专利名称：用作TNF－α信号传导途径抑制物的TRAF2变体的制作方法图1(a)中进行了大致说明，该图显示了图表形式的全长TRAF2(TRAF-FL)。这些蛋白质具有带锌环指基元的N-末端区，随后是一列类锌指结构。锌指区之后是由两个亚结构域组成的保守(TRAF)结构域N-末端结构域和C-末端结构域。C-末端结构域涉及受体的结合和TRAF的同源及异源寡聚化作用，它是各种其它信号传导蛋白质的停泊位点。TRAF2遵循上述TRAF蛋白质的一般结构。已有许多研究试图将TRAF2蛋白质结构的亚结构域与该蛋白的功能相联系起来。Takeuchi等对TRAF2进行了广泛的突变分析(Takeuchi等，生物化学杂志J.Biol.Chem.，271(33)19935-42(1996))。这些研究显示TRAF2由介导独特活性的模块化结构域组成。作者确定TRAF2的N-末端环指及两个相邻的锌指是NFκB激活所需要的，而TRAF结构域中的独特的TRAF-N和TRAF-C亚结构域看来是独立介导自身结合及其与TRAF1的相互作用。Song等(美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，94，9792-9796(1997))随后的研究显示TNFα诱导的NFκB及c-jun N-末端激酶(JNK/SAPK)活化需要TRAF2。作者显示，TRAF2是两激酶级联反应导致NFκB和JNK激活的分支点。此报告支持了TRAF2及TRAF家族其它成员作为接头蛋白质的功能性模型，其中具有起始平行下游应答之附加信号蛋白质的停泊位点。Min等(免疫学杂志(J.Immunology)，159，3508-3518(1997))用转染/过表达的策略来分析TRAF蛋白质的作用。先前已显示含TRAF结构域但缺少氨基末端残基1-80的TRAF2可抑制TNFα诱导NFκB的活化。作者证实此TRAF2变体还阻断TNFα对JNK的激活作用。Brink等(生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，273，7，4129-4134(1998))描述了一种TRAF2的剪接变体，他们称之为“TRAF2A”。TRAF2A的cDNA除了具有附加的21bp序列外，其余部分与TRAF2相同，此21bp序列编码的7个氨基酸插入TRAF2A环指结构域中。作者发现TRAF2AmRNA的表达以组织特异的方式被调节，且TRAF2A蛋白能与TNFαR2的胞质结构域结合。他们还发现，与TRAF2相反，当TRAF2A在293细胞中过表达时，它不能刺激NFκB活性，而是充当TNFαR2依赖型NFκB活化的主要抑制物。许多研究已将炎性过程和TNFα与主要的心血管疾病联系起来(Bryant等，循环(Circulation)，97(14)1375-81(1998)；Kubota等，循环研究(Circ.Res.)，81(4)627-35(1997)；Muller Werdan等，欧洲细胞因子网(Eur.Cytokine Netw.)，9(4)689-91(1998)；Aukrust等，美国心血管杂志(Am.J.Cardiol.)，83(3)376-82(1999))。在过去的五年中，积累的证据已表明，局部TNFα水平的提高与以下疾病相关(a)心肌梗死、冠状动脉旁路手术、心脏移植后的心脏局部缺血-再灌注损伤或中风后CNS中的局部缺血-再灌注损伤；(b)严重冠状动脉粥样硬化斑的加重和断裂；(c)充血性心力衰竭的发展和加重；以及(d)球囊血管成形术之后的内皮细胞损伤。此外，最近的发现显示细胞程序死亡可能是心力衰竭或梗塞期间心肌细胞死亡的病理生理学中的一个重要因素。除上述心血管疾病外，还有许多其它疾病的发病机理与TNFα相关。这些疾病包括克隆病(Crohn’s disease)、牛皮癣、类风湿性关节炎、移植中的排斥反应(graft versus host disease)、炎性肠疾病、非胰岛素依赖型的糖尿病和神经变性疾病(如帕金森症)。
由于TNFα与多种诸如上文所述疾病之间的相互关系，所以希望为抑制和治疗这些疾病提供组合物和方法。
发明概述按照本发明，已发现TRAF2变体，尤其是含天然剪接变异的变体(TRAF2TR)和含天然剪接变异且在TRAF2 N-末端区缺失的变体(TRAF2TD)，可抑制TNFα的信号传导及相关的免疫炎性应答。
按照本发明的实施方案，提供了编码TRAF2TR的DNA序列，包括如图2a所示的序列。
按照本发明的另一实施方案，提供了编码TRAF2TD的DNA序列，包括如图3a所示的序列。
在优选的实施方案中，TRAF2TR和TRAF2TD DNA是cDNA。
在其它的实施方案中，本发明提供了含如图2b所示氨基酸序列并能抑制肿瘤坏死因子α(TNFα)所调节途径的TRAF2TR多肽，以及含如图3b所示氨基酸序列并能抑制肿瘤坏死因子α(TNFα)所调节途径的TRAF2TD多肽。
本发明的另一方面提供了抑制患者中TNFα调节的途径的方法，包括将能抑制TNFα所调节途径的组合物引入患者体内，该组合物包含能表达TRAF2TR多肽的表达载体、能表达TRAF2TD多肽的表达载体、TRAF2TR多肽及药学可接受载体或TRAF2TD多肽及药学可接受载体。
本发明的另一方面是提供了抑制TNFα过度产生所涉及疾病的方法，包括将能抑制TNFα所调节途径的组合物施用于患者，该组合物包括能表达TRAF2TR多肽的表达载体、能表达TRAF2TD多肽的表达载体、TRAF2TR多肽及药学可接受载体或TRAF2TD多肽及药学可接受载体。
本发明还有另一方面提供了抑制TNFα病理的方法，所说病理涉及核因子κB(NFκB)依赖型基因超活化，该方法包括将能抑制TNFα所调节途径的组合物施用于患者，该组合物包括能表达TRAF2TR多肽的表达载体、能表达TRAF2TD多肽的表达载体、TRAF2TR多肽及药学可接受载体或TRAF2TD多肽及药学可接受载体。
本发明还提供了抑制涉及肿瘤坏死因子α的发炎过程的方法，包括将能抑制TNFα所调节途径的组合物施用于患者，该组合物包括能表达TRAF2TR多肽的表达载体、能表达TRAF2TD多肽的表达载体、TRAF2TR多肽及药学可接受载体或TRAF2TD多肽及药学可接受载体。
在某些实施方案中，所述发炎过程选自以下疾病克隆病、牛皮癣、类风湿性关节炎、移植中的排斥反应、炎性肠疾病、非胰岛素依赖型的糖尿病和神经变性疾病。
在另一些实施方案中，发炎过程是选自以下的心血管疾病(a)心肌梗死、冠状动脉旁路手术、心脏移植或中风后CNS中的局部缺血-再灌注损伤引起的心脏局部缺血-再灌注损伤；(b)严重冠状动脉粥样硬化斑的加重和断裂；(c)充血性心力衰竭的发展和加重；(d)球囊血管成形术之后的内皮细胞损伤；以及(e)心肌细胞的程序性细胞死亡。
本发明的另一方面，提供了编码TRAF2TR/2TD变体的DNA序列。
本发明的另一方面，提供了能抑制TNFα所调节途径的TRAF2TR/2TD变体多肽。
本发明所提供产物具有能治疗多种疾病的优势，它利用天然存在的蛋白质的变体干扰这些疾病共同的早期过程，即TNFα信号传导。
附图概述图1是全长TRAF2(TRAF2-FL)及其剪接变体TRAF2TR的示意结构。图2a和2b是TRAF2TR cDNA的核酸序列(2a)和TRAF2TR的氨基酸序列(2b)。图3a和3b是TRAF2TD cDNA的核酸序列(3a)和TRAF2TD的氨基酸序列(3b)。图4a和4b是剪接过的TRAF2(TRAF2TR)和全长TRAF2的核酸(4a)及氨基酸(4b)排列。图5说明了TRAF2TR变体mRNA的组织分布。泳道1-对照TRAF2FL cDNA；2-对照TRAF2剪接变体(TRAF2TR)cDNA；3-Jurkat；4-HeLa细胞系；5-胸腺；6-胎盘；7-胸腺；8-脾；9-卵巢；10-对照TRAF2FL。图6描述了在被转染HeLa细胞中Nyc-融合的TRAF2FL和TRAF2TR的免疫检测。泳道1-pcDNA3载体；2-myc-TRAF2FL；3-myc-TRAF2TR。图7图示了用NFKB UAS探针进行的电泳迁移率变动测定(EMSA)。来自FL TRAF2过表达细胞的核提取物(泳道3和4)显示TNF-α诱导的迁移变动明显强于对照(泳道1和2)。TRAF2-TR过表达阻断了NF-κB的形成，并因此在TNF-α刺激的细胞中未检测到迁移变动条带(泳道5和6)。
