专利名称：长双歧杆菌的制作方法 已知长双歧杆菌等双歧杆菌属菌(以下称为双尾菌)是人肠道内形成的肠内菌丛中的优势菌种之一，通过摄取它具有整肠作用。近年来，随着人们健康意识的提高，对含有双尾菌的食品的需求也日益提高，双尾菌在发酵乳和乳酸菌饮料等中被广泛应用。另外，对于双尾菌具有的抗肿瘤活性等生理作用也已被多个报告报道，正在尝试将其用于各种保健食品。因此，虽然双尾菌的肠内菌丛维持或改善等效果备受期待，但是，为了使其发挥上述效果，必须持续摄取双尾菌。但是，双尾菌在乳性成分培养基中的增殖性不好，需要长时间发酵才能达到一定的pH值和菌数。并且，双尾菌在酸性条件下难于保存，容易死亡，因此，利用双尾菌的发酵乳制品在流通过程中的菌数维持是一大课题。另一方面，一般认为在发挥双尾菌的生理作用时，活菌是最有效的，但在人体消化道内存在乳酸菌和双尾菌的多种死亡因素和发育抑制因素。特别是到达消化道的最初关口——胃时，必定受到胃液的低pH值和消化酶的洗礼。受胃内容物等情况的影响，一般将在pH3.0下存活2小时作为耐胃酸性能的一个基准(伊藤等，日畜会报，63卷，12号，1276～1289页，1992年)。但是，一般认为双尾菌大部分不耐低pH，与乳酸杆菌等相比，通过胃液的几率低。因此，在开发含有双尾菌的饮料食品时，希望开发下述双尾菌其能够在短时间内增殖到一定量以上(发酵性)，在生产后的流通和消费过程中能维持一定量以上的活菌数(耐酸性)，并且具有耐胃酸性能，能活着到达消化道(特别是肠道)后发挥生理作用。从上述问题出发，正在进行双尾菌的发酵性、耐酸性和耐胃酸性能的研究。例如，对于双歧双歧杆菌(Biffdobacterium bifidum)，已知其存在在耐酸性或含乳培养基中具有发酵性的变异株(特公昭56-42250号公报)。另外，对于长双歧杆菌，已知其存在具有耐酸性的菌株(特公昭59-53829号公报(以下称为引用文献1)、特开平11-75830号公报)。进一步地，已知短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)在还原脱脂乳培养基中增殖后还具有耐酸性(特开平4-320642号公报)。但是，上述现有报道的双歧双歧杆菌和短双歧杆菌在含乳培养基中为了发酵达到规定的pH，需要15小时以上的长时间。另外，耐酸性菌株的大多数在酸性乳制品或果汁制品中(pH4.0～4.8)冷藏保管后的存活率不一定能充分满足。即，上述菌株耐酸性不够。另外，被认为与消化道(肠道)内的存活率有关的耐胃酸性能强的长双歧杆菌变异株也有报告(特开平9-322762，以下称为引用文献2)，但从后述试验的结果可知，该菌株在酸性乳制品中的保存性不足。因此，本发明的目的是提供下述双尾菌，该双尾菌在含乳培养基中增殖性好，具有耐酸性，在发酵乳制品中容易确保一定数量以上的菌数，在保存流通中也能保持菌数，并且耐胃酸性能强，活着到达消化道(肠道)，容易发挥生理功能。
另外，本发明的目的是提供含有所述双尾菌的菌粉和饮料和食品。


为了达到上述目的，本发明人进行悉心研究，结果发现，只要是具有如下性质的长双歧杆菌，则可以在短时间增殖到达一定量以上，在生产后的流通和消费过程中能维持一定量以上的活菌数，并且具有耐胃酸性能，可以活着到达消化道(特别是肠道)发挥生理作用。所述性质如下(1)使含乳培养基的pH达到4.6或4.6以下的发酵性；(2)在含乳培养基达到pH为4.4～4.6时骤冷，在10℃保持2小时后的存活率为50％或50％以上；(3)在pH＝3.0的人工胃液中于37℃保温2小时后的存活率为10％或10％以上的耐胃酸性能。从而完成本发明。
即，本发明提供具有下述菌学性质的长双歧杆菌
(1)使含乳培养基的pH达到4.6或4.6以下的发酵性；(2)在含乳培养基达到pH为4.4～4.6时骤冷，在10℃保持2小时后的存活率为50％或50％以上；(3)在pH＝3.0的人工胃液中于37℃保温2小时后的存活率为10％或10％以上的耐胃酸性能。
另外，本发明提供含有所述长双歧杆菌的菌粉。
本发明还提供含有所述长双歧杆菌的饮料和食品。
