶反应48小时。把得到的每种反应混合物脱盐并经高压液相色谱(HPLC)(使用日本东京Wako Pure Chemical Industries Ltd.的“WAKOBEADSWB-T-330柱”)分析其组成。作为对照，将新鲜制备的同样的海藻糖释放酶作用于麦芽糖寡糖，例如麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖和麦芽七糖，并经HPLC分析得到的每种反应混合物的组成。表3显示3该结果。
表3底物 产物HPLC上洗脱时间(min) 百分率(％)海藻糖27.4 17.5葡糖基海藻糖 葡萄糖33.8 6.5葡糖基海藻糖 23.3 76.0海藻糖27.4 44.3麦芽糖基海藻糖麦芽糖28.7 44.4麦芽糖基海藻糖21.6 11.3海藻糖27.4 39.5麦芽三糖基海藻糖 麦芽三糖 25.9 60.0麦芽三糖基海藻糖 19.7 0.5海藻糖27.4 34.2麦芽四糖基海藻糖 麦芽四糖 24.1 65.5麦芽四糖基海藻糖 18.7 0.3
表3(续)底物 产物HPLC上洗脱时间(min) 百分率(％)海藻糖27.4 29.1麦芽五糖基海藻糖麦芽五糖 22.6 70.6麦芽五糖基海藻糖 -17.8 0.3麦芽三糖 麦芽三糖 25.9 100麦芽四糖 麦芽四糖 24.1 100麦芽五糖 麦芽五糖 22.6 100麦芽六糖 麦芽六糖 21.8 100麦芽七糖 麦芽七糖 21.0 100
表3中的结果表明1、根据本发明的海藻糖释放酶特异地水解具有海藻糖结构末端和葡萄糖聚合度为3或高于3的非还原多糖中的海藻糖部分和糖基部分之间的键，形成海藻糖和一种葡萄糖聚合度为1或大于1的非还原糖；且2、麦芽糖寡糖不被本发明的海藻糖释放酶所水解。
这些结果证实本发明的海藻糖释放酶是一种新酶，它具有特异地水解带有海藻糖结构末端且葡萄糖聚合度为3或大于3的非还原多糖中的海藻糖部分和糖基部分间的键，从而将海藻糖从非还原多糖中释放出来。
为纯化各种反应混合物中的海藻糖，将该反应混合物用以“XT-1016(Na+型)”(一种碱金属型强酸阳离子交换树脂，由日本东京Tokyo Organic Chemical Industries，Ltd.上市)装填的柱进行柱层析，之后回收含97％或更高的海藻糖的流份。将这些流份合并并浓缩至约65％浓度，将该浓缩物于25℃放置2天使其结晶出水合结晶海藻糖，然后分离出这些结晶并真空下干燥得到纯度为99％或更高的高纯度海藻糖制品(d.s.b.)。用葡糖基海藻糖、麦芽糖基海藻糖、麦芽三糖基海藻糖、麦芽四糖基海藻糖和麦芽五糖基海藻糖为底物制备海藻糖的收率分别为9.5％、14.9％、16.0％、18.5％和17.7％(d.s.b.)。研究了高纯度海藻糖制品和市场上购得的海藻糖样品(作标准品)的熔点、融化热、比旋光、红外吸收光谱、粉末的X-衍射图谱及被从猪肾中得到的海藻糖酶样品(从美国St.Lauise，Sigma Chemical Co.购得)水解的容易性。结果，各种海藻糖制品显示的熔点为97.0±0.5℃、融化热为57.8±1.2KJ/mol和比旋光为+182±1.1°，这些数值与标准海藻糖样品的数值十分吻合，还有海藻糖的红外吸收光谱和粉末X-衍射图也与标准海藻糖样品十分吻合。
与标准的海藻糖样品相似，这些海藻糖制品分解为葡萄糖单体。
这些结果明确证实，由本发明的海藻糖释放酶作用于具有海藻糖结构末断且葡萄糖聚合度为3或大于3的非还原多糖形成的非还原多糖是海藻糖。