发明详述以下是本文所用术语的定义及本发明优选实施方案的描述。定义
“克隆载体”是一复制子，例如，质粒、噬菌体或粘粒，另一DNA片段可连于其上从而使所连接片段得以复制。“复制子”是用作体内DNA自主复制单位的任何遗传元件(如质粒、染色体、病毒)，即能在其自身控制下复制。克隆载体可以在一种细胞类型中复制而于另一种细胞中表达(“穿梭载体”)。在本发明的优选实施例中，克隆载体能于宿主细胞中表达，且“表达载体”能表达足以干扰细胞中TNF-α所调节途径的量的TRAF2TR和TRAF2TD。
“盒”指能在一个或多个特异限制位点插入载体的DNA片段。DNA片段编码目的多肽，而盒及限制位点的设计要保证盒在转录和翻译的正确阅读框架处插入。
当外源或异源DNA已被引入细胞中时，细胞就被所说的DNA“转染”了。当所转染DNA引起表型改变时，此细胞就已被外源或异源DNA“转化”了。转化的DNA可整合入(共价连接)组成细胞基因组的染色体DNA中。
“核酸分子”指核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式或它们的任何磷酸酯类似物，如硫代磷酸酯和硫酯，可以是单链形式或双链螺旋。双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。术语“核酸分子”，特别是DNA或RNA分子，只指该分子的一级和二级结构，并未将其限制于任何三级结构的形式。因此，此术语包括许多分子中，尤其是线性或环状DNA分子(如限制片段)、质粒及染色体中的双链DNA。在对特殊的双链DNA分子结构的讨论中，序列在此可按正常惯例进行描述，即给出的只是沿DNA非转译链的5’至3’方向的序列(即，所具序列与mRNA同源的链)。“重组DNA分子”是经过分子生物学操作的DNA分子。
当核酸分子的单链形式能在适当的温度和离子强度条件下与其它核酸分子如cDNA、基因组DNA或RNA退火时，则对于该另一核酸分子来说，此核酸分子就是“可杂交的”(见Sambrook等，见下文)。温度和离子强度条件决定了杂交的“严格谨性”。杂交要求两核酸间含互补序列，尽管依赖于杂交的严谨性，碱基之间的错配还是有可能的。对于核酸杂交来说，恰当的严谨性取决于核酸长度和互补的程度，这些变量是本领域众所周知的。
用于此处时，术语“寡核苷酸”指可与编码TRAF2的基因组DNA分子、cDNA分子或mRNA分子杂交且通常至少18个核苷酸长的核酸。寡核苷酸可被标记，例如，用32P-核苷酸或标记物(诸如生物素之类)已共价连接其上的核苷酸进行标记。在一实施方案中，标记后的寡核苷酸可用作探针检测编码TRAF2之核酸的存在。在另一实施方案中，寡核苷酸(其中之一或两个均可被标记)能用作PCR引物，用于克隆全长或部分长度的TRAF2，或用于检测编码TRAF2的核酸的存在。在进一步的实施方案中，寡核苷酸可与TRAF2 DNA分子形成三链螺旋。一般说来，寡核苷酸可合成制备，优选用核酸合成仪。因此，可用非天然存在的磷酯类似键制备寡核苷酸，诸如硫酯键等。
DNA“编码序列”是指当置于适当调节序列控制下时，在体外或体内细胞中被转译和翻译成多肽的双链DNA序列。DNA编码序列及合适的调节序列优选提供于表达载体中。编码序列的边界决定于5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端的翻译终止密码子。编码序列可以包括，但不局限于，原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列，甚至是合成的DNA序列。若编码序列预期用于真核细胞中表达，则多腺苷酸化信号和转录终止序列通常将位于编码序列的3’端。
转录和翻译控制序列是DNA调节序列，如提供编码序列在宿主细胞中的表达的启动子、增强子和终止子。在真核细胞中，多腺苷酸化信号是控制序列。
“启动子序列”是能结合细胞中的RNA聚合酶并起始下游(3’方向)编码序列转录的DNA调节区。为了对本发明进行说明，启动子序列在3’末端被转录起始位点限定并向上游(5’方向)延伸，包括起始背景以上可检测水平的转录所必需的最小数目碱基或元件。在启动子序列中可找到转录起始位点(可方便地确定，例如，用核酸酶S1作图)，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合结构域(共有序列)。
当RNA聚合酶将编码序列转译成mRNA，然后被剪接(如编码序列含内含子)并翻译成编码序列编码的蛋白质时，则编码序列处于细胞中转录和翻译控制序列的“控制下”。
用于此处时，术语“同源”指蛋白质间具有“共同进化起源”的相互关系。这样的蛋白质(及它们的编码序列)具有序列同源性，反映在它们的序列具有高度的相似性。术语“序列相似性”指具有或不具有共同进化起源的蛋白质核酸或氨基酸序列间的相同或一致程度。不过，在通常使用及本文中，当用诸如“高度”之类副词修饰时，术语“同源的”可能指序列相似性而非共同的进化来源。
术语“TNFα所调节途径”及相关术语指涉及TNFα与肿瘤坏死因子受体家族(TNFR)成员结合的信号所调节途径。
术语“相当于”用于此处是指相似或同源序列在确定位置是否与相似性或同源性已测定的分子相同或不同。核酸或氨基酸序列排列可包括间隔。因此，术语“相当于”指序列相似性而非氨基酸残基或核苷酸碱基的编号。
术语“剪接变体”指由这样的mRNA编码的多肽，此mRNA由一个或多个基因编码的全长mRNA经过另外的加工后产生，导致mRNA相对于原基因的全长mRNA来说含一个或多个缺失。
本发明的实施方案本发明涉及抑制TNFα信号传导途径的TRAF2的两个变体。一实施方案是在下文被称为“截短的TRAF2”或“TRAF2TR”的TRAF2 RNA加工剪接变体。另一实施方案是基于缺失相当于TRAF2TR第1-87位氨基酸残基的TRAF2TR，它被称为“截短并缺失的TRAF2”或“TRAF2TD”。TRAF2TR和TRAF2TD都具有抑制TNFα信号传导途径的能力。由于TRAF2TD显著降低对TNFα结合之应答的能力，所以它是尤其优选的实施方案。
下文是这两个实施方案结构的描述，随后是关于如何制备这些实施方案的讨论。
TRAF2TR实施方案的结构和制备此剪接变体的cDNA序列见图2a，氨基酸序列见图2b。至于概略性的显示TRAF2TR的图1，可见缺失去除了TRAF2FL的第123-201位氨基酸残基，包括锌指结构域1的C-末端部分和所有的锌指2和3，以及锌指4的N-末端残基。
可用任何合适的方法制备本领域的TRAF2TR，包括本领域技术熟练人员已知的各种方法。可通过各种渠道找到分离、克隆和DNA测序的教材。本领域技术中普通分子生物学、微生物学和重组DNA技术在文献中有充分的解释。参阅，如，Sambrook，Fritsch & Maniatis，分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版(1989)冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(此处为“Sambrook等，1989”)；DNA克隆实用方法(DNA CloningA Practical Approach)，第I和第II卷(D.N.Glover编辑，1985)；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait编辑，1984)；核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)[B.D.Hams & S.J.Higgins编辑(1985)]；转录和翻译(Transcription And Translation)[B.D.Hames& S.J.Higgins，编辑(1984)]；动物细胞培养(Animal Cell Culture)[R.I.Freshney编辑(1986)]；固定化细胞和酶(Immobilized CellsAnd Enzymes)[IRL出版社，(1986)]；B.Perbal，分子克隆实用指导(A Practical Guide To Molecular Cloning)(1984)；F.M.Ausubel等(编辑)，分子生物学通用手册(Current Protocols in MolecularBiology)，John Wiley & Sons，有限公司(1994)。