发明的最佳实施形态本发明的长双歧杆菌具有上述(1)、(2)和(3)的特性。
(1)是与发酵性有关的性质。双尾菌一般在乳性成分培养基中的增殖性弱，必需长时间的发酵才能达到一定的pH和菌数。如果是具有在含乳培养基中可以使pH达到4.6或4.6以下的强发酵力的菌，则可以短时间进行发酵，在利用该菌的饮料食品(发酵乳制品等酸性乳制品、果汁制品等)中，容易确保一定量的菌数(例如1000万个/1ml发酵乳制品)，提高生产效率。
(2)是与耐酸性有关的性质，所述耐酸性能够在利用双尾菌的发酵乳制品的保存或流通过程中维持一定的菌数。一般来说，酸性乳制品或果汁制品的pH为4.0～4.8，其保质期一般是在10℃以下的保存条件下为2周左右。本发明人发现，如果是利用含乳培养基培养，在pH达到4.4～4.6时骤冷，在10℃保持两周后的存活率为50％或50％以上的菌，则其耐酸性强，在保质期内的酸性乳制品等中可以确保一定的活菌数。相反，在例如pH4的枸橼酸或苹果酸缓冲液中，在10℃保存4天后的残存率为5％或5％以上的菌不一定具有足够的耐酸性。另外，含乳培养基是指用牛奶、鲜干酪、奶油和脱脂乳等乳成分制作的含有乳蛋白3％或3％以上的培养基。
(3)是与使双尾菌活着到达消化道(肠道)的耐胃酸性能相关的性质。双尾菌在口服摄取后通过胃，然后到达肠道并发挥其生理功能。但是，由于胃酸的pH值低，大部分的菌在胃中死亡，能够达到肠道的菌很少。如果在pH＝3.0的人工胃液中于37℃保温2小时后的存活率为10％或10％以上，则可以认为耐胃酸性能高，大部分的菌能活着到达肠道。
通过摄取具有上述(1)～(3)菌学性质的长双歧杆菌，大部分的菌能活着到达肠道，容易发挥作为双尾菌的生理功能。
本发明的长双歧杆菌可以通过例如下述方法获得。首先，从各种试样中分离菌株，从中选取在含乳培养基中发酵性优良的菌株，即具有使含乳培养基的pH达到4.6或4.6以下的发酵性的菌株。然后，以选出的菌为起始原料(スタ-タ-)制备发酵乳制品，选出在低温保存中存活性优良的菌株，即用含乳培养基进行培养，在pH达到4.4～4.6时骤冷，在10℃保持2小时后的存活率为50％或50％以上的菌株。接着，将该菌株用pH＝3.0的人工胃液中于37℃保温2小时，选取存活率为10％或10％以上的耐胃酸性能优良的菌株。
下面进一步详细说明本发明。
1、菌株的获得为了从自然界获得具有上述性质的菌株，本发明人将从自然界采集的样品用厌氧性稀释液(1980年丛文社发行，光冈知足著《肠内菌的世界》，322页，以下称为参考文献1。)，涂布到BL琼脂培养基(上述参考文献1，319页)的平板上，在37℃进行厌氧性培养。在通过上述方法得到的菌落中，双尾菌呈现特有的形态，并且通过显微镜观察发现涂布标本为革兰氏阳性。取呈现棒状、棍状或分支状菌形的菌，画线涂布到BL琼脂平板上，用与上述相同的方法反复进行厌氧性培养，得到纯粹分离的菌株。用下述的试验方法，将这些菌株首先进行发酵试验和保存过程中的存活性试验，得到具有优良性质的菌株20多株。然后进行耐胃酸性试验，获得在pH＝3.0的人工胃液中显示优良存活性的菌株。其中，将最好的菌株在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心以FERM BP-7787(委托保藏日平成13年10月31日)委托保藏。该菌株的菌学性质性质如下所示。
2、菌学性质(1)菌形(在BL琼脂培养基中于37℃厌氧性培养72小时后，进行光学显微镜观察时)大小0.3～0.8μm×4～10μm形状呈现多形性的杆菌(棍棒状、Y字状等)(2)革兰氏染色性阳性(3)菌落形态(在BL琼脂培养基中于37℃厌氧性培养72小时后)形状圆形隆起～半球形隆起周边圆滑大小1～4mm色调周边暗褐色，中心浓褐色表面光滑(4)芽孢形成阴性(5)气体产生无(6)运动性无(7)过氧化氢酶活性阴性(8)醋酸/L(+)乳酸摩尔比1.5以上(9)糖发酵性 用光冈的糖发酵性用培养基(上述参考文献1，323页)通过API 50CH系统(日本バイオメリユ-株式会社)实施。