实施例5从非还原性的淀粉部分水解产物制备海藻糖经加热使含5％蜡状玉米淀粉的悬浮液明胶化，调至pH4.5，加热到50℃，与一种异淀粉酶(isoamylase)样品(由日本Okayama，Hayashibara Biochemical Laboraloies Inc.上市)以4,000单位/g淀粉(d.s.b.)的量混合，并使该酶反应持续20小时。该反应混合物于120℃高压灭菌10分钟，冷至60℃，然后用以750ml“Toyopearl?50s凝胶”(由日本东京Tosoh Corporation上市)装填的柱进行凝胶过滤层析，得到葡萄糖聚合度为35-10的还原性淀粉部分水解产物。
将作为底物的一种如此得到的还原性淀粉部分水解产物或葡萄糖聚合度为3的麦芽三糖溶于10mM磷酸缓冲液(pH7.0)制成1％溶液，然后将该溶液与纯化的非还原多糖形成酶和纯化的海藻糖释放酶(以实施例2中方法制备)以4单位/g底物(d.s.b.)的量混合，并于40℃进行酶反应24小时。待酶反应完全后，将得到的每种反应混合物进行脱盐并经HPLC分析其组成。
将剩余的每种反应混合物加热到50℃，调pH至4.5，以50单位/g底物(d.s.b.)的量与葡糖淀粉酶样品(由日本东京Seikagakukogyo Co.，Ltd.上市)混合，然后进行24小时酶反应。与上面相似，将得到的部分反应混合物进行脱盐并以HPLC分析其组成。表4显示了该结果。
表4还原性淀粉部分水解 反应产物 组成(％)产物的葡萄糖聚合度 A B**海藻糖 80.8 83.5葡萄糖 0.216.534.1还原寡糖14.4 0.0糖基海藻糖 4.60.0海藻糖 79.7 82.5葡萄糖 0.217.526.2还原寡糖15.3 0.0糖基海藻糖 4.80.0海藻糖 77.7 80.7葡萄糖 0.219.318.1还原寡糖17.0 0.0糖基海藻糖 5.10.0海藻糖 75.0 78.5葡萄糖 0.321.515.2还原寡糖18.6 0.0糖基海藻糖 6.10.0海藻糖 66.1 70.1葡萄糖 0.329.910.0还原寡糖27.6 0.0糖基海藻糖 7.70.0海藻糖 4.220.83 葡萄糖 2.179.2(麦芽三糖)麦芽三糖65.0 0.0糖基海藻糖 28.7 0.0注符号“*”表示一种非还原多糖形成酶与本发明的海藻糖释放酶的酶反应后的组成，符号“**”表示葡糖淀粉酶的酶反应后的组成。表中“糖基海藻糖”一词表示具有海藻糖结构末端且葡萄糖聚合度为3或大于3的非还原多糖。
如表4所示，在使用葡萄糖聚合度为3的麦芽三糖为底物的情况下，经非还原多糖形成酶与本海藻糖释放酶发生酶反应后的海藻糖收率比较低，即4.2％，但在使用葡萄糖聚合度为10-34.1的淀粉部分水解产物为底物的情况下，该海藻糖的收率比较高，即66.1-80.0％。并发现还原性淀粉部分水解产物的葡萄糖聚合度越高，所得海藻糖的纯度也越高。还发现通过使葡糖淀粉酶作用于由两种酶水解还原性淀粉部分水解产物制得的反应混合物，将伴生的具有海藻糖末端且葡萄糖聚合度为3或大于3的非还原多糖水解成海藻糖和葡萄糖分子，能提高所得海藻糖的浓度。
实施例6美拉德反应将含1％甘氨酸、10％高纯度海藻糖制品(纯度为99.5％，d.s.b.，通过实施例4的方法得到)和50mM磷酸缓冲液(pH7.0)的溶液于100℃保持90分钟，然后冷却该所得溶液并在1-cm槽中测定它在480nm波长处的吸收。作为对照，对葡萄糖和麦芽糖进行与上面相似的处理，再测定所得溶液于480nm波长处的吸收。表5显示了该结果。