基于本文所述关于TRAF2TR DNA序列的信息和本领域所知获得cDNA的方法，编码TRAF2TR和TRAF2TD的核苷酸序列可方便地克隆或制备自野生型TRAF2并插入恰当的载体，在体外或体内表达这些蛋白质。关于涉及克隆cDNA和表达载体的方法描述参见文献，Sambrook等，同上文。
编码TRAF2的基因，无论是基因组DNA或cDNA，均可分离自人基因组文库或cDNA文库。获得具本文所给出DNA序列信息之基因的方法是本领域众所周知的。可用本领域已知的标准步骤从克隆DNA(即DNA“文库”)中获得TRAF2 DNA。优选由从高水平表达此蛋白质之组织中制备的cDNA文库(如，淋巴来源的细胞，尤其是，B细胞或骨肉瘤细胞系，例如，呈现TRAF2或TRAF2TR高水平表达的人骨肉瘤SAOS-2(ATCCNo.HTB-85))获得。DNA还可通过纯化自预期细胞的基因组DNA或其片段克隆获得(参阅，例如，Sambrook等，1989，同上；Glover，D.M.(编辑)1985，DNA克隆实用方法，MRL出版社，Ltd.，牛津，英国，第I、II卷)或用化学合成的方法获得。来源于基因组DNA的克隆除编码区外还可包含调节和内含子DNA区；来自cDNA的克隆将不含内含子序列。由于本发明部分以全长TRAF2剪接变体(TRAF2TR)的分离为基础，所以希望获得编码TRAF2TR序列的cDNA。
获得cDNA的方法是本领域众所周知的。简略地说，这些方法包括从真核细胞中分离信使RNA(mRNAs)的混合物，并应用一系列酶促反应合成与分离mRNA互补的双链DNA拷贝(cDNAs)。
如下文实施例1中所提出的，已发现逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆是分离含TRAF2TR剪接变体之cDNA的有效方法。RT-PCR包括用逆转录酶逆转录细胞mRNA，随后用PCR扩增产生的DNA产物。
不管是以何方式获得目的cDNA，用许多已知技术中的任一种都可将双链cDNA混合物插入克隆载体，这至少部分取决于所用的特殊载体。在以下文献中对多种插入方法进行了相当详细的讨论酶学方法(Methods in Enzymology)，68，16-18(1980)，以及Sambrook等，1989，同上。
一旦DNA片段插入克隆载体，克隆载体就被用于转化合适的宿主。这些克隆载体通常赋予宿主抗生物素抗性的性状。这样的宿主通常是原核细胞且只有一些宿主细胞含目的cDNA。被转染的宿主细胞组成了基因“文库”，成为分离出mRNA的细胞中所存在的mRNA的代表性样品。
根据本文所提供的TRAF2的序列信息，可制备合适的寡核苷酸序列，优选如上所述合成，并用于鉴别含TRAF2序列的克隆。为了鉴定含TRAF2序列的克隆，将单个转化或转染的细胞在硝酸纤维素滤膜上长成菌落。溶解菌落并通过加热将DNA紧密固定在滤纸上。然后将滤纸和与TRAF2互补的被标记寡核苷酸探针一起保温。与TRAF2基本同源的DNA片段将杂交于探针上。同源程度越大，可使用的杂交条件越严谨。
探针与它互补的cDNA杂交。用放射自显影或可鉴定探针存在的化学反应可进行鉴定。为了鉴定含目的蛋白质所有结构信息的一个或多个克隆，对克隆进行定性。分离编码目的蛋白的核酸序列并重插入表达载体中。表达载体将克隆基因置于特异原核或真核控制元件调控下，使得ds-DNA有效表达(转录和翻译)。
进一步的筛选可以基因特性为基础进行。例如，基因是否编码具有与TRAF2等电的、电泳上相同之氨基酸组成的蛋白质或具有如上所述之TRAF2蛋白质部分氨基酸序列的蛋白质。因此，通过以其表达产物物理、化学或免疫特性为基础进行的分析可检测基因的存在。例如，通过其所产生蛋白质在电泳迁移、等电聚焦、非均衡pH凝胶电泳、蛋白水解或抗原性上是否具有与TRAF2TR类似或相同的特性来挑选cDNA克隆或DNA克隆。
TRAF2TD的结构和制备相对于TRAF2TR，TRAF2TD缺失第1-87位氨基酸和编码这些氨基酸的相应核苷酸。TRAF2TD的DNA序列见图3a，而氨基酸序列见图3b。
任何合适的方法都可用于制备TRAF2TD，例如，包括基于上述信息的各种方法。有许多方法可用于产生缺失第1-87位氨基酸的截短形式的TRAF2TR。在优选的制备方法中，TRAF2TR cDNA用作PCR模板，所用的5’引物含TRAf2全长编码序列的第262-280位核苷酸(ATGAGTTCGGCCTTCCCAGAT)，其中包括ATG以建立翻译的起始位点；3’引物是TTA TAG CCC TGT CAG GTC CAC。产生的构建体开始于全长TRAF2的第88位氨基酸，缺失TRAF2TR的第123-201位氨基酸。
用上述制备TRAF2TD的方法之类的方式可制备TRAF2TR的其它变体。
TRAF2TR/2TD变体本发明范围内包括TRAF2TR或TRAF2TD的等位基因变体、取代、添加和缺失突变体、类似物和衍生物(下文称之为“TRAF2TR/2TD变体”)，以及来自其它物种、具有与TRAF2TR相同或相似功能活性的同系物。在优选的实施方案中，本发明实践上应用了具缺失或取代的基因，所述突变提高了原基因产物抑制TNFα信号传导途径的能力。TRAF2TR/2TD变体的制备或分离也在本发明的范围内。因此，本发明的范围包括具功能活性的TRAF2TR/TRAF2TD变体，即呈现与TRAF2TR相关的一个或多个功能活性。
通过取代、添加或缺失改变编码核酸序列以提供功能相当的分子，可以制备TRAF2TR/2TD变体。优选制备相对于TRAF2TR或TRAF2TD来说具有增强或提高的功能活性的TRAF2TR/2TD蛋白。
由于核苷酸编码序列的简并性，编码与TRAF2TR基本上相同的氨基酸序列(包括含单个氨基酸变异的氨基酸序列)的其它DNA序列也可应用于本发明的实践中。这些包括，但不局限于，等位基因、来自其它物种的同源基因以及含全部或部分TRAF2TR的核苷酸序列，所说的核苷酸序列通过用编码原序列中相同氨基酸残基的不同密码子取代而改变，因此产生沉默的变异。同样的，本发明的TRAF2TR/2TD变体包括，但不局限于，从一级氨基酸序列上说，含TRAF2TR全部或部分氨基酸序列的变体，包括用序列中导致保守氨基酸取代的残基来替代功能相当的氨基酸残基而被改变的序列。例如，可用极性相似的另一氨基酸取代序列中的一个或多个氨基酸残基，它可用作功能同等物，产生沉默的改变。序列中氨基酸的取代可选自该氨基酸所属类型的其它成员。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。带芳香环结构的氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。预期这样的改变不会影响聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的表观分子量或等电点。
尤其优选的取代是-用赖氨酸取代精氨酸，反之亦然，从而保持正电荷；-用谷氨酸取代天冬氨酸，反之亦然，从而保持负电荷；-用丝氨酸取代苏氨酸，从而保持游离羟基；及-用谷氨酰胺取代天冬酰胺，从而保持游离CONH2。
还可导入氨基酸取代，以便用具特别优选特性之氨基酸取代。例如，半胱氨酸可引入一个可能与其它半胱氨酸形成二硫键的位点。组氨酸可引入作为特别有催化活性的位点(即，组氨酸可作为酸或碱，是生化催化中最常用的氨基酸)。脯氨酸的引入是由于其特殊的平面结构，该结构在蛋白质结构中可诱导β-转角。
编码本发明TRAF2TR/2TD变体的基因可用本领域已知的多种方法产生。导致它们产生的操作可发生在基因或蛋白质水平。例如，可用本领域已知的许多策略中的任一种修饰被克隆的TRAF2基因序列(Sambrook等，1989，同上)。可用限制性内切酶在适当的位点切割此序列，若需要还可进行进一步的酶促修饰、分离和体外连接。生产编码TRAF2TR/2TD的基因时，应小心保证修饰后的基因保留在与TRAF2TR相同的翻译阅读框架内而在编码预期活性的基因区内不被翻译终止信号打断。
