专利名称：共转orca3/g10h基因提高长春花中长春花类生物碱含量的方法长春花(Catharanthus roseus)属夹竹桃科多年生草本植物，可产生100多种具有抗癌活性的職类卩引哚生物碱(Terpenoid Indole Alkaloids, TIAs)。其中，长春碱(Vinblastine)和长春新碱(Vincristine)是重要的抗肿瘤药用成分，也是目前应用最为广泛的天然抗癌药用成分。还有抗过敏药用成分利血平(Reserpine)和降压药用成分阿玛 碱(Ajmalicine)等。其中长春瑞宾是Pierre Fabre公司在20世纪90年代中期开发的一种比较新型的长春花生物碱类药物，它是长春碱的一种半合成衍生物，是由一类长春花属植物(Vinca rosea)所含的文多灵(Vindoline)和长春质碱(Catharanthine)化学半合成而来的一种药物，目前在临床上应用于治疗乳腺癌、睾丸癌、卵巢上皮细胞癌、非小细胞性肺癌疗效显著。因此，长春花被认为是一种具有很高开发应用价值的药用植物。然而，由于这些药物在长春花中的含量极其微少(仅为百万分之几至十万分之几)，所以从天然植物中提取TIAs远远不能满足市场需求，导致长春花药用成分的供需矛盾相当严重(每年只能生产12kg长春碱和Ikg长春新碱)，使其价格极为昂贵(高达6000美元/克)，而用化学合成和半合成因成本太高而不具有商业价值。目前，全国市场上的长春花生物碱纯品主要依靠进口。生物技术的兴起和发展，为定向提高长春花中有效药用成分含量及实现长春花生物碱的规模化生产提供了新的有效手段，从而已引起国内外的广泛重视。
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种共转Orca3/gl0h基因提高长春花中长春花类生物碱含量的方法。本发明涉及的技术主要包括关键酶基因克隆、载体构建、遗传转化、分子检测、生物碱提取及含量测定，建立了稳定提高长春花中部分生物碱含量的方法，为利用长春花大规模生产长春花类生物碱奠定坚实的基础。本发明是通过以下技术方案实现一种共转OrCa3/gl0h基因提高长春花中长春花类生物碱含量的方法，该方法包括如下步骤(I)采用基因克隆方法获得orca3和glOh基因；(2)分别构建 CaMV 35S-orca3_nos terminator 和 CaMV 35S-gl0h_nosterminator的表达盒,然后依次将所述表达盒置于双元表达载体pCAMBIA2300中，构建成含orca3和glOh基因的植物双元表达载体pCAMBIA2300+gl0h+orca3 ；(3)将所述植物双元表达载体pCAMBIA2300+gl0h+orca3通过冻融法转化根癌农杆菌，获得含pCAMBIA2300+gl0h+orca3的根癌农杆菌工程菌；(4)将所述工程菌转化长春花并再生出植株，即得共转OrCa3/gl0h基因的长春花植株。优选的，在所述步骤(I)中，从长春花基 因组中克隆所述orca3基因时采用的上游引物为 0RCA3-F1，其序列为 5’-ACTAGTATGTCCGAAGAAATCAT-3’，下游引物为 0RCA3-R1，其序列为5’ -GGTCACCTTAATATCGTCTCTTCT-3’ ；从长春花基因组中克隆所述glOh基因时采用的上游引物为 G10H-F1，其序列为 5’-ACCAGTATGGATTACCTTACCAT-3’，下游引物为 G10H-R1，其序列为 5’ -GGTCACCAAGGGTGCTTGGTACAGC-3’。优选的，在所述步骤(3)中，所述根癌农杆菌为EHA105。优选的，在所述步骤(4)中，所述转化包括以下步骤( I)预培养长春花的外植体；(2)共培养所述工程菌与所述外植体；(3)诱导共培养后的长春花的愈伤组织及不定芽分化；(4)诱导生根和移栽所述长春花植株。优选的，在所述步骤(4)之后还包括以下步骤PCR检测目的基因Orca3/gl0h的整合情况；HPLC-ELSD测定所述转基因长春花中长春花类生物碱的含量，筛选获得生物碱类含量提高的转基因长春花植株。进一步优选的，所述PCR检测的步骤为先设计合成35s-f/orca3-r和35s-f/gl0h_r引物，再进行DNA扩增,然后在紫外线下观察到目的条带的阳性株系即为所述转基因长春花植株。