专利名称:用于组织粘合剂的原位成型水凝胶及其生物医学用途的制作方法随着组织粘合剂研究和开发中的巨大发展,创伤护理市场(该市场中大部分针对封闭剂(sealants)和止血剤)快速地增长。由1998年FDA对纤维蛋白封闭剂的授权许可而引发,该市场中每年都会出现新的组织粘合剤。注意力现在集中在了作为用于常规外科手术或体内手术(如縫合术、夹闭木、烧灼术等)中的组织粘合剂的替代物的这些组织粘合剂。常规的外科手术技术(如縫合木)保证了强拉伸强度,但是具有疼痛和需要在术后进行拆线的缺点。另ー方面,组织粘合剂享有粘合时间短、用法简单、不需要术后移除等优点,但是,组织粘合剂表现出粘合性低、生物相容性差和拉伸强度差以及尤其是在水分存在的情况下粘合性显著降低的问题。研究现在集中于克服这些问题。与组织直接接触的必要性要求组织粘合剂必须具有生物相容性。进ー步而言,由于一般在生物体内使用组织粘合剤,例如在可与体液或血液直接接触的位置使用组织粘合剂,因此,必须对医用粘合剂应用更加严格的涉及毒性和有害性方面的条件及严格的生物相容性和生物降解性标准。尽管组织粘合剂必须显示出与其所使用的不同区域或领域(如皮肤、血管、消化器官、脑神经、整形外科手术、骨外科手术(orthopedic surgery )、普通外科手术等)相对应的性质,组织粘合剂都需要具有共同的下述性质1)在大气压カ下于室温中(甚至在水分存在的情况下)必须快速粘合至靶区域;2)必须没有毒性且能够被灭菌;3)必须维持足够的机械强度并与创伤表面紧密接触;4)必须是生物可降解的井能够控制止血;和5)必须对创伤愈合有效。目前商品化和/或使用的组织粘合剂有瞬时氰基丙烯酸酯胶(glues)、纤维蛋白胶、明胶胶和聚氨酷。最近,由于瞬时氰基丙烯酸酯胶具有高粘合性和高性能,人们对其有所关注。尤其是,由于用于组织闭合的瞬时胶具有的有益效果(包括止血、抗菌活性和能够作为縫合线的替代物),在发达国家中已经对该瞬时胶(具有生物相容性、柔韧性和低毒性) 进行了深入的研究。氰基丙烯酸酯组织粘合剂是可商购的,商品名为DermaboncK Johnson&Johnson)或 Indermil (US Surgical)。这些由单一物质组成的氰基丙烯酸酯粘合剂可以仅使用水、而不需要引发剂的协助,于室温下在短时间段内固化,并且显示出透明的外观和强粘合強度, 但是对碰撞和热的抵抗力都很低。此外,尽管氰基丙烯酸酯粘合剂已部分用于临床领域,但是高毒性和易破裂性(fragility)限制了它们的用途。在1998年,纤维蛋白胶最早得到了 FDA批准,从那以后已将其应用于心脏手术。对纤维蛋白封闭剂的积极研究产生了商业化的产品,例如,Tisseel VH (Baxer)和 Evicel (Johnson&Johnson)。纤维蛋白封闭剂和氰基丙烯酸酯封闭剂一起占据了组织粘合剂市场的主要份额。 利用纤维蛋白的凝結,纤维蛋白封闭剂的两个主要成分为纤维蛋白原和凝血酶,它们联合使用了氯化钙和因子XIII。作为对縫合术的替代或加固,将该封闭剂应用于外周神经和微细血管的闭合。与以前的止血方法相比,纤维蛋白封闭剂具有多个优点不受水的影响,它们加速靶部位处稳定结块的形成,此外,它们可以和血小板一起形成结块而无限制,并且在生物相容性方面很出色。然而,它们存在着粘合強度低、生物降解快和具有感染风险的缺点。明胶胶(源自生物体)为ー类用明胶-间苯ニ酚-福尔马林(GRF)开发的组织粘合剂。此外,存在由明胶-戊ニ醛制成的组织粘合剤。尽管这些组织粘合剂提供了高粘合性, 但福尔马林或戊ニ醛会与靶组织的蛋白质进行交联反应,产生组织毒性。作为柔韧粘合剂开发的聚氨基甲酸酯粘合剂在固化后可使闭合维持在其天然状态。这些粘合剂从组织表面吸收水以使其自身快速粘着至组织。这些粘合剂与水反应以在数分钟内固化,固化后的粘合剂除具有柔韧性外还适当地生物降解。然而,聚氨基甲酸酯粘合剂中使用的物质芳香族ニ异氰酸酯对生物体是有毒的。因此,到目前为止开发出的组织粘合剂在毒性和低粘合性方面仍具有缺点。作为这些问题的解决方案,3,4- ニ羟苯基-L-丙氨酸(DOPA)变得流行并已得到深入研究。