此外，编码TRAF2TR/2TD的核酸序列可体外或体内突变以建立和/或破坏翻译、起始和/或终止序列，或建立编码区中的变异和/或形成新的限制性内切酶位点或破坏原先存在的位点，从而方便进一步的体外修饰。优选的，这样的突变增强了突变TRAF2TR基因产物的功能活性。任何本领域已知的诱变技术都可使用，包括，但不局限于，体外定点诱变(Hutchinson，C.，等，1978，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2536551；Zoller和Smith，1984，DNA3479-488；Oliphant等，1986，基因44177；Hutchinson等，1986，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)83710)、“TAB”接头(Pharmacia)的使用，等等。PCR技术优选用于定位诱变中(见Higuchi，1989，“用PCR加工DNA”，在《PCR技术DNA扩增的原理和应用》中，H.Erlich，编辑，Stockton Press，第六掌，第61-70页)。
以下有关编码预期多肽之DNA的操作和表达的讨论对于TRAF2TR和TRAF2TD以及TRAF2TR/2TD变体都是通用的。将TRAF2TR、TRAF2TD以及TRAF2TR/2TD变体克隆入克隆/表达载体可将鉴定和分离后的DNA序列插入合适的克隆/表达载体(此后称“载体”)，从而方便序列修饰或蛋白质的表达。这些载体一般包括多克隆位点、启动子、方便在宿主细胞中复制的序列和选择标记。
任何合适的载体都可使用。本领域已知的就有许多。可使用的载体包括，但不局限于，例如，质粒或修饰后的病毒。载体通常与供其引入的宿主细胞以方便载体的复制和编码蛋白质的表达相容。例如，可通过将DNA片段插入有互补粘端的克隆载体从而完成DNA序列插入所给定载体的工作。不过，若使DNA片段化所用的互补限制性位点不存在于克隆载体中，则DNA分子的末端可酶促修饰。或者，通过将核苷酸序列(接头)连接至DNA末端可产生任何预期的位点；这些连接的接头可以包含编码限制性内切酶识别序列的特殊化学合成寡核苷酸。有用的载体可由染色体、非染色体和合成的DNA序列区段组成。可用于本发明实践中的特殊载体例子包括，但不局限于，大肠杆菌噬菌体，例如，λ衍生物，或质粒，例如，pBR322衍生物或pUC质粒衍生物，如pmal-c、pFLAG，SV40衍生物和已知的细菌质粒，如大肠杆菌质粒colE1、pCR1、pMa1-C2、pET、pGEX(Smith等，1988，基因6731-40)，pMB9和它们的衍生物，诸如RP4之类的质粒；噬菌体DNA，如噬菌体1的许多衍生物，如NM989，以及其它的噬菌体DNA，如M13和丝状单链噬菌体DNA；诸如2μm质粒之类的酵母载体或其衍生物；可用于真核细胞的载体，例如，可用于昆虫细胞的载体，例如杆状病毒载体，可用于哺乳动物细胞的载体；质粒和噬菌体DNA联合形成的载体，已经修饰以便应用噬菌体DNA或其它表达控制序列的质粒；等等。
可按本发明使用的酵母载体包括，但不局限于，非融合型pYES2载体(XbaI、SphI、ShoI、NotI、BstXI、EcoRI、BamHI、SacI、KpnI和HindIII克隆位点；Invitrogen)或融合型pYESHisA、B、C(XbaI、SphI、ShoI、NotI、BstXI、EcoRI、BamHI、SacI、KpnI和HindIII克隆位点，用ProBond树脂纯化并用肠激酶切割的N-末端肽；Invitrogen)。
本发明实践中可用的杆状病毒载体包括各种载体，非融合型转移载体和融合型转移载体都可使用，其中非融合型转移载体有例如，pVL941(BamHI克隆位点；Summers)、pVL1393(BamHI、SmaI、XbaI、EcoRI、NotI、XmaIII、BglII和PstI克隆位点；Invitrogen)、pVL1392(BglII、PstI、NotI、XmaIII、EcoRI、XbaI、SmaI和BamHI克隆位点；Summers和Invitrogen)以及pBlueBacIII(BamHI、BglII、PstI、NcoI和HindIII克隆位点，可用蓝/白重组子筛选；Invitrogen)；融合型转移载体有例如，pAc700(BamHI和KpnI克隆位点，其中BamHI识别位点开始于起始密码子；Summers)、pAc701和pAc702(与pAc700相同，具有不同的阅读框架)、pAc360(多角体蛋白起始密码子下游36碱基对处有BamHI克隆位点；Invitrogen(195))和pBlueBacHisA、B、C(三种不同的阅读框架，具有BamHI、BglII、PstI、NcoI和HindIII克隆位点，用于ProBond纯化的N-末端肽和蓝/白斑重组子筛选；Invitrogen)。
本发明考虑使用的哺乳动物载体包括，例如，具可诱导启动子例如二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子的载体，如具DHFR表达载体的任何表达载体，或DHFR/氨甲喋呤共扩增载体，例如，pED(PstI、SalI、SbaI、SmaI和EcoRI克隆位点，该载体既表达克隆基因又表达DHFR；参阅Kaufman，分子生物学通用手册，16.12(1991))。或者用谷氨酰胺合成酶/甲硫氨酸磺基肟共扩增载体，例如，pEE14(HindIII、XbaI、SmaI、SbaI、EcoRI和BclI克隆位点，其中的载体表达谷氨酰胺合成酶和被克隆的基因；Celltech)。在另一实施方案中，可使用在EpsteinBarr病毒(EBV)控制下指导游离体基因表达的载体，例如，pREP4(BamHI、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII和KpnI克隆位点，组成型劳氏肉瘤病毒长末端重复片段(RSV-LTR)启动子、潮霉素选择标记；Invitrogen)、pCEP4(BamHI、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII和KpnI克隆位点，组成型人巨细胞病毒(hCMV)立即早期基因、潮霉素选择标记；Invitrogen)、pMEP4(KpnI、PvuI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI、BamHI克隆位点，可诱导的金属硫蛋白IIa基因启动子、潮霉素选择标记；Invitrogen)、pREP8(BamHI、XhoI、NotI、HindIII、NheI和KpnI克隆位点，RSV-LTR启动子、组氨醇选择标记；Invitrogen)、pREP9(KpnI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI和BamHI克隆位点，RSV-LTR启动子、G418选择标记；Invitrogen)和pEBVHis(RSV-LTR启动子、潮霉素选择标记、可通过ProBond树脂纯化并用肠激酶切割的N-末端肽；Invitrogen)。用于本发明的可选择哺乳动物表达载体包括pRc/CMV(HindIII、BstXI、NotI、SbaI和ApaI克隆位点，G418选择；Invitrogen)、pRc/RSV(HindIII、SpeI、BstXI、NotI、XbaI克隆位点，G418选择；Invitrogen)、pcDNA3(HindIII、KpnI、BamHI、BstXI、EcoRI、EcoRV、BstXI[重复]、NotI、XhoI、XbaI、ApaI克隆位点，G418、氨苄青霉素筛选，Invitrogen)及其它。本发明使用的牛痘病毒哺乳动物表达载体(见，Kaufman，1991，同上)包括，但不局限于pSC11(SmaI克隆位点，TK-和β-gal筛选)、pMJ601(SalI、SmaI、AflI、NarI、BspMII、BamHI、ApaI、NheI、SacII、KpnI和HindIII克隆位点；TK-和β-gal筛选)和pTKgptF1S(EcoRI、PstI、SalI、AccI、HindIII、SbaI、BamHI和Hpa克隆位点，TK或XPRT筛选)。