所述HPLC-ELSD测定长春花中生物碱含量的方法为当所述转基因长春花株高生长到15cm时，选取幼嫩的叶片，于50°C烘箱中烘至恒重，然后磨成粉末；称取0. Ig所述干粉于2mL Eppendorf管中，加入ImL甲醇，浸泡3h，然后用超声波40W处理30min，5000rpm离心lOmin，取上清用0. 4 y m的滤膜过滤，即可用于HPLC检测长春花生物碱的含量；所述HPLC的流动相采用体积比为7:9:6的乙腈、甲醇和0. 7%二乙胺，所述二乙胺用磷酸调整到PH值为7. 2，所述流动相的流速为I. OmL/min，柱温为35°C，所述ELSD检测系统的漂移管温度为35°C，放大系数为7，载气压力为5bar ;根据标准品的浓度和峰面积计算出样品中的文多灵、长春质碱和长春碱的重量含量，再除以样品的叶片干重，即可计算出文多灵、长春质碱和长春碱占样品干重的百分含量。更进一步优选的，所述引物35s-f的序列为5’ -CGCACAATCCCACTATCCTT-3’ ；所述引物orca3_r的序列为5’-GCCCTTATACCGGITCCAAT-3’;所述引物 glOh-r 的序列为 5’-TGAAITCCTTGGCAGAATCC-3’。本发明采用基因工程手段，将长春花类生物碱合成途径中的全局性转录因子orca3和作为关键酶的香叶醇_10_脱氢酶基因glOh在长春花中过量表达，获得长春花类重要生物碱高产的转基因长春花株系，该转基因长春花中文多灵含量均比非转基因长春花提高了 1.0-2. 2倍，长春质碱较非转基因长春花提高了 I. 1-1. 9倍。本发明为解决长春花生物碱的供需矛盾提供了一种高产、稳定的长春花生物碱药源，降低了长春花生物碱的生产成本，为今后利用转基因长春花大规模生产长春花类生物碱打下了基础。图I为长春花中文多灵、长春质碱和长春碱的含量检测结果图。图2为双元表达载体pCAMBIA2300+gl0h+orca3的表达框示意图。图3为转基因长春花植株目的基因PCR检测部分结果图。
(I)取50_100mg长春花叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450iiL RL (试剂盒提供，使用前要加入￠-巯基乙醇)，漩涡剧烈震荡混匀；(2)将所有的溶液转移至过滤柱CS上(试剂盒提供，过滤柱CS放在收集管中)，12，OOOrmp离心2-5分钟，小心吸取收集管中的上清至RNase-free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀；(3)缓慢加入0. 5倍上清体积的无水乙醇(通常为225 U L)，混匀(此时可能会出现沉淀)，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3 (试剂盒提供)中，12，OOOrpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将收集柱CR3放回收集管中；(4)向吸附柱CR3中加入350 ii L去蛋白液RWl (试剂盒提供)，12，OOOrpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；(5) DNasel工作液的配制取10 ii L DNasel储存液放入新的RNase-free离心管中，加入70 ii L RDD溶液，轻柔混匀；(6)向吸附柱CR3中央加入80 ii L的DNasel工作液，室温静置15分钟；(7)向吸附柱CR3中加入350 ii L去蛋白液RW1，12，OOOrpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；(8)向吸附柱CR3中加入漂洗液RW (试剂盒提供，使用前先检查是否已加入乙醇)，室温静置2分钟，12，OOOrpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；(9)重复步骤(8);(10) 12，OOOrpm离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱CR3置于室温放置2分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；(11)将吸附柱CR3放到一个新RNase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100 u L RNase-free ddH20,室温放置2分钟，12，OOOrpm离心2分钟，得到RNA溶液，凝胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。