多巴是天然存在的氨基酸。在多酚氧化酶存在的情况下,酪氨酸(在贻贝的足丝 (foot of mussels)中大量发现)被羟基化为多巴。该氨基酸与亲水表面形成非常强的氢键,与金属或半金属形成强配位共价键。被氧化为多巴醌后,多巴残基发挥使蛋白质分子交联的作用。基于多巴的组织粘合剂是可商购的,被称为Cell-Tak (BD Bioscience Clontech)和 MAP (Swedish Bioscience Lab)。然而,这些产品需要多达 10,000 只贻贝以生产Ig足丝蛋白。这ー低提取产率和高生产成本限制了该粘合剂的用途。实际上,该产品主要用于细胞或组织培养。为了克服现有技术中遇到的问题,Cha教授(Postech大学,韩国)开发了一种提取贻贝足丝蛋白的方法。发现基于Cha的方法开发出的组织粘合剂的粘合強度比纤维蛋白胶的粘合强度要高 4 倍(Cha 等,Journal of Adhesion and Interfaces 2008)。然而,尽管改进了很多,这ー方法还是不能提供令人满意的生产产率,蛋白质纯化过程中的生产产率仍仅为50-60%。Phillip B. Messersmith教授在2007年开发了基于多巴的另ー种组织粘合剤。 该组织粘合剂是可注射的生物粘合聚合物水凝胶,该水凝胶是利用酶由经谷氨酰胺底物修饰的PEG-ニ胺制备的(Phillip B. Messersmith等,US 7208171 B2)。然而,所制备的水凝胶保留了大约IOOPa的机械强度,并且具有和纤维蛋白胶ー样高或是纤维蛋白胶两倍高的粘合強度。基干支化-PEG或PMMA-PtBMA-PMMA三嵌段(二者都用多巴衍生物进行了修饰),Phillip B. Messersmith还开发了原位成型凝胶生物粘合水凝胶和ー种表面涂覆方法(Phillip B. Messersmith 等,US 2008/0247984 Al、US 2007/0208141 Al、US 2008/04149566 Al、US 2009/0163661 Al、US2003/0087338 Al、WO 2008/049108 Al、WO 2008/091386 A2)。8该缀合有多巴衍生物的水凝胶显示出了高粘合強度,克服了在先的问题。然而,凝胶化需要至少30s,并且水凝胶交联使用了有毒氧化剂(如NaI04、FeCl3等)。因此,在原位成型的背景下,存在着对如下生物粘合水凝胶的巨大需要所述生物粘合水凝胶需要的凝胶化时间短,并显示出出色的机械强度、良好的生物相容性、适当的生物降解性以及甚至在水存在的情况下也具有快速且强的粘合性。
技术问题本发明人通过对生物粘合剂进行深入和彻底的研究,旨在克服现有技术中遇到的问题,产生了本发明,得到了如下发现当合成的聚合物与天然存在的聚合物共混 (hybridized)吋,水凝胶显示出出色的生物相容性和机械强度;当用多巴衍生物对该水凝胶进行修饰后,水凝胶具有出色的生物粘合性。因此,本发明的目的是提供一种原位成型生物粘合水凝胶,所述水凝胶除显示出出色的生物稳定性、生物相容性和机械强度外,还具有出色的生物粘合性。本发明的另ー目的是提供原位成型水凝胶作为用于生物粘合剂和止血剂材料的用途,所述水凝胶在生物稳定性、生物相容性、机械强度和生物粘合性方面很出色。本发明的又一目的是提供原位成型水凝胶作为用于组织再生和填充的植入材料的用途,所述水凝胶在生物稳定性、生物相容性、机械强度和生物粘合性方面很出色。本发明的另ー目的是提供原位成型水凝胶作为用于递送生物学活性物质或药物的载体的用途,所述水凝胶在生物稳定性、生物相容性、机械强度和生物粘合性方面很出色。