可使用各种方法证实编码TRAF2TR、TRAF2TD或TRAF2TR/2TD变体的目的DNA序列已克隆入载体中。通常可使用以下一种或多种方法(a)目的质粒DNA或特异mRNA的PCR扩增，(b)核酸杂交，(c)选择标记基因功能的存在或缺失，(d)用合适的限制性内切酶进行分析，及(e)插入序列的表达。在第一种方法中，可用PCR扩增核酸以检测扩增产物。在第二种方法中，可用探针通过核酸杂交检测插入表达载体的外源基因的存在，所用探针含与插入标记基因同源的序列。在第三种方法中，可以外源基因插入载体而引起的某些“选择标记”基因功能(如，β-半乳糖苷酶活性、胸苷激酶活性、对抗生素的抗性、转化表型、杆状病毒中包涵体的形成，等等)的存在或丢失为基础鉴定和筛选重组载体/宿主系统。在另一实施例中，若编码TRAF2TR的核酸插入载体的“选择标记”基因序列中，通过选择标记基因功能的缺失可鉴定含TRAF2TR插入片段的重组子。在第四种方法中，通过用合适的限制性酶消化鉴定重组表达载体。在第五种方法中，假如表达蛋白质呈现功能活性构象，可通过检验重组子所表达基因产物的活性、生化或免疫学特性来鉴定重组表达载体。启动子编码TRAF2TR或TRAF2TD或其TRAF2TR/2TD变体的核苷酸序列可插入含被插入蛋白质编码序列转录和翻译所必需元件的表达载体中。这样的元件在此被称为“启动子”。因此，编码本发明多肽的核酸在本发明的表达载体中与启动子可操作性的连接。cDNA和基因组序列都可在这样的调节序列控制下克隆和表达。表达载体还优选包括复制起点。必需的转录和翻译信号可提供于重组表达载体上，或由编码TRAF2的天然基因和/或其侧翼区提供。前述将DNA片段插入克隆载体的任何方法均可用于构建含具合适转录/翻译控制信号及蛋白质编码序列之基因的表达载体。这些方法可包括体外重组DNA和合成技术，以及体内重组(遗传重组)。
表达可用本领域已知的任何启动子/增强子元件控制，但这些调节元件必须在选定用于表达的宿主中是有功能的。可用于控制TRAF2TR基因表达的启动子包括，但不局限于，SV40早期启动子区(Benoist和Chambon，1981，自然(Nature)290304-310)、劳氏肉瘤病毒3’长末端重复片段中所含的启动子(Yamamoto等，1980，细胞22787-797)、疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagner等，1981，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)781441-1445)、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等，1982，自然29639-42)；原核表达载体，例如，β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等，1978，美国国家科学院院报，753727-3731)或tac启动子(DeBoer等，1983，美国国家科学院院报，8021-25)；也可参阅科技美国人(ScientificAmerican)中“来自重组细菌的有用蛋白质”一文，1980，24274-94；来自酵母或其它真菌的启动子元件，例如，Gal4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子；和呈现组织特异性并已用于转基因动物中的动物转录控制区在胰腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等，1984，细胞38639-646；Ornitz等，1986，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，50399-409；MacDonald，1987，肝脏病学(Hepatology)7425-515)；在胰腺β-细胞内有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan，1985，自然315115-122)、在淋巴细胞内有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等，1984，细胞38647-658)；Adames等，1985，自然318533-538；Alexander等，1987，细胞分子生物学Mol。Cell。Biol。，71436-1444)、在睾丸、乳房、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区(Leder等，1986，细胞45485-495)、在肝中有活性的清蛋白基因控制区(Pinkert等，1987，基因和发育(Geneand Devel.)1268-276)、在肝细胞中有活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等，1985，细胞分子生物学51639-1648；Hammer等，1987，科学(Science)23553-58)、在肝细胞中有活性的α1抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等，1987，基因和发育，1161-171)、在骨髓细胞中有活性的β珠蛋白基因控制区(Mogram等，1985，自然315338-340；Kollias等，1986，细胞4689-94)、在脑的少突胶质细胞中有活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区(Readhead等，1987，细胞48703-712)、在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链2基因控制区(Sani，1985，自然314283-286)和在下丘脑中有活性的促性腺释放激素基因控制区(Mason等，1986，科学2341372-1378)。将载体引入宿主细胞载体可用任何合适的方法引入宿主细胞，包括，如转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂染(溶酶体融合)、基因枪或DNA载体转运器(参阅，如Wu等，1992，生化杂志(J.Biol.Chem.)267963-967；Wu和Wu，1988，生化杂志26314621-14624；Hartmut等，加拿大专利申请2,012,311，1990年3月15日提交)，由此产生许多基因拷贝。优选克隆基因在穿梭载体质粒上，以供在克隆细胞如大肠杆菌中扩展，并且方便纯化用于随后插入合适表达细胞系。例如，穿梭载体是能在一种以上类型的生物体中复制的载体，可通过将来自大肠杆菌质粒的序列与来自酵母2μm质粒的序列连接制备既能在大肠杆菌中复制，又能在酿酒酵母中复制的穿梭载体。宿主细胞系统可能的宿主细胞系统包括，但不局限于感染了病毒(如牛痘病毒、腺病毒等)的哺乳动物宿主细胞系统；感染了病毒(如杆状病毒)的昆虫宿主细胞系统；微生物，诸如包含酵母载体的酵母；或以噬菌体、DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌。载体表达元件在强度和特异性上都有所变化。取决于所用的宿主细胞系统，可使用多种合适的转录和翻译元件中的任一种。
此外，可选择适当的宿主细胞株，它能调节插入序列的表达，或以预期的特异方式修饰和加工基因产物。不同的宿主细胞具有其特性及独特的蛋白质翻译和翻译后加工及修饰机制。可选择合适的细胞系或宿主系统以保证所表达外源蛋白质的预期修饰和加工。于酵母中表达可产生生物活性产物。于真核细胞中表达可提高“自然”折叠的可能性。此外，于哺乳动物细胞中表达可为重组或构成TRAF2TR抑制活性提供工具。而且，不同的载体/宿主表达系统可不同程度影响加工反应，诸如蛋白水解切割。如上文所指出的，本发明的表达载体都可用于转染细胞以供TRAF2TR活性调节子的筛选或生物检测。
在经重组整合编码序列后，本发明的重组TRAF2TR、TRAF2TD或TRAF2TR/2TD变体可于染色体上表达。在这一点上，有一些扩增系统可用于获得稳定基因的高水平表达(见Sambtook等，1989，同上)。
已引入含TRAF2TR编码核酸之重组载体的细胞在供细胞表达TRAF2TR的条件下培养于适当的细胞培养基中。