L-阿拉伯糖、D-木糖、半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、松三糖、棉子糖、D-松二糖为阳性，α-甲基糖苷为滞后阳性。
甘油、赤藓糖醇、D-阿拉伯糖、核糖、L-木糖、核糖醇、甲基木糖苷(メチリキシロシド)、L-山梨糖、鼠李糖、卫矛醇、肌醇、甘露糖醇、双脱水山梨糖醇、α-甘露糖苷、N-乙酰基葡糖胺、扁桃苷(アミグタリン)、熊果叶苷、七叶苷、水杨苷、纤维二糖、海藻糖、旋复花粉、淀粉、糖原、木糖醇、龙胆二糖、D-来苏糖、D-塔格糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-阿拉伯糖醇、L-阿拉伯糖醇、葡萄糖酸盐(酯)、2-葡糖酮酸盐(酯)、5-葡糖酮酸盐(酯)为阴性。
(10)DNA的同源性分别抽取长双歧杆菌ATCC 15707T和动物双歧杆菌(Bididobacteriumanimalis)R 101-8T(可以通过理化学研究所微生物系统保存设备以JCM1190T获得)的染色体DNA，与从长双歧杆菌FERM BP-7787抽取的染色体DNA通过微型板杂交法进行杂交。从长双歧杆菌FERM BP-7787抽取的染色体DNA对从长双歧杆菌ATCC 15707抽取的染色体DNA显示出95％的同源性，与动物双歧杆菌R 101-8T的同源性为22％。
上述本发明的长双歧杆菌FERM BP-7787与Bergey’s Manual ofSystematic Bacteriology，Vol.2，1986的分类基准中所示的双尾菌一致。另外，通过糖发酵性、性状以及DNA的同源性结果鉴定为长双歧杆菌。
3、含乳培养基中的发酵性将混合了0.2％酵母提取物(Difco公司)的11％还原脱脂奶粉培养基在115℃灭菌15分钟，将用该培养基进行两次传代培养的长双歧杆菌FERMBP-7787以及对照株(表1中记录的本发明菌株以外的菌株)的起始菌(スタ-タ-)接种5％，在37℃培养6小时。测定培养液的pH值和菌数。菌数测定在RCA(Reinforced Clostridial Agar，Oxoid公司)平板上进行。在本培养条件下，与对照株相比，长双歧杆菌FERM BP-7787能够在短时间内使含乳培养基凝固，双尾菌数也是最高的(表1)。
表1各菌株在含乳培养基中的发酵性

长双歧杆菌FERM P-6548引用文献1记载的菌株长双歧杆菌ATCC55817引用文献2记载的菌株4、耐酸性(1)单独发酵将混合了0.2％酵母提取物(Difco公司)的11％还原脱脂奶粉培养基装入试管，在115℃灭菌15分钟，将长双歧杆菌FERM BP-7787以及对照株(表2中记录的本发明菌株以外的菌株)的起始菌(スタ-タ-)接种5％，在37℃发酵至pH变成4.3～4.4，然后骤冷，在10℃进行保存试验。在RCA琼脂平板上测定骤冷后立即保存1周后和2周后的菌数，算出各期间保存后的存活率。
长双歧杆菌FERM BP-7787在发酵至pH＝4.4的培养基中，即使在10℃保存2周，基本上都存活，显示出非常高的存活性，其比对照株长双歧杆菌FERM P-6548更优良(表2)。已知具有耐胃酸性能的长双歧杆菌ATCC55817和其它对照株在保存2周后几乎内没有存活。
表2各菌株在含乳培养基中的发酵性

长双歧杆菌FERM P-6548引用文献1记载的菌株长双歧杆菌ATCC55817引用文献2记载的菌株(2)混合发酵将与后述实施例1组成相同的由乳脂肪3.0％(W/W)、无脂乳固体成分9％(W/W)组成的鲜乳基质加热到70℃，在15MPa的压力下匀化，在90℃杀菌10分钟，冷却至40℃。在该杀菌后的基质上，接种通过后述实施例1记载的方法制备的唾液链球菌唾液亚种(Streptococcus thermophilus)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lacobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)的混合培养物0.6％。