技术方案本发明提供了由下述化学式4-7之一表示的原位成型生物粘合水凝胶,其中,两种以上的同质聚合物或异质聚合物通过相邻聚合物上的苯酚、苯胺、多巴及它们的衍生物之间的脱氢作用彼此键合,所述同质聚合物或异质聚合物选自于由下述聚合物所組成的组i)由下述化学式1表示的星形聚合物,其中,用选自多巴及其衍生物中的ー种或多种化合物对选自苯酚、苯胺及它们的衍生物中的ー种或多种化合物进行修饰;ii)异质共混物, 该共混物包含化学式1的星形聚合物以及由下述化学式2表示的支化聚合物,所述支化聚合物中,用选自苯酚、苯胺及它们的衍生物中的ー种或多种化合物对聚合物骨架进行接枝, 用或不用水溶性聚合物充当所述聚合物骨架和用于接枝的所述ー种或多种化合物之间的接头;和iii)由下述化学式3表示的支化聚合物,所述支化聚合物中,用选自苯酚、苯胺及它们的衍生物中的ー种或多种化合物对聚合物骨架进行接枝,用或不用水溶性聚合物充当所述聚合物骨架和用于接枝的所述ー种或多种化合物之间的接头。有益效果本发明提供了原位成型生物粘合水凝胶,由于用或不用多巴衍生物进行修饰,该水凝胶具有出色的生物相容性和机械强度以及出色的组织粘合性。尤其是,发现本发明的水凝胶在生物医学领域中有许多应用,包括生物粘合剂或止血剂;原位成型组织工程支架;用于蛋白质、DNA、生长因子、細胞等的缓释药物递送系统;组织填充;创伤愈合;以及防止器官粘合。9
将下述详细说明与附图结合,会更加清楚地理解本发明的上述及其他目的、特征和优势,其中图1示出合成Tet-TA/DA的反应历程;图2示出合成GHPA的反应历程;图3示出合成CHPA的反应历程;图4示出合成GPEG-TA共聚物的反应历程;图5示出合成CPEG-TA共聚物的反应历程;图6示出合成HA-PEG-TA/DA共聚物的反应历程;图7示出合成CMC-PEG-TA/DA共聚物的反应历程;图8示出合成ALG-PEG-TA/DA共聚物的反应历程;图9-图12为示出原位成型生物粘合水凝胶的酶促制备的反应历程;图13为示出使用双注射器试剂盒或使用安装有喷嘴的双注射器试剂盒制备原位成型生物粘合水凝胶的ー组照片;图14为示出按HRP浓度绘制的原位成型生物粘合水凝胶的凝胶化时间的图;
图15为示出Tet-TA/DAI和Tet-TA/DAI I之间的机械强度比较以及Tet-TA/ DAII+CHPA水凝胶和"Tet-TA/DAII+GPEG-TA水凝胶的机械强度随Tet_TA/DAII浓度变化的 ー组图;图16为示出生物粘合水凝胶的体外稳定性随时间变化的图;图 17 为示出!"et-TA/DAII 水凝胶、!"et-TA/DAII+GPEG-TA 水凝胶、iTet-TA/ DAII+CPEG-TA 水凝胶、HA-PEG-TA/TA 水凝胶、CMC-PEG-TA/DA 水凝胶和 AGL-PEG-TA/DA 水凝胶对2D細胞的生物相容性的一组照片;图 18-图 24 为示出水凝胶 Tet-TA 和!"et-TA/DAII (18) Jet-TA/DAII+GHPA (19); Tet-TA/DAII+CHPA(20);Tet-TA/DAII+GPEG-TA (21);Tet-TA/DAII+CPEG-TA (22);GPEG-TA, CPEG-TA Jet-TA+GPEG-TA 和 Tet-TA+CPEG-TA (23);以及 HA-PEG-TA/DA,CMC-PEG-TA/DA 和 ALG-PEG-TA/DA (24)的粘合強度的图,以纤维蛋白胶和氰基丙烯酸酯作为对照;图25 为示出 Tet-TA 水凝胶、Tet-TA/DAII 水凝胶、Tet-TA/DAII+CHPA 水凝胶和 Tet-TA/DAII+GPEG-TA水凝胶的体内粘合性的一组照片;以及图洸为示出Tet-TA水凝胶、Tet-TA/DAII水凝胶、Tet-TA/DAII+CHPA水凝胶和 Tet-TA/DAII+GPEG-TA水凝胶的体内止血作用的一组照片。
本发明公开了原位成型生物粘合水凝胶及其医学用途。所述水凝胶通过酶促反应原位交联成型,在生物相容性方面优于常规的生物粘合水凝胶。此外,该原位成型生物粘合水凝胶具有出色的生物相容性和机械强度,并且由于用或不用多巴衍生物进行修饰而具有出色的组织粘合性。该水凝胶在生物医学领域中有许多应用,包括生物粘合剂或止血剂、用于组织再生和填充的植入材料、递送生物学活性物质或药物的载体等。
用于组织粘合剂的原位成型水凝胶及其生物医学用途制作方法
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