2、长春花orca3和glOh基因的克隆将所获的长春花基因组总RNA通过反转录酶XL (AMV)反转录获得第一链cDNA，根据长春花orca3和glOh基因的编码序列，设计扩增出完整编码框的上下游引物0RCA3-F1(5，-ACTAGTATGTCCGAAGAAATCAT-3，)/0RCA3-R1(5，-GGTCACCTTAATATCGTCTCTTCT-3 ’)和 GlOH-Fl(5，-ACCAGTATGGATTACCTTACCAT-3，)/GlOH-Rl(5，-GGTCACCAAGGGTGCTTGGTACAGC-3，)，并在上游和下游引物上分别弓IA限制性内切酶位点(orca3两端分别为SpeI和Bst EILglOh两端分别为NcoI和Bst EII),以便构建含单个基因的CaMV 35S-orca3_nos terminator和CaMV 35S-gl0h-nos terminator表达盒。以所述的第一链cDNA为模板,经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海英骏生物技术服务有限公司测序完成。测序结果表明，所克隆的序列与GenBank中所报道的长春花orca3(NCBI登录号EU072424)和glOh(NCBI登录号AJ251269)基因的编码序列一致。本实施例采用基因克隆方法从长春花中获得序列正确的生物碱合成关键酶基因glOh和全局转录因子orca3,为通过共转orca3和glOh基因提高长春花中长春花类生物碱的含量提供了重要的关键酶基因。实施例2含orca3和glOh基因的植物双元表达载体的构建I、中间载体 pMDT18_gl0h 和 pMDT18_orca3 的构建 选用pMDT18载体(Takara，Dalian)为基本元件，构建中间载体pMDT18_gl0h和pMDT18-orca3。具体地，通过高保真酶分别扩增orca3和glOh基因全长，同时在orca3基因的前后分别引入SpeI和Bst EII酶切位点，在glOh基因两端分别引入NcoI和Bst EII酶切位点。将带有酶切位点的基因全长分别通过连接酶连接到PMDT18载体上，由上海英骏生物技术服务有限公司测序确认基因的正确性。2、单基因植物表达盒 CaMV 35S-orca3_nos terminator 和 CaMV 35S-gl0h_nosterminator 的构建以pCAMBIA1304为表达载体，将实施例I中orca3和glOh基因连入其对应的酶切位点位置。具体地，分别用SpeI和Bst EII双酶切中间载体pMDT18-orca3和表达载体PCAMBIA1304，用 NcoI 和 Bst EII 双酶切中间载体 pMDT18_gl0h 和表达载体 pCAMBIA1304。回收orca3和glOh基因片段和pCAMBIA1304载体大片段，连接后转化，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。此方法可获得分别含有orca3基因和glOh基因的单基因表达盒 CaMV 35S-orca3_nos terminator 和 CaMV 35S-gl0h_nos terminator。3、植物双元表达载体pCAMBIA2300+gl0h+orca3的构建将以上构建的CaMV 35S-gl0h_nos terminator 和 CaMV 35S-orca3_nosterminator表达盒依次置于表达载体pCAMBIA2300中即可得到植物双元表达载体pCAMBIA2300+gl0h+orca3。