专利名称：：一种同时液化糖化玉米淀粉的方法技术领域：。本项发明涉及一种将玉米淀粉同时进行液化和糖化的方法，尤其是指:将玉米淀粉与水混合，高温预热以后，同时加入液化酶和糖化酶，再继续在相同的高温条件下保温一段时间，最终将玉米淀粉完全酶解转化为单糖和双糖的方法。：玉米淀粉糖(例如:葡萄糖和麦芽低聚糖等)是医药工业、食品工业、生物化工等行业的重要原料。玉米淀粉糖的生产通常使用一种包括液化和糖化操作的二步法生产工艺；即:先后采用淀粉液化酶和淀粉糖化酶，对玉米淀粉进行液化、再进行糖化，而生产葡萄糖和麦芽低聚糖的工艺。淀粉液化酶和淀粉糖化酶是二种对淀粉作用方式不同的淀粉酶。目前，商品化的液化酶为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶，其最适催化条件为90°C、pH6.0，能随机快速地水解淀粉分子内部的α-1，4糖苷键，产生极限糊精及少量麦芽糖，导致淀粉衆黏度迅速下降；商品化的糖化酶为黑曲霉(Aspergillusniger)葡萄糖淀粉酶，此糖化酶的最适催化条件为60°C、pH4.24.5，能水解极限糊精分子非还原末端的α-1，4糖苷键或a_l，6糖苷键，产生葡萄糖，导致淀粉浆还原力升高。同时，为了加快糖化、提高最终的糖产率，也常常加入淀粉脱枝酶嗜酸普鲁兰芽胞杆菌(Bacillusacidopullulyticus)普鲁兰酶。由于上述液化酶和糖化酶具有不同的最适催化反应条件，所以在淀粉的液化和糖化的过程中需要使用不同的反应温度和pH，因而增加了淀粉糖的生产时间和生产成本。为了能够建立一种一步法同时对玉米淀粉进行液化糖化、或使液化的淀粉能够在相同的条件下继续糖化的工艺，淀粉糖工业迫切需要一种最适催化反应温度在90°C左右、最适催化反应PH在弱酸性范围的糖化酶。目前，普遍认为采用基因工程技术提高黑曲霉(Aspergillusniger)葡萄糖淀粉酶的热稳定性、克隆表达嗜热微生物葡萄糖淀粉酶,是解决上述问题的二个途径。极端嗜热古细菌是一类能在80°C以上高温环境中生长的微生物；近来研究发现，不少种类的极端嗜热古细菌具有热稳定性葡萄糖淀粉酶基因。基因重组嗜苦菌(Picrophilustorridus)葡萄糖淀粉酶在35-65°C、pH4.5-6.5范围内具有活性，但是其最适水解底物为麦芽三糖(Sch印ers，B.Thiemann,V.Antranikian,G.CharacterizationofanovelglucoamyIasefromthethermoacidophilicarchaeonPicrophilustorridusheterologousIyexpressedinE.col1.Engineeringinlifesciences.2006，6(3):311-317.)，对淀粉的水解活性低，而未能用于淀粉糖化工业。基因重组嗜酸热原体菌(Thermoplasmaacidophilum)葡萄糖淀粉酶最适催化反应温度仅为75°C、最适催化反应pH为5.0，能够在5小时内将0.5%(w/v)的马铃薯支链淀粉部分转化为葡萄糖(Dock,C.Hess,M.Antranikian,G.AthermoactiveglucoamylasewithbiotechnologicalrelevancefromthethermoacidophiliceuryarchaeonThermoplasmaacidophilum.Appliedmicrobiologyandbiotechnology.2008,78(1):105-114.)。硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)的基因重组葡萄糖淀粉酶(SSGA)和基因重组糖原脱枝酶(SSOTE)的最适水解底物分别为麦芽三糖和支链淀粉；这二种酶需要配合使用，才能够在pH为5.56.5、温度为7580°C的条件下联合水解液化的淀粉，而得到高产率的葡萄糖(KR20040025179、KR101014802)。由于这些极端嗜热古细菌葡萄糖淀粉酶的最适催化反应温度较低、或者对淀粉的水解活性低，不能在90°C以上的条件下，与地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶一起使用，对玉米淀粉同时进行液化和糖化。
本项发明公开了一种同时对玉米淀粉进行高温液化和糖化，一步制备淀粉糖的方法；即，将地衣芽孢杆菌α-淀粉酶与一种古细菌麦芽糖淀粉酶(maltogenicamylase,MAase7EC3.2.1.133)同时加入到高温预热的玉米淀粉浆中，继续进行保温水解反应，最终将玉米淀粉完全酶解转化为葡萄糖、麦芽糖和异麦芽糖(说明书附图1)。本项发明所涉及的淀粉液化酶，是商品化的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶，活性测定的方法为文献“Bemfeld,P.Amylasealphaandbeta.Methodsinenzymology.1955,1:149-158.”中所报道的方法。本项发明所涉及的淀粉糖化酶，属于葡萄糖苷水解酶13家族，是通过构建基因工程菌，表达嗜热古细菌的麦芽糖淀粉酶基因，而得到的最适催化反应温度在90-100°C、最适催化反应PH在5.0-5.5范围的基因重组极端热稳定麦芽糖淀粉酶；其制备、纯化和活性测定的方法为文献“Li，D.etal.0verexpressionandcharacterizationofanextremelythermostablemaltogenicamylase,withanoptimaltemperatureof100°C,fromthehyperthermophiIicarchaeonStaphylothermusmarinus.Newbiotechnology.2010,27(4)=300-307.”