一旦建立了合适的宿主系统和生长条件，就可繁殖和制备一定量的重组表达载体。如上所述，通过收集培养液或溶解包涵体可获得可溶形式的蛋白质，如，用去污剂处理，若需要还可以用超声波法或其他机械加工。用多种技术可分离溶解的或可溶解的蛋白质，包括聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、等电聚焦、双向凝胶电泳、层析法(如离子交换、亲和、免疫亲和及分子排阻柱层析)、离心、差异溶解度、免疫沉淀或用于蛋白质纯化的任何其他标准技术。
如上所述，“载体”是用于将本发明核酸转移至宿主细胞的任何工具。优选的载体是病毒载体，例如，逆转录病毒、疱疹病毒、腺病毒和腺伴随病毒。由此，用病毒载体或通过DNA的直接导入将编码本发明蛋白质或多肽结构域片段的基因体内、离体或体外引入。通过将转基因载体定向于特异细胞可达到于靶组织中表达的目的，如用病毒载体或受体配基，或用组织特异的启动子，或二者结合使用。离体和体内处理方法中病毒载体系统的使用通常用于体内或离体定向和治疗步骤的病毒载体是以DNA为基础的载体和逆转录病毒载体。构建和使用病毒载体的方法是本领域所已知的[见，如Miller和Rosman，BioTechniques7980-990(1992)]。优选的病毒载体是复制缺陷型的，即，它们在靶细胞中不能自主复制。一般说来，本发明范围内使用的复制缺陷型病毒载体基因组缺少至少一个病毒在感染细胞中复制所必需的区域。这些区域可用本领域技术熟练人员已知的任何技术或被删除(全部或部分)或使其无功能。这些技术包括完全去除、取代(用其他序列，尤其是被插入的核酸)、部分删除或将一个或多个碱基添加至必需(对于复制来说)区。用遗传操作方法或用诱变剂处理可在体外(在分离的DNA上)或原位完成这样的技术。优选复制缺陷型病毒保留包装病毒颗粒所必需的基因组序列。
DNA病毒载体包括减毒的或缺陷型DNA病毒，诸如以下病毒，但不局限于此单纯疱疹病毒(HSV)、人乳头瘤病毒、Epstein Barr病毒(EBV)、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、牛痘病毒，等等。优选完全或几乎完全缺失病毒基因的缺陷型病毒。缺陷型病毒在引入细胞后无复制能力，因而不会导致可能产生的病毒感染。使用缺陷型病毒载体可在特异的局部区域进入细胞，而不用担心该载体会感染其他细胞。因此可特异定向于特殊组织。具体载体的例子包括，但不局限于，缺陷型疱疹病毒1(HSV1)载体[Kaplitt等，分子细胞神经科学(Molec.Cell.Neurosci.)2320-330(1991)]、缺失糖蛋白L基因的缺陷型疱疹病毒载体[专利公开RD371005A]或其他缺陷型疱疹病毒载体[国际专利申请公开WO94/21807，发表于1994年9月29日；国际专利申请公开WO92/05263，发表于1994年4月2日]；减毒的腺病毒载体，诸如Stratford-Perricaudet等所述的载体[临床研究杂志(J.Clin.Invest.)90626-630(1992)；也可见La Salle等，科学(Science)259988-990(1993)]；以及缺陷型腺伴随病毒载体[Samulski等，病毒学杂志(J.Virol.)613096-3101(1987)；Samulski等，病毒学杂志(J.Virol.)633822-3828(1989)；Lebkowski等，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)83988-3996(1988)]。
体内施用时，优选将适当的免疫抑制治疗与病毒载体(如腺病毒载体)结合使用以避免病毒载体和感染细胞的免疫失活。例如，可用诸如白介素-12(IL-12)、干扰素-g(IFN-g)或抗CD4抗体之类的免疫抑制细胞因子来阻断对病毒载体的体液或细胞免疫应答[参见，如Wilson，自然医学(Nature Medicine)(1995)]。此外，应用改造成表达最小数量抗原的病毒载体是有利的。
自然的，本发明涉及载体的送递，其将表达治疗有效量的TRAF2TR用于基因治疗。用于此处的短语“治疗有效量”指足以减少或最优选预防导致TNFα结合相关疾病之明显临床表现的免疫应答的量。或者，治疗有效量是足以改善宿主明显的临床症状的量。离体及体内治疗方法中使用的优选病毒载体系统某些病毒载体系统已在本领域中很好的建立起来并适用于本发明的治疗方法。a. 腺病毒载体系统在优选的实施方案中，载体是腺病毒载体。腺病毒是真核DNA病毒，它可被修饰后以有效传送本发明核酸至多种类型细胞中。存在多种血清型的腺病毒。在本发明范围内，优选这些血清型中的2型或5型人腺病毒(Ad2或Ad5)或动物来源的腺病毒(见WO94/26914)。可用于本发明范围内的那些动物来源的腺病毒包括犬、牛、鼠(例如May1，Beard等，病毒学75(1990)81)、羊、猪、禽和猿(例如SAV)来源的腺病毒。优选的动物来源腺病毒是犬腺病毒，更优选CAV2腺病毒(如Manhattan或A26/61株(ATCC VR-800))。
优选的本发明复制缺陷型腺病毒载体包含ITR、衣壳化序列及目的核酸。更优选的是至少腺病毒的E1区是非功能性的。E1区中的缺失优选为Ad5腺病毒序列的第455-3329位核苷酸(PvuII-BglII片段)或第382-3446位核苷酸(HinfII-Sau3A片段)。其它区域也可被修饰，尤其是E3区(WO95/02697)、E2区(WO94/28938)、E4区(WO94/28152、WO94/12649和WO95/02697)或晚期基因L1-L5中的任一个。
在优选的实施方案中，腺病毒载体在E1区有缺失(Ad1.0)。E1-缺失的腺病毒例子公布于EP185,573，其内容在此收编作为参考。在另一优选实施方案中，腺病毒载体在E1和E4区有缺失(Ad3.0)。E1/E4-缺失的腺病毒例子公布于WO95/02697和WO96/22378，其内容在此收编作为参考。在另一优选的实施方案中，腺病毒载体在E1区有缺失，并在其中插入了E4区和核酸序列(见FR94 13355，其内容在此收编作为参考)。
用本领域技术熟练人员已知的任何技术都可制备本发明复制缺陷型重组腺病毒(Levero等，基因101(1991)195，EP185 573；Graham，EMBO J.3(1984)2917)。尤其是，它们可通过腺病毒和其中携带目的DNA序列的质粒之间的同源重组来制备。在腺病毒和质粒共转染入合适细胞系后可完成同源重组。采用的细胞系应优选(i)是所述元件可转化的，且(ii)含能与复制缺陷型腺病毒基因组部分互补的序列，它优选以整合形式存在于细胞系中，从而避免了产生重组的风险。如专利申请WO94/26914和WO95/02697所述，可用的细胞系例子是人胚胎肾细胞系293(Graham等，J.Gen.Virol.36(1997)59)，它含有整合入其基因组中的Ad5腺病毒左手部分基因组(12％)，以及能弥补E1和E4功能的细胞系。用本领域常规技术人员众所周知的标准分子生物学技术回收和纯化重组腺病毒。
b.腺伴随病毒载体系统腺伴随病毒(AAV)是相对小的DNA病毒，它们能以稳定的定位方式整合入感染细胞的基因组中。它们能感染广谱的细胞并不影响细胞生长、形态或分化，且它们看上去不涉及人的病理学问题。AAV基因组已克隆、测序和定性。它包括约4700个碱基，且两末端含有约145个碱基的反向末端重复(ITR)区，它可作为病毒的复制起点。基因组的剩余部分被分成两个具衣壳化功能的基本区基因组的左手部分，含涉及病毒复制和病毒基因表达的rep基因；基因组的右手部分，含编码病毒衣壳蛋白的cap基因。
有关利用来自AAV的载体在体外和体内转移基因的例子文献中已有报道(参见WO91/18088；WO93/09239；US4,797,368，US5,139,941，EP488 528)。这些发表的文献描述了许多AAV-来源的构建体，其中rep和/或cap基因缺失并被目的基因替代，利用这些构建体在体外(进入培养细胞)或体内(直接进入生物体)转移所述目的基因。通过将含目的核酸序列且该序列侧翼有两AAV反向末端重复(ITR)区的质粒与携带AAV衣壳化基因(rep和cap基因)的质粒共转染入被人辅助病毒(例如腺病毒)感染的细胞系，可制备本发明复制缺陷型重组AAV。随后用标准技术纯化产生的AAV重组子。