具体地，用 SmaI 和 PstI 双酶切 pCAMBIA2300 表达载体，用 SmiI和PstI双酶切CaMV 35S-gl0h-nos terminator表达盒，分别回收载体片段和表达盒片段连接，得到含有glOh基因的表达载体pCAMBIA2300+gl0h ;用SmaI和PstI双酶切上述pCAMBIA2300+gl0h,用 SmiI 和 PstI 双酶切 CaMV 35S-orca3_nos terminator,连接后得到含有双基因的表达载体pCAMBIA2300+gl0h+orca3，其表达框示意图如图2所示。本实施例将长春花生物碱的生物合成途径关键酶基因orca3和glOh可操作性地连接于表达调控序列，形成含orca3和glOh基因的植物表达载体，该表达载体用于通过代谢工程策略来提高长春花中长春花类生物碱的含量。实施例3根癌农杆菌介导orca3和glOh基因转化长春花获得转基因长春花植株I、含orca3和glOh基因双元植物表达载体根癌农杆菌工程菌的获得将实施例2中含orca3和glOh基因的植物双元表达载体转入根癌农杆菌(如EHA105，为市场有公开出售的生物材料，可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为 Gambar I),并进行PCR验证。2、根癌农杆菌介导orca3和glOh基因转化长春花(I)外植体的预培养本发明所采用的长春花种子购自PanAmerican Seed公司，太平洋系列楼桃红色 (Pacifica Cherry Red,PCR)。长春花种子经 75% 酒精消毒 lmin, 20%NaC10 消毒 5min,无菌水冲洗3次，用滤纸吸干多余的水分，然后接种于MS培养基上，(25±2)°C、光照时间16h/ d、光照强度2，OOOlx培养3 4d，剪取获得5mm大小无菌苗下胚轴用于转化。(2)农杆菌与外植体的共培养将剪好的长春花下胚轴放入无菌的EP管中，加入含AS的1/2MS液体培养液将其悬浮，无菌密封后，超声波处理功率80W，处理时间IOmin。而后将超声处理后的下胚轴浸入活化好的含orca3和glOh基因植物双元表达载体的农杆菌菌液中30min，弃去菌液，用无菌滤纸将表面菌液吸干。最后将下胚轴平铺于添加了 lOOymol/L AS的1/2MS共培养培养基上,在26°C遮光的恒温培养箱中共培养2d。 (3)长春花愈伤组织的诱导及不定牙的分化将共培养后的长春花下胚轴以平卧方式接种于愈伤组织诱导培养基(附加激素 2，4-DO. lmg/L、NAA 0. lmg/L和头孢霉素500mg/L)上，培养室中培养IOd以后，观察愈伤组织生长状态，统计愈伤组织的生长率；将培养IOd的愈伤组织转接到脱分化培养基(附加 6-BA 2. 5mg/L、NAA 0. 25mg/L和头孢霉素500mg/L的MSCP分化培养基)上，进行脱分化培养；IOd后再将脱分化了的外植体转到分化培养基(附加6-BA lmg/L、IAA 0. lmg/L和头孢霉素500mg/L的MSCP)上，每IOd用同样的分化培养基继代，直到分化出芽，培养室中培养 20d以后，观察不定芽的分化，统计不定芽的分化率；长春花愈伤组织的诱导和不定芽的分化均以MSCP为基本培养基，MSCP培养基MS 粉 4. 43g/L,鹿糖 30g/L,植物凝胶粉 3g/L,水解酪蛋白(Casein hydrolysate, CH) 0. 15g/L, 脯氨酸(Proline) 0. 25g/L，pH 值为 5.8。(4)生根和移栽修剪再生出芽的外植体，去除四周未分化的愈伤组织，移入1/2MS培养基(附加头孢霉素500mg/L)，继续诱导生根。培养室中培养I个月以后，待分化的幼苗生长出发达的根系，从培养罐中小心取出植株，洗净附着的培养基后移栽到壤土中培养。