专利名称：一种人羊水干细胞系的建立方法干细胞具有自我更新能力，在一定的诱导条件下，可分化为具有特殊功能的细胞。 在过去十几年间，分离和培养胚胎干细胞(ES细胞)的成功为基础研究和细胞移植治疗提 供了新的机遇。然而社会及伦理问题制约了 ES细胞的研究及应用。此外，体外培养ES细胞面临 着极大的技术挑战，ES细胞的培养需要饲养层及昂贵的细胞因子，且在体外培养过程中常 会发生基因组突变。更重要的是ES细胞体外移植后可能形成肿瘤，目前尚无解决办法。而 骨髓间充质干细胞(MSC)等成体干细胞分离培养后数量有限，体外增殖分化能力有待进一 步证明。因此，很多研究者都在尝试寻找新的干细胞来源，试图建立一种干细胞系，既具有 增殖速度快，体外分化能力强的特点，又摆脱伦理道德问题。人的羊水应用于产前诊断，已 经有七十多年的历史。2003年，Prusa等在羊水中发现Oct-4阳性细胞，提示羊水中可能存 在多能干细胞(Prusa AR,Marton E, Rosner M, et al. Oct-4-expressing cells in human amniotic fluid -.a new source for stem cellresearch ？ Hum Reprod, 2003,18 (7) 1489-1493)。2006年11月举行的美国心脏协会会议上，瑞士苏黎世大学的Dr。Simon宣布， 他们首次用取自羊水的干细胞培育出人的心脏瓣膜。2007年，Paolo等报道，在人的孕中 期羊水中分离得到具有ES样干细胞特性的多能细胞，将其命名为人羊水源干细胞(human AmnioticFluid Stem Cell, hAFS) [Paolo DC，2007。这种细胞可以在体外长期培养(超 过2年)并保持未分化状态，表达ES细胞和成体干细胞标记基因，体外诱导可分化为包括 外胚层、中胚层和内胚层等三个胚层的各种细胞，从而表明其具有多能性。像ES细胞一样， AFS细胞可在体外存活几年，而普通的体细胞在体外只会存活一段时间，随后便会死亡。AFS 细胞表达Oct-4，且表达部分ES细胞和成体干细胞标记，因此，研究人员认为，AFS细胞处于 ES细胞和成体干细胞的中间状态。AFS细胞的优点表现为，与成体干细胞相比容易获取，具 有较强的分化潜能；于胚胎干细胞相比AFS细胞的免疫原性较低，更适用于细胞移植等研 究。AFS细胞可为组织工程研究提供新的种子细胞来源，深入研究AFS细胞的分化机制，建 立和完善AFS细胞的体外培养体系，具有重要的理论意义和临床应用价值。目前，国外学者多采用免疫磁珠分选法筛选羊水干细胞，对细胞活性有一定影响， 且费用较高(Paolo DC, Georg BJ, Anthony A, et al. Isolation of amnioticstem cell lines with potential for therapy [J]. Nat Biotechnol，2007，25 (1) : 100 106.)。国内 学者多采用简单的直接原代贴壁方法(刘慧，刘大庆，闫志风，李宝伟，管利东，岳文，吕阳， 裴雪涛，李亚里.孕足月羊水干细胞的分离培养[J].中国组织工程研究与临床康复，2009， 13(14) =2733-2737.)，或机械挑选克隆的方法分离羊水细胞(李现铎，耿红全，朱哲，等孕 中期羊水来源胎儿间充质干细胞的分离与培养及其生物学特性研究。中华医学杂志，2006，86 =4812483) 0但分选出的细胞群里含有羊水特异性细胞、上皮样细胞等其他类型的细胞， 其纯度很低，且细胞的增殖能力有限，多次传代后数量减少，体外仅能扩增传代10代左右。 目前国内尚没有人建立稳定的羊水干细胞系。