因此，本发明还涉及AAV-来源的重组病毒，其基因组包含编码TRAF2TR或TRAF2TD且侧翼为AAV ITR的核酸序列。本发明还涉及含编码TRAF2TR或TRAF2TD且侧翼为两AAV ITR之核酸序列的质粒。这样的质粒可用于转移核酸序列，在适当的情况下，核酸序列与质粒一起掺入脂质体载体(假病毒)。
C.逆转录病毒载体系统在另一实施方案中，基因可引入逆转录病毒载体中，例如参阅以下文献Anderson等，美国专利5399346；Mann等，1983，细胞33153；Temin等，美国专利4650764；Temin等，美国专利4980289；Markowitz等，1988，病毒学杂志621120；Temin等，美国专利5124263；EP453242，EP178220；Bernstein等，遗传工程学(Genet.Eng.)7(1985)235；McCormick，生物技术(BioTechnlogy)3(1985)689；国际专利公开WO95/07358，发表于1995年3月16日，申请人Dougherty等；以及Kuo等，1993，血液学(Blood)82845。逆转录病毒是感染分裂细胞的整合病毒。逆转录病毒基因组包括两个LTR、一个衣壳化序列和三个编码区(gag、pol和env)。在重组逆转录病毒载体中，gag、pol和env基因通常全部或部分缺失，并以异源的目的核酸序列替代。这些载体可自不同类型的逆转录病毒构建，如HIV、MoMuLV(“鼠莫罗尼白血病病毒”)、MSV(“鼠莫罗尼肉瘤病毒”)、HaSV(“Harvey肉瘤病毒”)；SNV(“脾脏坏死病毒”)；RSV(“劳氏肉瘤病毒”)和弗兰德病毒。缺陷型逆转录病毒载体公布于文献WO95/02697中。
一般说来，为了构建含核酸序列的重组逆转录病毒，先构建了含LTR、衣壳化序列和编码序列的质粒。此构建体用于转染包装细胞系，该细胞系能反式提供质粒中缺陷的逆转录病毒功能。通常，这样的包装细胞系能表达gag、pol和env基因。这样的包装细胞系在现有技术中已有描述，尤其是细胞系PA317(US4861719)；PsiCRIP细胞系(WO90/02806)和GP+envAm-12细胞系(WO89/07150)。此外，重组逆转录病毒载体可在LTR中有修饰以抑制转录活性，还可含其中可包括部分gag基因的衣壳化序列(Bender等，病毒学杂志61(1987)1639)。用本领域常规技术人员已知的标准方法可纯化重组逆转录病毒载体。
可构建逆转录病毒载体用作感染颗粒或进行单轮转染。在过去的个案中，病毒被修饰以保留其中除负责致癌转化特性之基因之外的所有其他基因，并表达异源基因。制备非感染性病毒载体以破坏病毒包装信号，但保留包装共转染病毒所需的结构基因，所述病毒经改造后含异源基因和包装信号。因此，产生的病毒颗粒不能生产另外的病毒。定向基因送递参见国际专利公开WO95/28494，公布于1995年10月。离体和体外治疗方法中所用的非病毒系统某些非病毒系统已用于本领域中且能促进编码本发明多肽的DNA进入预期靶细胞中。
A.脂转染送递系统通过脂转染可在体内引入载体。在过去十年中，越来越多将脂质体用于核酸的体外包装和转染。为解决脂质体介导转染中所遇困难和危险而设计的合成阳离子脂类，可用于制备脂质体，以供在体内转染编码标记的基因[Felgner等，美国国家科学院院报847413-7417(1987)；参见Mackey等，美国国家科学院院报858027-8031(1988)；Ulmet等，科学2591745-1748(1993)]。使用阳离子脂类可促进带负电荷核酸的包装，还促进它与带负电荷的细胞膜之间的融合[Felgner和Ringold，科学337387-388(1989)]。用于转移核酸的尤其有效的脂类化合物和组合物参见国际专利文件WO95/18863和WO96/17823，以及美国专利5459127。在体内应用脂转染将外源基因引入特异器官具有某些实际的好处。脂质体的分子定向于特异细胞是优势之一。已清楚在具细胞异质性的组织中定向转染至特殊细胞类型是尤其有利的，例如，在胰、肝、肾和脑中。为了定向的目的，脂类可化学偶联至其他分子上[见Mackey等，同上]。有定向性的肽(如激素或神经递质)和蛋白质(如抗体)或非肽分子均可化学偶联至脂质体上。
其他的分子也可用于促进核酸的体内转染，例如阳离子寡聚肽(如，国际专利文件WO95/21931)、来自DNA结合蛋白质的肽(如国际专利文件WO96/25508)或阳离子聚合物(如国际专利文件WO95/21931)。b.裸DNA送递系统还可以以裸DNA质粒的形式将载体导入体内(见美国专利5693622、5589466和5580859)。供基因治疗的裸DNA载体可通过本领域已知方法引入预期宿主细胞中，如转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、基因枪或DNA载体转移器[见，Wu等，生物化学杂志267963-967(1992)；Wu和Wu，生物化学杂志26314621-14624(1988)；Hartmut等，加拿大专利申请2012311，1990年3月15日提出申请；Williams等，美国国家科学院院报882726-2730(1991)]。也可使用受体介导的DNA送递方法[Curiel等，人类基因治疗(Hum.Gene Ther.)3147-154(1992)；Wu和Wu，生物化学杂志2624429-4432(1987)]。鉴定治疗上有用的TRAF2TR变体的方法有许多方法可用于确定TNFα所调节途径是否涉及某疾病，并确定本发明多肽对这些途径的效果。例如，为了研究在NFκB调节中TRAF2TR的作用，以NFκB UAS为探针进行电泳迁移率变动检验(EMSA)分析(图7)。来自过表达FL TRAF之细胞的核提取物(泳道3和4)显示TNFα诱导的变动明显强于对照(泳道1和2)。TRAF2TR过表达阻断了NFκB的形成，并因此在TNFα所刺激细胞中检测不到变动(泳道5和6)。由于在TNFα所刺激细胞中未显示迁移率变动条带，所以这些结果表明了对NFκB形成的强抑制作用。在用TNFα刺激后过表达全长TRAF2的细胞中NFκB活性有所提高(泳道4)。
上述类型实验可用于测定某疾病状态中牵涉的途径是否可用本发明组合物治疗。大体上，用分离或制备的TRAF2变体取代TRAF2TR或TRAF2TD，确定该变体是否具有抑制TNFα所调节途径的能力，由此可进行上述实验。涉及TNFα所调节途径的疾病如上所述，本发明涉及用TRAF2TR和TRAF2TD及其变体抑制TNFα所调节途径的用途。尤其是，本发明涉及用上述方法有效阻断TNFα诱导的数个转录因子的活化，包括NFκB和AP-1。TRAF2TR和TRAF2TD及其变体可用于抑制涉及TNFα的过量产生和NFκB依赖型基因的超活化的病理学中的TNFα信号转导途径。多种疾病似乎涉及TNFα所调节途径，而这些疾病的病理学基础可能包括TNFα的过生产或NFκB依赖型基因的超活化。用TRAF2TR和TRAF2TD蛋白质及它们的变体可治疗这些疾病。
有证据显示发炎过程与所有主要的心血管疾病都有重要关系，且TNFα水平的提高与这些发炎过程相关，因此认为用本发明的组合物和方法能治疗各种主要的心血管疾病。这些疾病包括，但不局限于心血管疾病，如心肌梗死后的心脏局部缺血-再灌注损伤、冠状动脉旁路手术、心脏移植或中风造成的CNS中的局部缺血-再灌注损伤；严重冠状动脉粥样硬化斑的加重和破裂；充血性心力衰竭的发展和加重；球囊血管成形术之后的内皮细胞损伤。此外，本发明可用于预防心力衰竭或梗塞中心肌细胞的程序性细胞死亡，以及避免肌细胞的凋亡。
通过阻断TNFα受体的信号传导，应用TRAF2TR或TRAF2TD或其变体进行基因治疗的途径可治疗这些疾病。优选使用TRAF2TD，因为它高效抑制TNFα所调节途径。
同样的，通过阻断TNFα受体的信号传导，应用TRAF2TR或TRAF2TD或其变体进行基因治疗的途径可治疗病理学上涉及TNFα的其他疾病。这些疾病包括，但不局限于克隆病、牛皮癣、类风湿性关节炎、移植中的排斥反应、炎性肠疾病、非胰岛素依赖型的糖尿病和神经变性疾病(如帕金森症)。