表5糖制品 颜色程度(480nm)海藻糖(本发明) 0.006葡萄糖(对照) 1.671麦芽糖(对照) 0.926表5的结果明显地揭示本发明的海藻糖制品经美拉德反应诱导仅表现出较浅的颜色，即其颜色程度仅为葡萄糖和麦芽糖的约0.4-0.6％。
该结果表明，本发明的海藻糖基本上不参与美拉德反应。因此，本发明的海藻糖是一种当它们与氨基酸混合时，对氨基酸的破坏威胁性较小的一种糖。
实施例7体内利用试验按照Atsuji等在“Rinsho-Eiyo”，Vol.41，No.2，pp200-208(1972)上报道的方法，把通过实施例4的方法得到的309高纯度的海藻糖制品(纯度为99.5％，d.s.b.)溶于水中制成20w/v％的水溶液，然后将该溶液给六名健康的男性志愿者(26、27、28、29、30和31岁)口服。按计划时间间隔采集这些志愿者的血样，分析每份采集血样的血糖和胰岛素水平。用葡萄糖作为对照。结果，海藻糖表现出与葡萄糖相同的动力学，即在他们口服后约0.5-1小时后，其血糖和胰岛素的水平最高。还表明该海藻糖制品很容易被消化、吸收、代谢并被机体用作能量来源。
实施例8急性毒性试验给小鼠口服由实施例4中方法得到的高纯度海藻糖制品(纯度为99.5％，d.s.b.)来进行其急性毒性试验。结果表明该海藻糖是一种毒性较低的物质，并且在以最高的可能剂量施用于小鼠时没有小鼠死亡。虽然不太精确，该海藻糖制品的LD50为50g/kg或更高。
实施例9由节杆菌Q36生产海藻糖释放酶与实施例1相似，用一发酵器，用节杆菌Q36的种子培养物代替根瘤菌M-11(CCTCC M94031)的种子培养物培养72小时。在所得的培养液中，非还原多糖形成酶和本发明的海藻糖释放酶活性分别为约1.3单位/ml和约1.8单位/ml。与实施例1相似，对由所得到的培养液制备的细胞悬浮液和培养液上清液进行分析。前者的非还原多糖形成酶活性为约0.5单位/ml和海藻糖释放酶的活性约为0.5单位/ml，而后者的非还原多糖形成酶活性为约0.8单位/ml和海藻糖释放酶活性为约1.3单位/ml。
实施例10酶的纯化用通过实施例9中方法得到的18L培养液，与实施例2相似来纯化生成的非还原多糖形成酶。表6表示了每一纯化步骤的结果。
表6
注符号“*”表示非还原多糖形成酶。
表7
注符号“**”代表本发明的海藻糖释放酶。
通过采用与实施例2相似的电泳方法， 对从表6和7中凝胶过滤层析柱洗脱液得到的纯化的非还原多糖形成酶和海藻糖释放酶的活性进行研究。结果分别观察到它们为单一蛋白谱带，这表明它们是纯度较高的酶制品，在电泳上显示出单一谱带。
实施例11酶的性质在SDS-PAGE上测定用实施例10的方法得到的纯化海藻糖释放酶制品的分子量为约57,000-67,000道尔顿。以相似于实施例3中的等电点电泳法测定该酶的pI值为约3.6-4.6。与实施例3相似研究温度和pH对该酶活性的影响及其热稳定性和pH稳定性。图6，7，8和9分别显示了该温度影响、pH影响、热稳定性和pH稳定性。
从这些图明确该酶制品的适宜温度为约45℃；适宜pH为约6.0-7.5；热稳定性高达约45℃；且pH稳定性为约5.0-10.0。
实施例12从具有海藻糖结构末端且葡萄糖聚合度为3或大于3的非还原多糖来制备海藻糖按实施例4的方法，通过使用以实施例10中的方法得到的纯化酶制品来试验性地从具有海藻糖末端且葡萄糖聚合度为3或大于3的非还原多糖来制备海藻糖。结果表明，该酶制品从非还原多糖(与从根瘤菌M-11得到的糖相似)中释放出了海藻糖。