然后，分别接种5％下述长双歧杆菌FERM BP-7787以及对照株(表2中记录的本发明菌株以外的菌株)的起始菌(スタ-タ-)，所述长双歧杆菌和对照菌用混合了0.2％酵母提取物(Difco公司)的11％还原脱脂奶粉培养基在37℃培养到pH变成4.3～4.4。然后分注到试管中，在37℃培养5小时，骤冷后在10℃进行保存试验。在RCA琼脂平板上测定骤冷后立即保存1周后和2周后的菌数，算出保存中的存活率。长双歧杆菌FERMBP-7787在发酵至pH为4.6或4.6以下的发酵乳中，即使在10℃保存2周仍有50％或50％以上存活，与已知具有耐胃酸性能的长双歧杆菌ATCC55817及其它对照菌株相比，耐酸性优良(表3)。
表3各菌株在含乳培养基中的存活性

长双歧杆菌FERM P-6548引用文献1记载的菌株长双歧杆菌ATCC55817引用文献2记载的菌株
5、耐胃酸性按照下述方法进行耐胃酸性试验。即，往过滤灭菌过的并且用1M盐酸调至pH＝3.0的人工胃液[将0.2％NaCl、0.35％胃蛋白酶(1∶50000)用精制水溶解]9.9ml中，加入下述长双歧杆菌FERM BP-7787和对照株的菌体悬浮液0.1ml，所述长双歧杆菌和对照株用Briggs liver broth(光冈知足，《(临床检查)》，18卷，1163～1172页，1974年)进行2次活化培养(37℃，24小时)，用生理盐水洗涤一次。在37℃接触2小时后，将1ml加入pH＝6.5的磷酸缓冲液(67mM)9ml中停止处理。然后，用RCA琼脂平板计数初始菌数和与人工胃液接触后的菌数，算出存活率。通过本法，本发明的FERMBP-7787株与ATCC55817株显示出相同水平的高耐胃酸性能，其它菌株，包括具有相当耐酸性的FERM P-6548，几乎不显示耐性(表4)。
表4各菌株的人工胃液耐性

长双歧杆菌FERM P-6548引用文献1记载的菌株长双歧杆菌ATCC55817引用文献2记载的菌株如上所述，本发明的长双歧杆菌FERM BP-7787菌株在含乳培养基中具有很强的发酵性，在酸性条件下保存时具有优良的存活性。进一步地，从对人工胃液显示强耐性可知，其具有在长双歧杆菌基准株或至今公知的菌株上未曾发现过的性质。相反，已知具有耐胃酸性能的ATCC55817在含乳培养基中的发酵性、在酸性条件下保存的存活性极差，与本发明的长双歧杆菌FERM BP-7787菌株相比明显很差。
本发明的长双歧杆菌是从自然界中分离的长双歧杆菌中选出的具有发酵性、耐酸性和耐胃酸性能的菌株。因此，本发明的长双歧杆菌可以在短时间内迅速培养，培养物或其加工物在保存中的活菌数下降少，可以用于宽范围pH值的饮料和食品。
另外，通过试验也证明了本发明的长双歧杆菌在冷冻或冷冻干燥时的存活率优良，因此，可以菌粉的形态使用。进一步地，本发明的长双歧杆菌具有耐胃酸性能，被摄取到人或动物体内时，可以高几率地活着到达消化道(肠道)发挥生理功能，因此在产业上极为有用。例如，不用说在自古已知的作为人或动物药物的整肠剂中的应用，也可以添加或混合到粉末状食品、饲料或者液体状或半固体状的饲料、食品中。
下面通过实施例进一步详细说明本发明。
实施例1在由酵母提取物0.2％(W/W)、脱脂奶粉11％(W/W)组成的、在90℃进行过30分钟杀菌的培养基1000ml上，接种本发明的长双歧杆菌FERMBP-7787，在37℃培养6小时。另一方面，将10％(W/W)还原脱脂乳培养基1500ml在90℃灭菌30分钟，接种唾液链球菌唾液亚种(ハンセン公司)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(ハンセン公司)的混合培养物50ml，在42℃培养5小时。