为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种快速、有效、安全、 可实现人羊水干细胞体外长期扩增、可为组织工程研究提供新的种子细胞来源以及有望作 为种子细胞进行临床应用的人羊水干细胞系的建立方法。本发明的技术解决方案是本发明提供了一种人羊水干细胞系的建立方法，其特 殊之处在于该方法包括以下步骤1)羊水干细胞的原代分离培养；2)将分离培养的原代羊水干细胞进行机械分离纯化；3)将分离纯化后的羊水干细胞建立羊水干细胞单克隆，后进行扩大培养，建立羊 水干细胞系，其具体实现方式是3. 1)取初步纯化的细胞制成悬液，台盼蓝染色后计数测定活细胞浓度；3. 2)用培养液将细胞悬液稀释成不同浓度，并于37°C、5% C02培养箱中培养；培 养基成份为α -MEM+15% FBS+2%谷胺酰胺+1%青链霉素；3. 3)待细胞贴壁后，显微镜下观察挑选并标记只含一个细胞的孔，继续培养；3.4)培养期间，根据培养液中pH值的变化情况判断是否有明显单克隆出现。若 有，则用0. 05%胰蛋白酶+0. 02% EDTA消化单克隆细胞，分别进行扩大培养；若否，则放弃 培养，不再继续换液；3. 5)待细胞达到70% -90%融合时，传至培养皿中继续扩增培养，此时得到的细 胞经连续传代40代以上，即建成羊水干细胞系。上述步骤1)的具体实现方式是1. 1)从医院妇产科收集孕中期及孕晚期羊水，4°C保存带回备用；1. 2)用200目滤纱过滤，以除去较大的组织碎片，然后lOOOr/min，离心6min，弃上 清，收集细胞；1.3)将步骤2)中所收集的细胞加入含有双抗的PBS (_)溶液，混勻，置37°C处 理lOmin，然后离心，收集细胞，重复用双抗PBS(-)溶液处理3次。上述步骤2)的具体实现方式是2. 1)将分离出的羊水细胞加入原代羊水细胞培养液，置于37°C、5% C02培养箱 中，并记录原代细胞贴壁时间及贴壁细胞数量；2.2)培养4 12d后，在倒置显微镜下观察并绘制所需细胞生长情况；2. 3)用细胞刮刀在生长有上皮样细胞类型的区域进行反复推刮，使细胞脱落，并 小心不要刮到标记的区域；2. 4)用双抗PBS (-)溶液冲洗2 3遍，补加培养液继续培养；2. 5)当再次观察到培养皿中有不需要的细胞生长时，仍用上述方法处理，如此反 复2 3次，细胞可得到初步纯化；2. 6)连续培养5 8代后，上皮样细胞逐渐减少消失，90%以上表现为成纤维样细胞。上述步骤2. 2)中，是培养4 5d后，在倒置显微镜下观察并绘制所需细胞生长情 况。上述原代羊水细胞培养液是含有a -MEM+10% FBS+20% ChangMedium+1 %谷胺酰 胺+1%青链霉素的培养液。上述步骤2. 6)中AFS细胞培养液的成份为a -MEM+10% FBS+1 %谷胺酰胺+1 %青链毒素。上述步骤3. 1)中，是取第一至十代初步纯化的细胞制成悬液。上述步骤3. 1)中，是取第六代初步纯化的细胞制成悬液。上述步骤3. 1)中，是取第六代初步纯化的对数生长期的细胞制成悬液。本发明的优点是1、快速、有效、安全。本发明采用采用原代贴壁法和机械分离法，分离纯化了人羊 水干细胞，并建立一种快速、有效、安全的人羊水干细胞分离方法。2、可实现了人羊水干细胞体外长期扩增。依照本发明所提供的人羊水干细胞系的 建立方法，可利用不同浓度FBS和KSR的培养体系，不需滋养层细胞，实现了人羊水干细胞 体外长期扩增，传45代冻存，经流式细胞仪分析表明，分离的hAFS细胞传至35代后核型 正常，已冻存1 1. 5xl08个种子细胞，其性能稳定，遗传性状良好。并且经免疫细胞化学、 RT-PCR和流式细胞术鉴定表明，所分离的人羊水干细胞表达HLA-ABC，弱表达HLA-DR ；表达 ES 细胞标志基因 0ct-4、hTERT、Nanog、SSEA-l、SSEA-4 和 CD117，不表达 SSEA-3 ；表达间质 细胞标志基因CD29、CD44、CD73、CD90和CD105等；不表达CD34、CD45和CD133等造血细胞 系标志基因。经碱性磷酸酶活性检测，形成的类胚体呈阳性，RT-PCR分析表明具有分化为 三胚层来源的各种细胞的潜能。3、可为组织工程研究提供新的种子细胞来源。本发明根据建立细胞系的要求按细 胞系的定义成功的建立了人羊水干细胞系，可为组织工程研究提供新的种子细胞来源，不 仅避免了胚胎干细胞的伦理争论，而且为今后干细胞研究开辟了新方向，有望作为种子细 胞进行临床应用。本发明涉及一种人羊水干细胞系的建立方法，该方法包括以下步骤1)羊水干细胞的原代分离培养；2)将分离培养的原代羊水干细胞进行分离纯化；3)将分离得到的羊水干细胞经过单克隆筛选和扩增培养，建立羊水干细胞系。本发明提供了一种快速、有效、安全、可实现人羊水干细胞体外长期扩增、可为组织工程研究提供新的种子细胞来源以及有望作为种子细胞进行临床应用的人羊水干细胞系的建立方法。