实施例13由已知微生物生产的海藻糖释放酶及其性质迄今已知的微生物菌株中的微黄短杆菌(ATCC11822)和玫瑰色微球菌(ATCC186)，已被发明者证实它们能产生本发明的海藻糖释放酶，与实施例1相似，将这两种菌株分别在发酵器中于27℃培养72小时。将所得的每种菌株的18L培养液于细胞破裂仪上使细胞破裂、并离心得到上清液，然后顺序用硫酸铵盐析、透析，再经离子交换柱得到部分纯化的酶制品，然后研究它的性质。根瘤菌M-11和节杆菌Q36的那些结果一起列于表8中。
表8微生物离酸换柱洗脱液的适宜温度 适宜PH热稳定性PH稳定性酶活性(单位)(℃) (℃)微黄短杆菌(ATCC6,070 约40 约6.5～6.8 高达约40约5.5～9.511822)玫瑰色微球菌(ATCC 3,010 约35 约6.8高达约30约6.5～7.2186)根瘤菌M-11 25,400 约45 约6.0～7.5 高达约40约5.0～10.0(CCTCC M 94031)节杆菌Q36(CCTCC22,700 约45 约6.0～7.5 高达约45约5.0～10.0M94030)
按实施例12的方法，试验性地从具有海藻糖结构末端且葡萄糖聚合度为3或大于3的非还原多糖来制备海藻糖。结果表明，与由根瘤菌M-11得到的海藻糖形成酶相似，试验的每种酶制品都从非还原多糖生成了海藻糖。
实施例14含N-末端的氨基酸序列将由根瘤菌M-11得到的部分纯化酶制品(通过实施例2中方法得到)和由节杆菌Q36得到的部分纯化酶制品用蒸馏水渗析，使用每种得到的制品的约80μg蛋白为样品测定它们的含N-末端的氨基酸序列。用“PROTEIN SEQUENCER MODEL 473A”(一种美国Foster城Applied Biosystem，Inc。的仪器)分析氨基酸序列，揭示了其N-末端的10个氨基酸残基。表9表示了部分酶制品的含N-末端的氨基酸序列。
表9起始菌 含N-末端的部分氨基酸序列根瘤菌M-11 Ala-lys-Pro-Val-Gln-(CCTCC M 94031)Gly-Ala-Gly-Arg-Phe节杆菌Q36 Thr-Pro-Thr-Tyr-Pro-(CCTCC M 94030)Arg-Glu-Arg-Ala-lys表9明确表明从根瘤菌M-11得到的酶制品的N-末端是Ala.，Ala接下来的氨基酸序列是Lys-Pro-Val-Gln-Gly-Ala-Gly-Arg-Phe。在从节杆菌Q36得到的酶制品中，N-末端是Thr.，其接下来的氨基酸序列为Pro-Thr-Tyr-Pro-Arg-Glu-Arg-Ala-Lys。
实施例14(2)内部氨基酸序列将从根瘤菌M-11得到的酶制品(通过实施例2的方法获得)和从节杆菌Q36得到的酶制品(通过实施例10的方法获得)在10mM Tris-Hcl缓冲液中进行透析，得到的透析液分别用新鲜配制的相同的缓冲液稀释得到约1mg/ml浓度溶液。往所得的每份1ml等份的溶液中加入10μg“LYSYL ENDOPEPIDASE”(一种日本.东京，Wako Pure Chemcal Industries，Ltd.的产品)，使其于30℃反应22小时生成肽，然后运用反相高压液相层析(反相HPLC)分离出该肽。分离从根瘤菌M-11得到的酶制品的肽所用的反相HPLC的设备和条件是“CAPCELL PAK C18柱”，直径为4.6mm，长250mm(日本东京Shiseido Co.，Ltd.的产品)；流速，0.6ml/min；温度，室温；洗脱时间，60min；梯度，含有0.1V/V％三氟乙酸和16～48V/V％乙腈的线性梯度溶液。