此外，TRAF2TD可用于多种实验中研究TRAF2-依赖型信号传导途径的机制。治疗组合物和剂量在使用中，本发明的任何载体，不管是病毒或非病毒型的，都优选在药学可接受载体或工具中导入体内。短语“药学可接受的”指分子实体和组合物在施用于人体时是生理状态下可忍受的，且一般不引起明显的过敏或类似的不适反应，诸如胃部不适、头晕等等。用于此处时，术语“药学可接受的”优选表示联邦或州政府主管机构所批准的，或列于美国药典或其他通常认可使用于动物，尤其是人身上的药典中的。术语“载体”指稀释剂、佐剂、赋形剂或与化合物一起施用的工具。这样的药用载体可以是无菌液体，例如，水或油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。优选水或盐水溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液作为载体，尤其是对于可注射的溶液。合适的药用载体可见于“Remington的药物科学”“Remington’s Pharmacertical Sciences”一书，作者E.W.Martin。
本发明提供了包括施用有效量的本发明组合物至人或其他动物在内的治疗方法。
有效量可以变化，取决于被治疗者的年纪、疾病类型和病情严重程度、体重、预期疗程、用药方式及其他参数。主治医生或其他有资格的医学专业人士都可确定有效量。
目前认为本发明多肽最广泛使用的剂量是约0.01mg/kg体重/天-100mg/kg体重/天。优选的剂量是约0.1mg/kg体重/天-50mg/kg体重/天，更优选的剂量是约1mg/kg体重/天-10mg/kg体重/天。
本发明的重组病毒通常以约104-1014pfu之间的剂量形式配制和施用。以AAV和腺病毒为例，优选使用的剂量是约106-1011pfu。术语“pfu”(“噬斑形成单位”)相应于病毒颗粒悬浮液的感染能力，通过感染合适的细胞培养物并检测形成的噬斑数目来测定pfu。测定病毒溶液pfu滴度的技术在现有技术中有很好的记录。
以下实施例对本发明进行了例证性的说明。
实施例实施例1-编码TRAF2TR的cDNA的分离在全长TRAF2的RT PCR克隆(分子生物学通用手册，1996)中，用来自人骨肉瘤细胞系(OSA1)的mRNA分离TRAF2的剪接变体TRAF2TR。当利用引物产生全长TRAF2的cDNA时，观察到了较小的PCR产物。独立切出此片段并克隆。用于RT PCR的5’引物是ATG GCT GCA GCT AGC GTGACC，而3’引物是TTA TAG CCC TGT CAG GTC CAC。
通过对此较小克隆(TRAF2TR)进行测序，鉴定出框架内编码第123-201位氨基酸残基的密码子缺失。图4a和4b比较了全长TRAF2和TRAF2TR的核酸序列和氨基酸序列。
身体中多种组织已被鉴定为TRAF2TR mRNA的来源，并可通过上述流程分离其中的TRAF2TR mRNA。为了测定TRAF2TR的组织分布，用剪接区之外的一对引物进行RT-PCR。缺失区5’侧的引物是GGT GGA GAG CCTGCC GGC CG，而缺失区3’侧的引物是GGC AGC CGA TGG CGT GGA ATCTG，并用寡聚dT引物产生不同组织总RNA的cDNA。用琼脂糖电泳分离cDNA并转移至硝酸纤维素膜上。用来自邻近剪接区5’端之TRAF2序列的特异探针(5’-GAT GCA CCT GGA AGG GGA CCC TGA AAT-3’)进行杂交。此探针识别TRAF2的非剪接和剪接变体。对于非剪接变体(TRAF2FL)来说，预期大小是373bp；对于剪接变体(TRAF2TR)来说，预期大小是136bp。现在参照图5，泳道1-对照TRAF2-FL cDNA；2-对照TRAF2剪接变体cDNA；3-Jurkat；4-HeLa细胞系；5-胸腺；6-胎盘；7-胸腺；8-脾脏；9-卵巢。
对多种细胞来源裂解物的蛋白质印迹分析未能明确的检测到在表达蛋白质水平有被截短的TRAF2变体存在。似乎该蛋白质的高水平表达和生产以细胞类型依赖的方式在发育上或时间上受到限制，或受一种尚未明确的机制所控制(如，在生发中心的B细胞成熟阶段)。
剪接变体TRAF2TR中的缺失保留了开放的阅读框架，并且5’剪接边界符合规范的剪接供体序列。缺失去除了野生型TRAF2的第123-201位氨基酸残基，其中包括锌指结构域1的C-末端部分和所有的锌指2和3，以及锌指4的N-末端残基(图1)。此缺失更可能破坏锌指区的功能，类似于Takeuchi等人在生物化学杂志271(33)，19935-19942中所建立的缺失，据报道它们对TNFα诱导的NFκB活化呈现显性失活效果。实施例2-TRAF2TD的制备已知TRAF2 N-氨基末端87个氨基酸(代表环指结构域，见图1)的缺失产生了可用作TNFα依赖型NFκB活化之显性抑制剂(显性失活)的蛋白质(Takeuchi等，生物化学杂志271(33)，19935-19942(1996))。为了确定N-末端的缺失是否会影响TRAF2TR的活性，制备了代表TRAF2TR具蛋白质N-末端87个氨基酸缺失(残基1-87)的构建体。为了制备此TRAF2TR变体，以TRAF2TR cDNA为PCR模板，5’引物含TRAF2全长编码序列的第262-280位核苷酸(ATGAGTTCGGCCTTCCCAGAT)，其中含ATG密码子作为翻译起始位点；3’引物是TTA TAG CCC TGT CAG GTC CAC。产生的构建体开始于全长TRAF2的第88位氨基酸，包含TRAF2TR的第123-201位氨基酸缺失，是“双缺失”的构建体。此构建体经DNA测序确认并克隆入哺乳动物表达载体(pcDNA3，Invitrogen)中。实施例3-用TRAF2TR转染HeLa细胞为了确定TRAF2TR对NFκB活化的作用，在哺乳动物表达载体(pcDNA3，INVITROGEN)中构建了带N-Myc亲和标签的截短及全长(FL)TRAF2。为了制备N-Myc融合构建体，合成5’PCR引物，该引物含Myc标签序列及起始甲硫氨酸(MetGluGlnLysLeuIleSerGluGluAspLeuAsn)，之后是TRAF2 cDNA最初的20个核苷酸5’-ATG GAG CAG AAA TTGATT TCC GAG GAA GAT CTG AAC ATG GCT GCA GCT AGC GTG AC-3’。3’PCR引物序列是5’-TTAGAGCCCTGTCAGGTCCACAA-3’。用标准技术纯化PCR产物并克隆入pcDNA3载体中。
用LipoFectamine(BRL，Gibco)试剂按试剂供应商的说明书将pcDNA3-myc TRAF2构建体转染HeLa细胞。简略地说，就是将4m1LipoFectamine与在1ml无血清DMEM(BRL)培养基中的1mg DNA混合，将此混合物与3×105个细胞置于60mm的有盖培养皿中在5％的二氧化碳培养箱内37℃过夜。转染24小时后，用磷酸盐缓冲液清洗细胞并溶于200ml SDS电泳加样缓冲液(SIGMA)中。电泳分离10ml裂解物并通过蛋白质印迹法转移到硝酸纤维素膜上。按抗体供应商推荐的方法进行免疫染色和ECL(AMERSHAM)检测。
抗Myc抗体(BABCO，Berkeley)检测以pcDNA-TRAF2FL和pcDNA-TRAF2TR转染的HeLa细胞中预期大小的蛋白质(图6)。
图6中的结果显示了在被感染HeLa细胞中Myc-融合的TRAF2FL和TRAF2TR的免疫测定结果。用lipofectamine(Gibco BFL)将HeLa细胞转染上TRAF-FL和TRAF-TR的表达构建体，24小时后将细胞溶于SDS上样缓冲液中。用抗myc抗体和ECL检测系统检测Myc-融合蛋白质。泳道1-pcDNA3载体；2-myc-TRAF2FL；3-myc-TRAF2TR。实施例4-NFκB报告系统为了测定TRAF2TR、TRAF2TD或这些多肽的变体对NFκB所调节基因表达的作用，可使用NFκB报告系统，如文献Takeuchi等，生物化学杂志271(33)，19935-42(1996)中所利用并描述的系统。NFκB报告激活系统可与适当的细胞结合使用，如293细胞、COS7细胞或HeLa细胞。用实施例3中所述的lipofectamine方法使细胞被不同的TRAF2构建体所转染，即全长TRAF2、TRAF2TR和TRAF2TD。然后比较不同TRAF2片段对共转染的NFκB报告分子激活的影响，从而鉴定出最有效的抑制剂种类。举例说来，可将含全长TRAF2、TRAF2TR和TRAF2TD以及TRAF2TR和TRAF2TD变体的TRAF2构建体转染入293细胞，并监测T