另外将由乳脂肪3.0％(W/W)、无脂乳固体成分9.0％(W/W)组成的鲜乳50L加热至70℃，在15MPa的压力下匀化，在90℃杀菌10分钟后冷却至40℃。在该杀菌过的基质上，接种进行过上述前培养的本发明长双歧杆菌FERM BP-7787菌株的培养物750m1，和，唾液链球菌唾液亚种和德氏乳杆菌保加利亚亚种的混合培养物300ml，填充到500ml的容器中，密封，在37℃培养5小时，立即冷却。所得的发酵乳乳酸酸度为0.81％，pH＝4.55，含有长双歧杆菌FERM BP-7787菌株2.33×108/ml、唾液链球菌唾液亚种6.8×108/ml、德氏乳杆菌保加利亚亚种3.4×107/ml。将此发酵乳在10℃保存14天后，长双歧杆菌FERM BP-7787菌数为1.5×108/ml，存活率为65％。
实施例2将在37℃进行前培养16小时的本发明长双歧杆菌FERM BP-7787菌株的种子培养物500ml接种到具有下述组成的培养基10L上肉提取物50g、酵母提取物100g、蛋白胨100g、乳糖200g、K2HPO450g、KH2PO410g、胱氨酸4g和水9.5L。在37℃培养16小时，然后把上述培养液全部(10.5L)接种到在90℃杀菌30分钟、组成与上述培养基相同的培养基200L上，在37℃培养16小时。培养后的活菌数为3.0×109/ml。
然后，通过シヤ-プレス型离心分离机(15000rpm)收集菌体，再悬浮到与培养基等量的、在90℃杀菌30分钟的生理盐水中，与上述方法同样离心分离，再次收集菌体。将所得的菌体悬浮于由脱脂奶粉10％(W/W)、蔗糖1％(W/W)、谷氨酸钠1％(W/W)组成的溶液(90℃杀菌30分钟)200L中，按照常规方法冷冻干燥，得到含本菌1.6×1010/g的粉末约2.2kg。
实施例3往干燥杀菌后的淀粉14kg和乳糖6kg中，加入实施例2所得的含有本发明长双歧杆菌FERM BP-7787菌株的粉末20g，均匀混合，得到含本菌1.0×108/g的粉末整肠剂约20kg。
实施例4往由酵母提取物0.2％(W/W)、脱脂奶粉11％(W/W)组成的、在90℃杀菌30分钟后的培养基1000ml中，接种本发明的长双歧杆菌FERMBP-7787菌株，在37℃培养6小时。另一方面，将加入酵母提取物0.6％(W/W)的10％(W/W)的还原脱脂乳培养基1000ml在90℃杀菌30分钟，接种乳酸乳球菌乳脂亚种(Streptococcus cremoris，ハンセン公司)的培养物30ml，在37℃培养16小时。
另外将由乳脂肪0.5％(W/W)、无脂乳固体成分8.5％(W/W)、蔗糖6.5％组成的鲜乳50L加热至70℃，在15MPa的压力下匀化处理，在90℃杀菌10分钟，冷却到33℃。在该杀菌后的基质上，接种进行过上述前培养的本发明长双歧杆菌FERM BP-7787菌株的培养物750ml和进行过上述前培养的乳酸乳球菌乳脂亚种的培养物500ml，在30℃培养16小时，然后立即搅拌冷却。将冷却发酵乳在15MPa的压力下匀化处理，填充到200ml容量的玻璃容器中，密封，得到饮用酸乳。
所得的发酵乳乳酸酸度为0.70％，pH＝4.55，含有长双歧杆菌FERMBP-7787菌株1.5×108/ml、乳酸乳球菌乳脂亚种9.8×108/ml。将此发酵乳在10℃保存14天后，长双歧杆菌FERM BP-7787菌数为8.5×107/ml，存活率为57％。
产业适用性本发明的长双歧杆菌FERM BP-7787菌株在乳性成分培养基中具有高发酵性和存活性、并且对人工胃液具有很强的耐性。因此，可以在短时间内迅速配制本发明菌的培养物，培养物或其加工物在保存过程中活菌数的下降少，可以用于宽pH范围的饮料和食品。进一步地，本发明菌具有耐胃酸性能，在被摄取到人或动物体内时，高几率地活着到达消化道(肠道)发挥生理功能，在产业上极为有用。


本发明提供具有下述菌学性质的长双歧杆菌(Bidifobacterium longum)和含有该长双歧杆菌的菌粉以及饮料和食品(1)使含乳培养基的pH达到4.6或4.6以下的发酵性；(2)在含乳培养基达到pH为4.4～4.6时骤冷，在10℃保持2小时后的存活率为50％或50％以上；(3)在pH＝3.0的人工胃液中于37℃保温2小时后的存活率为10％或10％以上的耐胃酸性能。