分离从节杆菌Q36得到的酶制品的肽所有的反相HPLC的设备和条件为“μ-BONDAPAK C18柱”，直径2.1mm，长150mm(美国Milford，Chromatography Div.，MILLPORE Corp.的产品)；流速，0.9ml/min；温度，室温；洗脱时间，60min；梯度，含有0.1V/V％三氟乙酸和30～55V/V％的乙腈的线性梯度溶液。通过测定210nm波长处的吸收来检测从柱上洗脱下来的肽。从根瘤菌M-11的酶制品得到的三种肽称为RT41、RT46和RT54的肽(其保留时间分别为约41、46和54)被从其它伴生的肽中分离出来，从节杆菌Q36的酶制品中得到的三种称为AT7、AT30和AT48的肽(其保留时间分别为约7、30和48)被从其它伴生的肽中分离出来，之后真空干燥该分离出的肽，并将所得的肽溶于0.1～50V/V％不同浓度乙腈的200μl溶液中。在-蛋白序列仪上分析如此得到的肽样品的多至10个氨基酸残基的氨基酸序列。表10显示了分析出的内部氨基酸序列。
表10起始菌 肽内部氨基酸序列根瘤菌M-11RT41His-Gly-Glu-Gly-Asn-Thr-Try-Gly-Asp-Se(CCTCCRT46Asp-Glu-Arg-Ala-Val-His-Ile-Leu-Glu-GluM 94031) RT54Leu-Asp-Try-Ala-Glu-Ala-Ser-Ala-Gly-Asp节杆菌Q36 AT30Gln-Gly-Glu-Gly-Asn-Thr-Try-Gly-Asp-Ser(CCTCCAT48Asp-Glu-Arg-Ala-Val-His-Ile-Leu-Glu-AspM 94030) AT7 Leu-Asp-Try-Ala-Glu-Ala-Ala-Glu-Gly-Asp
如表10所示，从根瘤菌M-11得到的酶的肽RT41的内部氨基酸序列中10个氨基酸残基中的9个与从节杆菌Q36得到的酶的肽AT30的内部氨基酸序列中10个氨基酸残基中的9个相一致，而肽RT46中10个氨基酸残基中的9个与肽AT48中的相一致。在肽RT54和AT7中，它们的10个氨基酸残基中的8个是一致的。因此，可以断定从根瘤菌M-11菌种得到的酶与从节杆菌Q36菌种得到的酶在其内部氨基酸序列上具有比较高的同源性，该序列可表示为Leu-Asn-Trp-Ala-Glu-Ala-X1-X2-Gly-Asp(“X1”代表“Ser”或“Ala”，“X2”代表“Ala”或“Glu”)；Asp-Glu-Arg-Ala-Val-His-Ile-Leu-Glu-X3(X3代表“Glu”或“Asp”)；和X4-Gly-Glu-Gly-Asn-Thr-Try-Gly-Asn-Ser(其中“X4”代表“His”或“Gln”)。
下述实施例A描述了本发明海藻糖释放酶的制备，用该酶制备的海藻糖及含海藻糖的糖组合物；实施例B描述了含一种或多种这类海藻糖和糖的组合物实施例A-1按实施例1的方法，将根瘤菌M-11(CCTCC M94031)的种子培养物接种到一营养培养基上，并在发酵器中培养80小时。发酵完后，将所得的培养液用-SF-膜过滤除去细胞，得到约18L滤液，再用SF-膜将该滤液浓缩成约1L的酶溶液，该溶液含17.2单位/ml的非还原多糖形成酶和20.8单位/ml的海藻糖释放酶。