中所报道的方法。本发明所公开的同时液化和糖化玉米淀粉制备淀粉糖的方法，包括以下步骤:(I)将玉米淀粉加入到水中，浓度为10-30%(w/v)、pH范围是5.0-6.0;(2)加热至90-100°C;(3)加入酶活力为50_150U/g淀粉的极端热稳定麦芽糖淀粉酶和酶活力为50-150U/g淀粉的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，混匀；(4)在90-100°C，酶解3_7hr；(5)自然冷却至室温，得到以葡萄糖、麦芽糖和异麦芽糖为主要成分的、总产率大于110%(w/w)的玉米淀粉糖衆。本发明所涉及的玉米淀粉糖的检测方法为高效阴离子交换色谱法，检测条件为:采用高效阴离子交换电化学检测色谱仪(ICS-3000型，戴安，美国)测定上述淀粉糖衆中的糖分组成和含量，阴离子交换柱:CarboPacPA10(4mmX250mm);淋洗液:18mmol/LNaOH;流速:1.0mL/min;进样量:25yL;柱温:30°C;脉冲安培检测，则得如说明书附图2所示的淀粉糖浆高效阴离子交换色谱图。采用峰面积标准曲线法，对三色谱峰进行定量，将((糖质量/淀粉质量)xioo%)定义为产率。本项发明使用嗜热古细菌麦芽糖淀粉酶代替黑曲霉葡萄糖淀粉酶，并且与地衣芽孢杆菌α-淀粉酶合用，在相同的温度和相同的PH值下、对玉米淀粉同时进行液化和糖化(说明书附图1)，省去了二步法中、液化后糖化前需要改变温度和调节PH的操作步骤，提高了淀粉糖的生产速度。图1是同时液化糖化玉米淀粉的操作流程图。BLA是地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶；SMMA是海生葡萄状嗜热菌(Staphylothermusmarinus)麦芽糖淀粉酶。图2是地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶与海生葡萄状嗜热菌(Staphylothermusmarinus)麦芽糖淀粉酶同时液化糖化玉米淀粉所得糖衆的高效阴离子交换色谱图。图中保留时间3.717min为葡萄糖色谱峰，图中保留时间6.217min为异麦芽糖色谱峰，图中保留时间11.767min为麦芽糖色谱峰。具体实施例方式将20mg玉米淀粉(大成实业集团，吉林省长春市)与200μL缓冲液(50mMρΗ5.5乙酸-乙酸钠)混和，在90°C预热3分钟后，加入酶活力为IOU的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶(BLA，Termamyl120，诺维信，丹麦)和酶活力为5U的海生葡萄状嗜热菌(Staphylothermusmarinus)麦芽糖淀粉酶(SMMA),在90O保温5h后，自然冷却至室温，则得到淀粉糖浆。采用高效阴离子交换色谱仪测定淀粉糖浆的组成成分，计算得到:葡萄糖的产率为38.92%、麦芽糖的产率为39.87%、异麦芽糖的产率为31.83%、总产率为110.62%。权利要求1.一种同时液化糖化玉米淀粉的方法，其特征在于采用以下步骤:(1)将玉米淀粉加入到水中，浓度为10-30%(w/v),pH范围是5.0-6.0；(2)加热至90-100°C；(3)加入酶活力为50-150U/g淀粉的极端热稳定麦芽糖淀粉酶和酶活力为50-150U/g淀粉的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，混匀；(4)在90-100°C，酶解3-7hr；(5)自然冷却至室温，得到以葡萄糖、麦芽糖和异麦芽糖为主要成分的、总产率大于110%(w/w)玉米淀粉糖衆。2.根据权利要求1所述的一种同时液化糖化玉米淀粉的方法，其特征在于所使用的极端热稳定麦芽糖淀粉酶是海生葡萄状嗜热菌(Staphylothermusmarinus)麦芽糖淀粉酶。3.根据权利要求1所述的一种同时液化糖化玉米淀粉的方法，其特征在于将极端热稳定麦芽糖淀粉酶(糖化酶)与地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(液化酶)一起加入到90-100°C的玉米淀粉浆中。4.根据权利要求1所述的一种同时液化糖化玉米淀粉的方法，其特征在于产物淀粉糖的主要组成成分是葡萄糖、麦芽糖和异麦芽糖。全文摘要本发明涉及一种同时液化糖化玉米淀粉的方法。该方法使用一种最适催化反应温度在90-100℃的极端热稳定麦芽糖淀粉酶代替最适催化反应温度在55-65℃的黑曲霉葡萄糖淀粉酶；由于这种极端热稳定麦芽糖淀粉酶与地衣芽孢杆菌α-淀粉酶具有相似的最适催化反应温度和最适催化反应pH，所以能够与地衣芽孢杆菌α-淀粉酶一起加入已预热到90-100℃、浓度为10-30％(w/v)玉米淀粉浆中，再于相同的温度保温一段时间以后，最终得到葡萄糖、麦芽糖和异麦芽糖总产率大于110％(w/w)的玉米淀粉糖浆。这种方法克服了传统玉米淀粉糖生产工艺中，先用地衣芽孢杆菌α-淀粉酶在90-100℃、pH5.0-6.0液化玉米淀粉、然后再用黑曲霉葡萄糖淀粉酶在55-65℃、pH4.2-4.5糖化玉米淀粉，需要改变温度和调节pH的操作步骤，提高了淀粉糖的生产速度。文档编号C12P19/14GK103146780SQ20111040167公开日2013年6月12日申请日期2011年12月7日优先权日2011年12月7日发明者李丹,李晓磊申请人:长春大学,李丹,李晓磊