3、转基因长春花植株的PCR检测根据目的基因所在表达盒p35s-orca3_nos和p35s-gl0h_nos序列分别设计正向引物 35s-f(5’ -CGCACAATCCCACTATCCTT-3’ )和反向引物 orca3_r(5’ -GCCCTTATACCGGTTCC AAT-3’)、gl0h-r(5’ -TGAATTCCTTGGCAGAATCC-3’ )对目的基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能分别扩增出400bp和600bp的特异DNA片段，如图3所示，其中 M代表DL5000marker ;+代表pCAMBIA2300+gl0h+orca3质粒；w代表非转基因长春花；G01、 G02、G03、G04、G05、G06 和 G07 代表转 pCAMBIA2300+gl0h+orca3 基因长春花植株；而以非转化长春花基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化长春花的含 orca3和glOh基因植物双元表达载体的根癌农杆菌菌株，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化长春花，获得经PCR检测的转基因长春花植株。转基因长春花植株的获得为筛选获得较高生物碱含量的长春花株系提供了直接材料。实施例4利用HPLC-ELSD测定转基因长春花中长春花类生物碱的含量I、HPLC-ELSD条件及系统适用性以及标准溶液的配制HPLC :采用Hitachi L-2000系统控制，流动相为乙腈甲醇0· 7% 二乙胺(用磷酸调整pH=7. 2，抽滤，超声波除去气泡)=7:9:6，流速为LOmL/min，柱温为35°C ；ELSD :检测系统采用Water Alliance 2420，蒸发光散射检测器漂移管温度35°C， 放大系数(gain)为7,载气压力5bar ；精密称取文多灵、长春质碱、长春碱标准品(Sigma公司)I. Omg用ImL甲醇完全溶解，得到lmg/mL标准品溶液，保存于-20°C备用；本发明中流动相为乙腈甲醇0. 7% 二乙胺(用磷酸调整pH=7. 2，抽滤，超声波除去气泡)=7:9:6，流速为I. OmL/min,柱温为35°C。文多灵、长春质碱和长春碱出峰时间分别为 10. lmin、14. Imin 和 17. 6min。
2、标准曲线的制作将所述对照品溶液在相应色谱条件下分别进样2 μ L、4 μ L、6 μ L、8 μ L和10 μ L， 记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品含量(X，yg)进行回归分析。3、样品的制备和生物碱含量的测定生物碱的提取过程基于Tikhomiroff C. (2002)等报道的方法待长春花株高生长到15cm左右，选取幼嫩的叶片，于50°C烘箱中烘至恒重，然后磨成粉末。称取O. Ig干粉于2mL Eppendorf管中，加入ImL甲醇,浸泡3h,然后用超声波40W处理30min, 5，OOOrpm离心lOmin，取上清用O. 4μ m的滤膜过滤，即可用于HPLC检测长春花生物碱的含量。文多灵、 长春质碱和长春碱出峰时间分别为10. lmin、14. Imin和17. 6min,根据标准品的浓度和峰面积计算出样品中的文多灵、长春质碱和长春碱的含量(mg)，再除以样品的叶片干重(g)， 从而计算出文多灵、长春质碱和长春碱占样品干重的百分含量。在本发明中转orca3和glOh基因得到的阳性株系G01-G05中，文多灵和长春质碱的含量显著提高，长春碱也有不同程度的提高。转基因长春花中文多灵含量均比非转基因长春花提高了 I. 0-2. 2倍，长春质碱较非转基因长春花提高了 I. 1-1. 9倍。本实施例采用HPLC-ELSD法测定了转基因长春花中文多灵、长春质碱和长春碱的含量，采用转化全局转录因子orca3和关键酶基因glOh基因的代谢工程策略获得了文多灵和长春质碱高产的长春花植株，为规模化生产文多灵和长春质碱提供了一种新的方法。


本发明涉及一种共转orca3/g10h基因提高长春花中长春花类生物碱含量的方法，所述方法包括如下步骤克隆orca3基因和g10h基因；分别构建orca3基因和g10h基因的表达盒，然后依次将表达盒置于双元表达载体pCAMBIA2300中，构建含orca3和g10h基因的植物双元表达载体；通过冻融法转化根癌农杆菌获得工程菌；通过农杆菌介导法转化长春花并再生出植株；PCR检测基因orca3/g10h的整合情况测定转基因长春花中长春花类生物碱的含量，筛选获得生物碱类含量提高的转基因长春花植株。本发明提供了一种高产、稳定的长春花生物碱药源，有利于大规模、低成本生产长春花类生物碱。