往15％的土豆淀粉悬浮液(d.s.p.)中加入碳酸钙使其终浓度达0.1％(d.s.b.)，将所得溶液调至PH6.0，与0.2％(重量)的“TERMAMYL 60L”(一种α-淀粉酶样品，从丹麦、哥本哈根NoVo Industri A/S上市)混合，接下来于95℃进行酶反应15分钟。该反应混合物在2Kg/Cm2压力下高压灭菌消毒30分钟，冷却至45℃，以1,000单位/g淀粉(d.s.b)的量与“PULLULANASE(EC3、2、1、41)”(一种由日本Okay-ama的Hayashibara Biochemical Laboratories，Inc.上市的酶样品)混合，及以0.2ml/g淀粉(d.s.b)的量与上述酶溶液混合，接下来进行48小时的酶反应。如此得到的反应混合物于95℃保持10分钟，冷却并过滤，所得滤液以常规方法用活性炭脱色，用H-和OH-型离子交换剂脱盐并纯化，之后再将得到的溶液浓缩得为60％糖浆，收率约为92％(d.s.b.)。
该糖浆含有70.2％海藻糖、2.4％葡糖基海藻糖、3.3％麦芽糖基海藻糖、0.7％葡萄糖、10.1％麦芽糖、12.9％麦芽三糖和0.4％的麦芽四糖和高级寡糖(d.s.b.)，它具有中等和高质感甜味，较低的还原性及适宜的粘度和保湿性能。由于这些性质，它可任意地用于食品、化妆品和药品中，作为甜味剂、矫味剂、增质剂(quality-improving agent)、稳定剂、稀释剂、填充剂和赋形剂。
实施例A-2通过实施例1的方法得到的糖溶液为原料溶液，用以“XT-1016(Na+-型，4％的聚合度)(一种碱金属型强酸阳离子交换树脂，由日本东京Tokyo Organic Chemical IndustriesLtd.上市)填装的柱分离。该过程如下用内径为5.4Cm的4个套层的不锈钢柱装填树脂，将该柱顺序级联使得到的总凝胶床深度为20m。将该柱加热到柱内温度为55℃，并在该温度保持下，以5V/V％的糖溶液(对树脂)上柱，用55℃热水洗脱(feed)分离该糖溶液，以除去伴生的糖，例如麦芽糖和麦芽三糖，之后收集富集海藻糖的流份。将得到的该流份合并、纯化、浓缩、真空干燥并粉碎得到高浓度海藻糖粉，收率为约56％(d.s.b.)。
该产物中海藻糖的浓度为约97％(d.s.b.)，且该产物具中等及高质感的甜味，因此它可任意地用于食品、化妆品和药品中作为甜味剂、矫味剂、增质剂、稳定剂、赋形剂和填充剂。
实施例A-3通过实施例A-2方法得到的高浓度海藻溶液，以常规方法用活性炭脱色，用离子交换剂脱盐，并浓缩成70％溶液，然后将该溶液放入结晶皿中，混入约2％水合海藻糖结晶作为晶种，再逐渐冷却得到-糖膏，其结晶率为约45％。该糖浆在150Kg/Cm2的高压下经安装于干燥塔顶部的喷嘴喷雾。在喷雾过程中，同时以从干燥塔顶部送入的85℃热空气使糖浆通风，用位于干燥塔底部的金属丝网收集得到的结晶粉末，并在45℃的空气流从下向上流经金属丝网时缓缓移出结晶粉末。得到的结晶粉末注入老化塔中老化10小时使完全结晶并干燥，再重新得到粉状水合结晶海藻糖，收率为约90％(对高含量海藻糖流份而言，d.s.b.)。
该产物基本上不吸湿，便于保存，因此使它可任意地用于食品、化妆品和药用，作为甜味剂、矫味剂、增质剂、稳定剂、赋形剂和填充剂。
实施例A-4
与实施例A-3相似，纯化通过实施例A-2方法得到的高浓度海藻糖流份，将所得溶液置于蒸发器中，真空蒸发得到糖浆，其湿度约为3.0％。所得糖浆放在结晶皿中，混入占糖浆干重1％的水合结晶海藻糖，在搅拌下于120℃结晶5分钟，将得到的混合物置于-铝质平面容器中，于100℃老化6小时得到块状物。
将所得块状物用